霉菌酵母单独计数的计算方法

㈠ 霉菌和酵母菌的测定还有什么方法

霉菌和酵母菌介绍及检测方法
一、霉菌和酵母菌介绍：
霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。
霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鲜美；还可利用霉菌和酵母酿酒、制酱；食品、化学、医药等工业都少不了霉菌和酵母。但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。
二、检验方法：
霉菌和酵母的计数方法，与菌落总数的测定方法基本相似。主要步骤为：将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数。对霉菌的计数，还可以采用显微镜直接镜检计数的方法。
具体检测标准参见：
GB4789.15-94，《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物检验霉菌和酵母计数》
三、说明：
1．样品的处理。为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。对大的固体食品样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎。如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。
2．样品的稀释：为了减少榈稀释倍数的误差，在连续递增稀释时，每一稀释度应更换一根吸管。在稀释过程中，为了使霉菌的孢子充分散开，需用灭菌吸管反复吹吸50次。
3．培养基的选择：在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几种选择性培养基。
马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培养基上生长良好。用PDA作平板计数时，必项加入抗菌素以抑制细菌。
孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌落的计数。
高盐察氏培养基：粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良好，它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作用。
4．倾注培养。每个样品应选择3个适宜的稀释度，每个稀释度倾注2个平皿。培养基熔化后冷却至45℃，立即倾注并旋转混匀，先向一个方向旋转，再转向相反方向，充分混合均匀。培养基凝固后，把平皿翻过来放温箱培养。大多数霉菌和酵母在25－30℃的情况下生长良好，因此培养温度25~28℃。培养3d后开始观察菌落生长情况，共培养5d观察记录结果。
5．菌落计数及报告：选取菌落数10~150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告。固体检样以g为单位报告，液体检样以mL 单位报告。关于稀释倍数的选择可参考细菌菌落总数测定。
6．霉菌直接镜检计数法：对霉菌计数，可以采用直接镜检的方法进行计数。
在显微镜下，霉菌菌丝具有如下特征：
平行壁：霉菌菌丝呈管状，多数情况下，整个菌丝的直径是一致的。因此在显微镜下菌丝壁看起来象两条平行的线。这是区别霉菌菌丝和其他纤维时最有用的特征之一。
横隔：许多霉菌的菌丝具有横隔，毛霉、根霉等少数霉菌的菌丝没有横隔。
菌丝内呈粒状：薄壁、呈管状的菌丝含有原生质，在高倍显微镜下透过细胞壁可见其呈粒状或点状。
分枝：如菌丝不太短，则多数呈分枝状，分枝与主干的直径几乎相同，有分枝是鉴定霉功得出可靠的特征之一。
菌丝的顶端：常呈钝圆形。无折射现象。
凡有以上特征之一的丝状均可判定为霉菌菌丝。
观察视野中有无菌丝，凡符合下列情况之一者为阳性视野。
一根菌丝长度超过视野直径1/6；
一根菌丝长度加上分枝的长度超过视野直径1/6；
两根菌丝总长度超过视野直径1/6；
三根菌丝总长度超过视野直径1/6；
一丛菌丝可视为一个菌丝，所有菌丝（包括分枝）总长度超过视野直径1/6。
根据对所有视野的观察结果，计算阳性视野所占比例，并以阳性视野百分数（%）报告结果。计算公式：
每件样品阳性视野（%）=（阳性视野数 / 观察视野数）×100

㈡ 怎样进行霉菌和酵母菌数测定

1、霉菌为菌丝体，无法直接计数，通常的计数方法是：在培养基上培养后，计数菌落数。
2、酵母菌是单细胞真菌，可以显微镜下用计数板计数；也可以培养后，计数菌落数。

㈢ 酵母菌数量抽样检测法的计数方法是什么

血球计数板计数法(人教版必修三68页)

(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数.

(2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可.

(3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖专用的厚玻片.

(4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内.

(5)计数时,如果使用16格×25格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数.如果规格为25格×16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数.

(6)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞).

(7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数.

3.计算公式

(1)16格×25格的血球计数板计算公式:

酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100×400×104×稀释倍数

(2)25格x16格的血球计数板计算公式:

酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80×400×104×稀释倍数

㈣ 食品霉菌和酵母分别计数

霉菌和酵母计数 1主题内容与适用范围
本标准规定了各类粮食、食品和饮料霉菌和酵母菌计数的检验方法。
本标准适用于各类粮食、食品和饮料中霉菌和酵母菌的计数。
2引用标准
GB 4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
3设备和材料
3.1温箱：25～28℃。
3.2振荡器。
3.3天平。
3.4显微镜。
3.5玻塞三角瓶：300mL。
3.6试管：15mm×150mm。
3.7平皿：直径9cm。
3.8吸管：1mL及10mL。
3.9酒精灯。
3.10载物玻片。
3.11盖玻片。
3.12广口瓶。
3.13牛皮纸袋：121℃灭菌20min。
3.14金属勺、刀等。
3.15试管架。
3.16接种针。
3.17橡皮乳头。
4培养基和试剂
4.1马铃薯－葡萄糖琼脂培养基，附加抗菌素，按GB 4789.28中4.79规定。
4.2孟加拉红培养基：按GB 4789.28中4.81规定。
4.3高盐察氏培养基：按GB 4789.28中4.78规定。
4.4灭菌蒸馏水。
4.5乙醇。
5检验程序
检验程序如下：
（图略）
6操作步骤
6.1采样：取样时须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属刀或勺等。在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品。样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。
粮食(包括粮库贮粮，粮店或家庭小量存粮)样品的采集，可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，一般可分三层五点，或分层随机采取不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检。小量存粮可使用金属小勺采取上、中、下各部位的混合样品。
海运进口粮的采样：每一船仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓盛粮超过10000t，则应加采一个样品。必要时采取有疑问的样品送检。
谷物加工制品(包括熟饭、糕点、面包等)、发酵食品、乳及乳制品以及其他液体食品，用灭菌工具采集可疑霉变食品250g，装入灭菌容器内送检。
6.2以无菌操作称取检样25g(或25mL)，放人含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。
6.3用灭菌吸管吸取1∶10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。
6.4取1mL1∶10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为1∶100稀释液。
6.5按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1mL灭菌吸管，根据对样品污染情况的估计，选择3个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿，然后将凉至45℃左右的培养基注入平皿中，待琼脂凝固后，倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。
6.6计算方法：通常选择菌落数在10～150之间的平皿进行计数，同稀释度的2个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克(或毫升)检样中所含霉菌和酵母数。
6.7报告：每克(或毫升)食品所含霉菌和酵母数以个/g(个/mL)表示。

附录A
霉菌直接镜检计数法
(补充件)

常用的为郝氏霉菌计测法，本方法适用于番茄酱罐头。
A1设备和材料
A1.1烧杯。
A1.2玻璃棒。
A1.3折光仪。
A1.4显微镜。
A1.5郝氏计测玻片：是一特制的、具有标准计测室的玻片。
A1.6盖玻片。
A1.7测微器：具标准刻度的玻片。
A2操作步骤
A2.1检样的制备：取定量检样，加蒸馏水稀释至折光指数为1.3447～1.3460(即浓度为7.9%～8.8%)，备用。
A2.2显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率90～125倍调节标准视野，使其直径为1.382mm。
A2.3涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀的摊布于计测室，以备观察。
A2.4观测：将制好之载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一检样应观察50个视野，最好同一检样两人进行观察。
A2.5结果与计算：在标准视野下，发现有霉菌菌丝其长度超过标准视野(1.382mm)的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6(即测微器的一格)时即为阳性(＋)，否则为阴性(－)，按100个视野计，其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。

㈤ 食品中霉菌和酵母菌计数实验只有一个平板在10-150之间如何计数

那有可能你做的过程中这个平板沾染了霉菌，因为即便是同一个浓度的也是两个平板，还有平行实验，也就是两个样品，空白有没有霉菌？

㈥ 酵母菌总数计算公式是什么

血球计数板的使用
以计数酵母菌为例

3.计算公式
(1)16格×25格的血球计数板计算公式:
酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100×400×104×稀释倍数
(2)25格x16格的血球计数板计算公式:
酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80×400×104×稀释倍数

㈦ 霉菌酵母计数、菌落总数实验

是包括的。菌落计数，指的是将样品接种到培养基中之后，经过一段时间一定条件的培养，所生长出来的菌落总数。在这里并没有定义必须是细菌的菌落还是其他微生物产生的菌落，因此霉菌或者酵母菌的菌落也应该计算在内。

㈧ 计算酵母菌数量可用什么方法

第一：你可以用显微镜观察，血球计数法
方法操作：
一、2mm×2mm方格的计数
2mm×2mm表示计数室的边长，即一个大方格的边长。由于计数室厚度为0.1mm，所以计数区的总体积为0.4mm3。
计数室通常也有两种规格：一种是16×25型，即大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是25×16型，即大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。

1．16×25型的计数公式为：

酵母细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/ 100 ×100×10000×稀释倍数
2．25×16型的计数公式为：
酵母细胞个数／1mL ＝80个小方格细胞总数/ 80 ×100×10000×稀释倍数

二、1mm×1mm方格的计数
1．16×25型的计数公式：
酵母细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/ 100 ×400×10000×稀释倍数
2．25×16型的计数公式：
酵母细胞个数／1mL＝80个小方格细胞总数/ 80 ×400×10000×稀释倍数

第二：选择的稀释度，做平板计数
选择适宜的稀释度，吸取1mL加入平板，注入孟加拉红培养基，29摄氏度培养5-7天，计数。
酵母总数/mL=平板数X稀释倍数

㈨ 中国药典微生物限度检查法的细菌、霉菌及酵母菌计数

细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。
菌种
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
大肠埃希菌（Escherichia coli[CMCC ( B ) 44l02]
金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ]
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ) [ CMCC ( B ) 63501 ]
白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC ( F ) 98001〕
黑曲霉（Aspergillus niger) [ CMCC ( F ) 98003 ]
菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养24～48小时。上述培养物用0 . 9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5～7天，加人3～5ml含0.05 % ( ml /ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05 % ( ml / ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8 ℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8 ℃，在验证过的贮存期内使用。
适用性检查
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35 ℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28 ℃培养72小时，计数；取白色念珠菌50～100cfu，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基．平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28 ℃培养72小时，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
结果判定
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。 当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
菌种及菌液制备
同计数培养鉴的适用性检查。
验证方法
验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
( l )试验组平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液lml和50～100cfu试验菌，分别注人平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加人50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。
( 2 )菌液组测定所加的试验菌数。
( 3 )供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
( 4 )稀释剂对照组若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每lml供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
结果判断
在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70 %。若试验组的菌数回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70 %，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法（常见干扰物的中和剂或灭活方法见表1）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
表l 常见干扰物的中和剂或灭活方法 干扰物 可选用的中和剂或灭活方法 戊二醛 亚硫酸氢钠 酚类、乙醇、吸附物 稀释法 醛类 稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐 季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯卵磷脂、聚山梨酯 汞类制剂 亚硫酸氢钠、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐 双胍类化合物 卵磷脂 碘酒、洗必泰类 聚山梨酯 卤化物 硫代硫酸盐 乙二胺四乙酸（EDTA ) 镁或钙离子 磺胺类 对氨基苯甲酸 β-内酰胺类抗生素 β-内酰胺酶 若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。但是，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。
计数方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收率最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。
验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。