細菌標本染色常用的固定方法

Ⅰ 微生物實驗中為什麼細菌在染色前需要固定

微生物實驗中細菌在染色前需要固定的原因：
一：殺死細胞，是染料易於著色。
二：使細菌附著於玻片上，不易被水沖掉。
在固定時，是要慢慢晾乾，如果得確要加快速度，可以處於酒精燈火焰上部遠處稍微烘幾下，切忌烘得玻片升溫，否則有可能會破壞細菌生命形態
細菌的革蘭氏染色與顯微觀察
一、 實驗原理
革蘭氏染色原理：細菌對於革蘭氏染色的不同反應，是由於它們細胞壁的成分和結構不同造成的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網狀結，當用乙醇處理時，由於脫水而引發網狀結構的孔徑變小，通透性降低，從而使結晶紫-碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內，經脫色和復染後仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌的細胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當脫色處理時，類脂質被乙醇(或丙酮)溶解，細胞壁透性增大，使結晶紫-碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染後，細胞被染上復染劑的紅色。 顯微鏡成像原理：現代普通光學顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統來放大成像，故又常 被稱為復式顯微鏡。顯微鏡的光學系統中，物鏡的性能最為關鍵，油鏡的放大倍數最大，對微生物學研究最為重要。在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油主要是為了增加照明亮度和增加顯微鏡的解析度。以油代替空氣作為光的傳播介質，減少光線的折射或全反射，使觀察到的像更加清晰。
二、 實驗器材
1. 菌落：
大腸桿菌24h營養瓊脂斜面培養物、
金黃色葡萄球菌約24h營養瓊脂斜面培養物、 枯草芽孢桿菌12～18h營養瓊脂斜面培養物。
2. 溶液或試劑：
蒸餾水、碘液、結晶紫染色液、95%酒精、番紅染色液、香柏油。 3. 儀器：
顯微鏡、載玻片、接種環、酒精燈、鑷子、擦鏡紙。
三、 實驗步驟
革蘭氏染色：
1. 塗片
取出載玻片，點燃載玻片，燃盡載玻片上的酒精和滅菌，在中間輕輕點一小滴蒸餾水，用接種環在試管的斜面培養基上，輕輕挑取少量菌體，整個過程試管口都要處在酒精燈的上方，而且速度要快，以防污染培養基。然後在載玻片的小水滴以轉圈的動作塗片，待水滴混濁後停住，等其乾燥、固定。
2. 初染
滴加結晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)於菌落上，染色1～2min ，傾去染色液，有細水從載玻片上方向下沖洗，至洗出液為無色，將載玻片上水甩凈。
3. 媒染
滴加碘液沖去殘水，並覆蓋約1min，水洗。
4. 脫色
將載玻片上面的水甩凈，將載玻片傾斜，在白色背景下，用滴管加95%的酒精脫色，直至流出的酒精剛好不出現藍色，立即用水沖凈酒精，將載玻片上水甩凈。
5. 復染
用番紅液復染約1～2min，水洗，然後再吸水紙吸干
6. 鏡檢：

在低倍鏡下尋找要觀察的細菌菌落（在不停地移動載玻片，若感覺到有紅色陰影，立刻停止，調整倍數，若不是菌落，繼續找），將鏡筒升高，然後轉換到油鏡。在樣品區域加滴香柏油，用粗調節器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中並幾乎與標本相接。將聚光器升至最高位置並開足光圈，用粗調節器將鏡筒徐徐上升，直至視野中出現物像並用細調節器使其清晰准焦為止。

Ⅱ 常見的細菌染色方法

常見的細菌染色方法有三種：
1、革蘭氏染色：
革蘭氏染色是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法。細菌先經鹼性染料結晶紫染色，而後經碘液進行媒染，之後用酒精脫色，在一定條件下有的細菌媒染後的顏色不會脫去，有的可以被脫去，前者叫做革蘭氏陽性菌，後者為革蘭氏陰性菌。
2、莢膜染色：
一般細菌的莢膜與染色劑的親和性低，但莢膜通透性高，因此染料可以透過莢膜使菌體著色。一般採用負染色方法使背景和菌體之間形成一透明區，將菌體襯托出來便於觀察分辨。
3、簡單染色：
不同細菌或者由於觀察者所側重觀察的內容不同，所以使用的染料也有差異，但是簡單染色的方法是一樣的。先按照上述的製片方法製片，製成需要觀察的玻片後，使用相對應的染料滴加到玻片上的菌膜區域，以覆蓋菌膜為准。

Ⅲ 革蘭氏染色的步驟和原理

原理：革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類，是細菌學上最常用的鑒別染色法。該染色法之所以能將細菌分為G+菌和G-菌，是因為一般認為革蘭氏染色是基於細菌細胞壁特殊化學組分進行染色的。

步驟：

(一)塗片固定

在干凈的載玻片中央滴加一滴蒸餾水，用接種環進行無菌操作，挑取培養物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成菌懸液並塗布成直徑約1cm的薄層。

(二)染色

在固定過的塗片菌膜上滴加草酸銨結晶紫染液，染色液應完全覆蓋整個菌膜，染色1min。

(三)水洗

染色到一定的時間，拿住玻片使之成450角，用細小的水流把多餘的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。

(四)媒染

加碘液覆蓋塗面染1 min。在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性的化合物，可增加染料和細菌的親和力。

(五)水洗，用吸水紙吸去水分

用細小的水流緩慢沖洗塗片上的染色液，用吸水紙吸干。

(六)脫色

加95%酒精數滴，並輕輕搖動進行脫色， 20 s~30 s後再進行水洗，吸去水分。

(七)復染

蕃紅染色液染色10 s後， 自來水沖洗。

(八)乾燥，鏡檢

染色的結果，革蘭氏正反應菌體都呈紫色，負反應菌體都呈紅色。

(3)細菌標本染色常用的固定方法擴展閱讀

標本乾燥後即進行固定，固定的目的有三個：

(1)殺死微生物，固定細胞結構。

(2)保證菌體能更牢固的粘附在載玻片上，防止標本水洗時被水沖洗掉。

(3)改變染料對細胞的通透性，因為死的原生質比活的原生質易於染色。

Ⅳ 給細菌染色的方法都有幾種，怎麼操作，都用復紅染色嗎麻煩一一講來，詳細點，本人初學者.

細菌染色分為活菌染色跟死菌染色兩種。其中死菌染色分為正染色跟負染色。正染色又包括普通染色與特殊染色兩種。普通染色有簡單染色法、革蘭氏染色法和抗酸染色法；特殊染色分為芽孢染色法、莢膜染色法和細胞壁染色法。一般都只用革蘭氏染色法跟抗酸染色法。

革蘭氏染色法(Gram's stain)是最常用的細菌染色法。細菌經結晶紫初染染成藍色。革蘭氏染色陽性菌（G+）細胞壁肽聚糖層數多，且肽聚糖為空間網狀結構，再經乙醇脫水，網狀結構更為緻密，染料復合物不易從細胞內漏出，仍為藍色。而革蘭氏染色陰性菌（G-）細胞壁脂類含量多，肽聚糖層數少，且肽聚糖為平面片層結構，易被乙醇溶解，使細胞壁通透性增高，結合的染料復合物容易泄漏，細菌被脫色為無色，再經石炭酸復紅稀釋液復染成紅色。
①將結晶紫染液加於塗膜上，染色（初染）1min。②水洗後加蘆戈氏碘液處理(媒染)1min。③水洗後用95％酒精脫色，脫色時頻頻搖動玻片，直至流下的液體無色為止(約需0.5min)。④水洗後加石炭酸復紅稀釋液染色(復染)0.5min。⑤水洗，用濾紙輕輕吸干，待標本充分乾燥後進行鏡檢。染色過程中，水洗要用自來水的細流徐徐沖洗，沖洗塗膜的背面，勿使強水流直接沖到塗膜上。

抗酸染色法（acid-fast stain）對分枝桿菌屬等一般染色法不易著色的抗酸性細菌染色。要注意：1）塗片要略厚；2）加溫染色或延長染色時間，加溫時隨時補加染色液；3）分枝桿菌呈紅色（+），其他細菌和背景為藍色。
①石碳酸復紅加溫染色8~10分鍾。②3%的鹽酸酒精脫色約1~2分鍾，脫色是輕搖玻片，直到塗片顏色脫去為止。③水洗後，用鹼性美藍復染1分鍾。④再次水洗，印干。

芽孢染色法是專門給細菌芽孢染色的。要注意：1）芽孢染色用的菌種應控制菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體上為宜；2）染色加熱過程要及時補充染液，切勿讓塗片乾涸。
①孔雀綠加熱染色5分鍾。②水洗。③番紅染色2~3分鍾。④水洗，乾燥。

莢膜染色法是專門給與染料親和性弱的細菌莢膜染色。由於莢膜很薄，且含水量高（90%以上），易變形，所以製片和染色時一般不用熱固定。這個包括黑素負染色法、Leifson染色法跟Tyler染色法。
黑素負染色法：
1.制菌液：在潔凈載破片一端加一滴蒸餾水，按無菌操作要求，用接種環取少量斜面試管培養物於蒸餾水中，輕輕混勻。
2.塗片（推片法）：取另一塊邊緣光滑的載玻片，使之一端與菌液接觸，然後迅速均勻地將菌液推向玻片的另一端，使菌液塗成一薄層。置空氣中自然乾燥。注意：勿熱固定。
3.復紅染色：滴加石炭酸復紅染色液覆蓋塗布面，染色4~5分鍾後，除去多餘染液（勿用水洗）。乾燥時間不要太長，防莢膜脫水。
4.黑素染色：在玻片一端加一滴1%黑素液，再取一塊邊緣光滑的裁玻片，當邊緣與黑素液接觸後，迅速均勻地推向玻片另一端，使成一薄層。置空氣中自然乾燥。
5. 鏡檢（油鏡）：菌體呈紅色，背景呈黑色，莢膜無色。
注意事項：滴黑色素要量少；取菌要適量。
Leifson染色法
1.制備塗片同前，自然乾燥。
2.滴加Leifson』s染色液覆蓋塗布面，染色10分鍾，傾去多餘染料（勿用水洗）。
3.滴加硼酸鈉美藍染色液，染色5分鍾，輕輕用水沖洗，置空氣中自然乾燥。
4.油鏡下鏡檢，菌體呈藍色，莢膜呈紅色。
Tyler染色法
1.制備塗片同前，自然乾燥。
2.滴加結晶紫冰醋酸染色液覆蓋塗布面，染色5~7分鍾。傾去多餘染料（勿用水洗）。
3.用20%CuS04水溶液輕輕沖去染料，用吸水紙印干後，置空氣中自然乾燥。
4.油鏡下檢查，菌體呈紫色，莢膜呈淺紫色或淺藍色。

細胞壁染色法是觀察細菌細胞壁時採用的染色法。細菌細胞壁很薄，它與染料結合的能力差，不易著色，在細菌的染色過程中，一般情況染料都是通過細胞壁的滲透、擴散等作用而進入細胞，細胞壁本身並未染色，因此，欲通過染色來觀察細胞壁，必須設法使細胞壁能著色，而細胞質則不易著色，常用的方法有單寧酸法和磷鉬酸法。單寧酸和磷鉬酸都是起媒染作用，它們使細胞壁形成可著色的復合物，而使細胞質不易被著色，經結晶紫或甲基綠染色後，便可在普通光學顯微鏡下觀察到細胞壁。
根據細菌細胞在高滲溶液中或用乙醚蒸氣處理後，會產生質壁分離這一現象，經染色後也可在普通光學顯微鏡下區分細胞壁和細胞質膜。
1．單寧酸法
(1)將培養16—18小時的巨大芽孢桿菌按常法製成塗片。
(2)用5％單寧酸染5分鍾後，水洗。
(3)用0．2％結晶紫染3—5分鍾，水洗，吹乾。用油鏡觀察，細胞壁呈紫色，細胞質呈淡紫色。
2．磷鉬酸法
(1)制備濃厚的塗片，在未乾時浸入1％磷鉬酸水溶液3—5分鍾。
(2)用1％甲基綠水溶液染3—5分鍾。
(3)水洗後，吹乾，用油鏡觀察。細胞壁為綠色，細胞質無色。
3．區分細胞壁與細胞質膜
(1)乙醚蒸氣法
(a)將巨大芽孢桿菌塗布於蓋玻片上，翻轉蓋玻片使其放在乙醚蒸氣瓶的瓶口上蒸3分鍾。
(b)取下蓋玻片置Bouin氏固定液中30分鍾後取出，水洗。
(c)用硫堇染色30秒鍾。
(d)水洗，水封，置油鏡下觀察。
(2)NaCl法
(a)取一滴25％NaCl溶液於潔凈的載玻片上。
(b)挑一小環培養6小時的枯草芽孢桿菌，在25％NaCl水滴中塗布均勻，待自然乾燥。
(c)滴加0．01％結晶紫於其上，使蓋滿有菌部分，30秒鍾後水洗，乾燥，用油鏡觀察結果。

Ⅳ 液體培養基中的細菌如何染色

細菌用革蘭氏染色就可以了（某些特殊的細菌可以用其他染色法）

先用接種環在酒精燈上灼燒滅菌，然後伸入液體培養基中降溫，並挑取一環在玻片上待其自然乾燥。如果含菌量太大，可以用生理鹽水稀釋。之後在火焰上略微加熱固定，後面的就和一般的革蘭氏染色方法相同了。

Ⅵ 觀察細菌形態時為何要用染色法常用的染色法有幾類

觀察細菌形態時為何要用染色法？因為細菌細胞微小,透明,不易觀察,需染上顏色.利用單一染料對細菌進行染色,使經染色後的菌體與背景形成明顯的色差,從而能更清楚地觀察到其形態和結構.
常用的染色法有：
1．簡單染色法：簡單染色法是利用單一染料對細菌進行染色的一種方法， 一般用於觀察個體形態與細菌排列。
由於細菌在中性、鹼性或弱酸性環境中帶負電荷，所以通常採用一種鹼性染料如美藍、鹼性復紅、 結晶紫對細菌進行染色。美藍是美藍的鹽酸鹽，可解離為帶正電荷的美藍，很容易與細菌結合使菌體著色。染色後的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易於識別。
簡單染色過程：塗片→固定→染色→水洗→乾燥→鏡檢
塗片→ 固定→ 乾燥→ 水洗、吸干→鏡檢→染色 1mim
2．革蘭氏染色法：
革蘭氏染色法是由丹麥醫生 Hans Christian Gram於 1884 年創立。它是細菌學中很重要的鑒 別染色法，因為通過此法染色，可將細菌鑒別為革蘭氏陽性菌（G + ）和革蘭氏陰性菌（G － ）兩大 類。
革蘭氏染色過程：塗片→固定→結晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脫色（95% 酒精,30s）→番紅復染（30 秒）→乾燥→鏡檢
陽性菌：紫色； 陰性菌：紅色

Ⅶ 細菌學中最常用的染色方法

細菌形態學檢查方法：常用染色方法 1．美藍染色法 在已乾燥、固定好的抹片上，滴加適量的美藍染色液，經1一2分鍾，水洗，干後鏡檢，結果是細菌呈藍色。 2．稀釋石炭酸復紅染色法 染色方法同美藍染色法，結果是細菌呈紅色。 3．革蘭（Gram）氏染色法 （1）在已乾燥、固定好的抹片上，滴加草酸按結晶紫染色液，染色2一3分鍾，水洗。 （2）加革蘭氏碘液於抹片上媒染1一2分鍾，水洗。 （3）加95％酒精於抹片上脫色，約30秒至1分鍾，水洗。 （4）加稀釋石炭酸復紅（或沙黃水溶液）復染50一60秒鍾，水洗。干後鏡檢。結果是細菌染成藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，染成紅色的稱為革蘭氏陰性細菌。

Ⅷ 簡述制備細菌玻片標本的方法

細菌標本片的制備，實際上真沒這必要，我一般碘酒，或者溴酚藍滴上一染，蓋上玻片就看了。
1.抹片
（1）固體培養物：取潔凈的玻片一張，把接種環在酒精燈火焰上灼燒滅菌後，取1-2環無菌生理鹽水，放於載玻片的中央，再將接種環滅菌，冷卻後，從固體培養基上挑取菌落或菌苔少許，與水混勻，作成直徑1cm的塗面。接種環用後需要滅菌。
（2）液體培養物：可直接用滅菌接種環鉤取細菌培養液1-2環，在玻片上作直徑1cm塗面。
（3）液體病料（血液，滲出液，腹水）：取一張邊緣整齊的載玻片，用一端蘸取血液等液體材料少許，在另一張潔凈的玻片上，一45°角均勻推成一薄層的塗面。
（4）組織病料：以無菌剪刀、鑷子剪去被檢組織一小塊，以其新鮮切面在玻片上做3-5個壓印或塗抹成適當大小的一薄層。
無論何種方法，切忌塗抹太厚，否則不利於染色和觀察
2.乾燥
塗片應在室溫下自然乾燥，必要時將塗片塗面向上，置於火焰高處微加熱乾燥。
3.固定
（1）火焰固定。是常用的方法，將乾燥好的抹片塗面向上，在火焰上來回通過數次（4-6次），以手背觸及玻片微燙手為宜。
（2）化學固定。有的血片，組織觸片用姬姆薩染色時，要用甲醇固定3-5min
二、常用的細菌染色法
1.美藍染色法：在經火焰固定的塗片上，滴加適量美蘭染色液覆蓋塗面，染色2-3min，水洗，晾乾或吸水紙輕壓吸干鏡檢，結果，菌體呈藍色
2.革蘭氏染色法。
（1）在固定好的抹片上，滴加草酸銨結晶紫染色液，染1-3min，水洗
（2）加革蘭氏碘液媒染，作用1-2min，水洗
（3）加95%酒精脫色約30s至1min，水洗
（4）加稀釋石碳酸復紅或沙黃水溶液復染30s左右，水洗，吸干後鏡檢
3.瑞氏染色法
細菌抹片自然乾燥後，滴加瑞士染色液於塗片上以固定標本，1-3min後，再滴加與染色液等量的磷酸鹽緩沖液或中性蒸餾水與玻片上，輕輕搖晃使染色液混合均勻，5min左右水洗，干後鏡檢，菌體呈藍色，組織細胞的胞漿呈紅色，細胞核呈藍色
4.姬姆薩染色法。血片或組織觸片自然乾燥後，用甲醇固定3-5min，乾燥後在其上滴加足量染色液或將抹片浸入盛有染色液的缸里，染色30min，或者染色數小時或24h，取出水洗，吸干或烘乾，鏡檢。細菌呈藍青色，組織細胞漿呈紅色，細胞核呈藍色