⑴ 穩轉株構建基本原理與步驟【新手入門】
細胞株的構建是生物研究中的基礎步驟。它們是從原代培養物或細胞系中，通過選擇或克隆形成法獲得，具有特殊性質或標志的細胞培養物。這些細胞可培養到約40-50代，並在整個培養過程中保持其特殊性質或標志不變。在研究中，人類腫瘤細胞在體外培養半年以上，穩定生長並連續傳代的可被視為連續性株或系。
構建細胞株的關鍵步驟之一是將外源DNA克隆到具有抗性的載體上，載體隨後被轉染到宿主細胞並整合至宿主染色體中。通過載體中的抗性標志進行篩選，篩選出能穩定表達目的蛋白或沉默特定基因的細胞株。常用的真核表達載體抗性篩選標志物包括新黴素、潮黴素和嘌呤黴素。
在構建多克隆穩轉株時，熒光強度會隨時間變化，通常從感染後72小時開始加入篩選葯物，每2天更換一次液體並重新加入篩選葯物。篩選過程至少持續14天，直至觀察到100%的熒光細胞。穩定表達細胞株廣泛應用於基因功能研究、基因干擾、拷貝數控制、誘導表達系統實驗以及構建動物模型等。
慢病毒因其幾乎能感染所有細胞並在感染後整合至基因組，提供了長期穩定表達的途徑，因此常用於構建單克隆穩轉細胞株。構建流程包括篩選合適抗生素濃度、病毒滴度、慢病毒構建與包裝、慢病毒感染以及特定抗生素篩選穩轉細胞株等步驟。
穩轉株構建是一個復雜而細致的過程，涉及多平台的合作。在構建過程中，可能會遇到多種問題，如篩選失敗、整合效率低、細胞活力下降等。分享構建過程中的經驗和遇到的問題，有助於提高成功率和研究效率。歡迎討論在構建穩轉株過程中遇到的挑戰和解決方案。