蛋白質測序方法有哪些

㈠ 蛋白質N端測序測定蛋白質N端序列的方法

蛋白質N端測序測定蛋白質N端序列的方法主要分為兩大類：

1. 非質譜技術：

   • 經典的Edman降解法：該方法具有一定的准確性和簡便性，是市場上廣泛使用的技術之一，通常結合美國ABI公司的Procise491蛋白序列測序系統進行。但其局限性在於需要大量的蛋白樣品和時間，且對於特定序列的測定范圍有限。
   • 反轉錄RTPCR技術：通過將RNA轉錄為cDNA，從而反推得到蛋白質序列。然而，此方法受到轉錄效率和RNA穩定性的影響，可能帶來一定的誤差。

2. 質譜技術：

   • 質譜技術作為現代科技發展的產物，在蛋白質測序中提供了更精確、更全面的序列信息。但其設備成本較高，操作復雜，對樣品的制備要求也更為嚴格。

綜上所述，市面上常用的基於經典Edman降解法原理的蛋白質N端測序系統，結合了傳統技術和現代科技的優勢，成為了蛋白質測序的首選方法。未來，隨著科技的進步，蛋白質測序技術將更加精確、高效。

㈡ 常用於蛋白質多肽鏈N端。C端測定的方法有幾種基本原理是什麼

(1)N-末端測定
A.二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)：1945年Sanger提出此方法，是他的重要貢獻之一。
DNP-氨基酸用有機溶劑抽提後，通過層析位置可鑒定它是何種氨基酸。Sanger用此方法測定了胰島素的N末端分別為甘氨酸及苯丙氨酸。
B.氰酸鹽法：1963年Stank及Smyth介紹了一種測定N末端的新方法，步驟如下：
由於乙內醯脲氨基酸不帶電荷，因此可用離子交換層析法將它與游離氨基酸分開，分離所得的乙內醯脲氨基酸再被鹽酸水解，重新生成游離的氨基酸，鑒別此氨基酸即可了解N-末端是何種氨基酸。
C.二甲基氨基萘磺醯氯法：1956年Hartley等報告了一種測定N-末端的靈敏方法，採用1-二甲基氨基萘-5-磺醯氯，簡稱丹磺醯氯。它與游離氨基末端作用，方法類似於Sanger的DNFB法，產物是磺醯胺衍生物。
丹磺醯鏈酸具有強烈的黃色熒光。此法優點為靈敏性較高(比FDNB法提高100倍，樣品量小於1毫微克分子)及丹磺醯氨基酸穩定性較高(對酸水解穩定性較DNP氨基酸高)，可用紙電泳或聚醯胺薄膜層析鑒定。
(2)C-末端分析
A.肼解法：這是測定C-末端最常用的方法。將多肽溶於無水肼中，100℃下進行反應，結果羧基末端氨基酸以游離氨基酸狀釋放，而其餘肽鏈部分與肼生成氨基酸肼。
這樣羧基末端氨基酸可以採用抽提或離子交換層析的方法將其分出而進行分析。如果羧基末端氨基酸側鏈是帶有醯胺如天冬醯胺和谷氨醯胺，則肼解時不能產生游離的羧基末端氨基酸。此外肼解時注意避免任何少量的水解，以免釋出的氨基酸混淆末端分析。
B.羧肽酶水解法：羧肽酶可以專一性地水解羧基末端氨基酸。根據酶解的專一性不同，可區分為羧肽酶A、B和C。應用羧肽酶測定末端時，需要事先進行酶的動力學實驗，以便選擇合適的酶濃度及反應時間，使釋放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。