微生物遺傳型的鑒定方法有哪些

A. 請問一下菌種鑒定的方法和實驗步驟

實驗步驟：菌種鑒定工作是各類微生物學實驗室都經常遇到的基礎性工作。不論鑒定對象屬哪一類，其工作步驟都離不開以下三步：①獲得該微生物的純種培養物；②測定一系例必要的鑒定指標；③查找權威性的鑒定手冊。 一、經典分類鑒定方法 群體：菌落形態，在半固體或液體培養基中的生長狀態等
* 形態 個體：細胞形態，染色反應，各種特殊構造等
* 營養要求：能源，碳源，氮源，生長因子等
* 生理、生化反應 酶；產酶種類和反應物性等
* 代謝產物：種類，產量，顯色反應等
* 經典指標 生態特性：生長溫度，對氧的需要，宿主種類等
* 生活史特點
* 血清學反應
* 噬菌體的敏感性
* 其它
經典分類法
經典分類法是一百多年來進行微生物分類的傳統方法。其特點是人為地選擇幾種形態生理生化特徵進行分類，並在分類中將表型特徵分為主、次。一般在科以上分類單位以形態特徵、科以下分類單位以形態結合生理生化特徵加以區分。 * A. 能在 60 o C 以上生長
* B. 細胞大，寬度 1.3~1.8mm ………………… 1. 熱微菌屬 ( Thermomicrobium )
* B. 細胞小，寬度 0.4~0.8mm
* C. 能以葡萄糖為碳源生長
* D. 能在 pH4.5 生長 …………………………… 2. 熱酸菌屬 ( Acidothermus )
* DD. 不能在 pH4.5 生長 …………………………………… 3. 棲熱菌屬 ( Thermus )
* CC. 不能以葡萄糖為唯一碳源 ……………… 4. 棲熱嗜油菌屬 ( 棲熱嗜獅菌屬 Thermoleophilum )
* AA. 不能在 60 o C 以上生長
二、現代分類鑒定方法
* 近年來，隨著分子生物學的發展和各項新技術的廣泛應用，促使微生物分類鑒定工作有了飛速發展。對微生物鑒定工作來說，已從經典的表型特徵的鑒定深入到現代的遺傳學特性的鑒定、細胞化學組分的精確分析以及利用電子計算機進行數值分類研究等新的層次上。
* （一）微生物遺傳型的鑒定
* DNA是除少數RNA病毒以外的一切微生物的遺傳信息載體。每一種微生物均有其自己特有的、穩定的DNA成分和結構，不同微生物間DNA成分和結構的差異程度代表著它們間新緣關系的遠近。因此，測定每種微生物DNA的若乾重要數據，是微生物鑒定中極其重要的指標：
1. DNA的鹼基組成(G+Cmol%)* 每一個微生物種的 DNA 中 GC mol% 的數值是恆定的，不會隨著環境條件、培養條件等的變化而變化，而且在同一個屬不同種之間， DNA 中 GCmol% 的數值不會差異太大，可以某個數值為中心成簇分布，顯示同屬微生物種的 GC mol% 范圍。 DNA 中 GC mol% 分析主要用於區分細菌的屬和種，因為細菌 DNA 中 GC 含量的變化范圍一般在 25 ％～ 75 ％；而放線菌 DNA 中的 GC 比例范圍非常窄 (37 ％～ 51%) 。一般認為任何兩種微生物在 GC 含量上的差別超過了 10 ％，這兩種微生物就肯定不是同一個種。因此可利用 G+C mol ％來鑒別各種微生物種屬間的親緣關系及其遠近程度。值得注意的是，親緣關系相近的菌，其 G+C mol ％含量相同或者近似，但 G+C mol ％相同或近似的細菌，其親緣關系並不一定相似，這是因為這一數據還不能反映出鹼基對的排列序列，而且如放線菌的 DNA 的 GC mol% 在 37 ～ 51 之間，企圖在這么小的范圍內區分放線菌的幾十個屬顯然是不現實的。要比較兩種細菌的 DNA 鹼基對排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸雜交試驗。
1. DNA的鹼基組成(G+Cmol%)* 1）每個生物種都有特定的GC%范圍，因此後者可以作為分類鑒定的指標。細菌的GC%范圍為25--75%，變化范圍最大，因此更適合於細菌的分類鑒定。
* 2）GC%測定主要用於對表型特徵難區分的細菌作出鑒定，並可檢驗表型特徵分類的合理性，從分子水平上判斷物種的親緣關系。
* 3）使用原則：
* G+C含量的比較主要用於分類鑒定中的否定每一種生物都有一定的鹼基組成，親緣關系近的生物，它們應該具有相似的G+C含量，若不同生物之間G+C含量差別大表明它們關系遠。但具有相似G+C含量的生物並不一定表明它們之間具有近的親緣關系。
1. DNA的鹼基組成(G+Cmol%)* 同一個種內的不同菌株G+C含量差別應在4～5%以下；同屬不同種的差別應低於10～15%。所以G+C含量已經作為建立新的微生物分類單元的一項基本特徵，它對於種、屬甚至科的分類鑒定有重要意義。
* 若二個在形態及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差別大於5%，則肯定不是同一個種，大於15%則肯定不是同一個屬。
* 在疑難菌株鑒定、新種命名、建立一個新的分類單位時，G+C含量是一項重要的，必不可少的鑒定指標。其分類學意義主要是作為建立新分類單元的一項基本特徵和把那些G+C含量差別大的種類排除出某一分類單元。
2.核酸的鹼基組成和分子雜交：* 與形態及生理生化特性的比較不同，對DNA的鹼基組成的比較和進行核酸分子雜交是直接比較不同微生物之間基因組的差異，因此結果更加可信。
DNA-DNA 雜交
* DNA 雜交法的基本原理是用 DNA 解鏈的可逆性和鹼基配對的專一性，將不同來源的 DNA 在體外加熱解鏈，並在合適的條件下，使互補的鹼基重新配對結合成雙鏈 DNA ，然後根據能生成雙鏈的情況，檢測雜合百分數。如果兩條單鏈 DNA 的鹼基順序全部相同，則它們能生成完整的雙鏈，即雜合率為 100% 。如果兩條單鏈 DNA 的鹼基序列只有部分相同，則它們能生成的「雙鏈」僅含有局部單鏈，其雜合率小於 100% 。由此；雜合率越高，表示兩個 DNA 之間鹼基序列的相似性越高，它們之間的親緣關系也就越近。如兩株大腸埃希氏菌的 DNA 雜合率可高達 100 ％，而大腸埃希氏菌與沙門氏菌的 DNA 雜合率較低，約有 70 ％。 G+Cmol ％的測定和 DNA 雜交實驗為細菌種和屬的分類研究開辟了新的途徑，解決了以表觀特徵為依據所無法解決的一些疑難問題，但對於許多屬以上分類單元間的親緣關系及細菌的進化問題仍不能解決。
DNA — rRNA 雜交
* 目前研究 RNA 鹼基序列的方法有兩種。一是 DNA 與 rRNA 雜交，二是 16S rRNA 寡核苷酸的序列分析。 DNA 與 rRNA 雜交的基本原理、實驗方法同 DNA 雜交一樣，不同的是① 是 DNA 雜交中同位素標記的部分是 DNA ，而 DNA 與 rRNA 雜交中同位素標記的部分是 rRNA 。② DNA 雜交結果用同源性百分數表示，而 DNA 與 rRNA 雜交結果用 Tm(e) 和 RNA 結合數表示。 Tm(e) 值是 DNA 與 rRNA 雜交物解鏈一半時所需要的溫度。 RNA 結合數是 100 m gDNA 所結合的 rRNA 的 m g 數。根據這個參數可以作出 RNA 相似性圖。在 rRNA 相似性圖上，關系較近的菌就集中到一起。關系較遠的菌在圖上占據不同的位置。用 rRNA 同性試驗和 16SrRNA 寡核苷酸編目的相似性比較 rRNA 順反子的實驗數據可得到屬以上細菌分類單元的較一致的系統發育概念，並導致了古細菌的建立。
3.建立16 S r RNA系統發育樹
* a）使生物進化的研究范圍真正覆蓋所有生物類群；
* 傳統的生物進化研究，主要基於復雜的形態學和化石記載，因此多限於研究後生生物（metazoa），而後者僅占整個生物進化歷程的1/5
* b）提出了一種全新的正確衡量生物間系統發育關系的方法；
* c）對探索生命起源及原始生命的發育進程提供了線索和理論依據；
* d）突破了細菌分類僅靠形態學和生理生化特性的限制，建立了全新的微生物分類、鑒定理論；
* e）為微生物生物多樣性和微生物生態學研究建立了全新的研究理論和研究方法，特別是不經培養直接對生態環境中的微生物進行研究。
3、 16S rRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析
* 首先， 16S rRNA 普遍存在於原核生物（真核生物中其同源分子是 18S rRNA ）中。 rRNA 參與生物蛋白質的合成過程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進化的漫長歷程中保持不變，可看作為生物演變的時間鍾。其次，在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列區域，又有中度保守和高度變化的序列區域，因而它適用於進化距離不同的各類生物親緣關系的研究。第三， 16S rRNA 的相對分子量大小適中，約 1 540 個核苷酸，便於序列分析。因此，它可以作為測量各類生物進化和親緣關系的良好工具。
分離菌株 16S rRNA 基因
* 。從平板中直接挑取一環分離菌株細胞 , 加入 100μL 無菌重蒸 H 2 O 中 , 旋渦混勻後 , 沸水浴 2min, 12 000r min -1 離心 5min, 上清液中即含 16S rRNA 基因，可直接用於 PCR 擴增。分離菌株 16S rRNA 基因的 PCR 擴增和序列測定的一般步驟為： 16S rRNA 基因的 PCR 引物： 5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3' ； 5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3' 。擴增反應體積 50 m L ，反應條件為 95 ℃預變性 5min ， 94 ℃變性 1min ， 55 ℃退火 1min ， 72 ℃延伸 2min ，共進行 29 個循環， PCR 反應在 PTC-200 型熱循環儀上進行。取 5 m L 反應液在 10g L -1 的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。 PCR 產物測序可由專門技術公司完成。
比對分析
* 測序得到 分離菌株 16S rDNA 部分序列，此序列一般以 *.f.seq 形式保存，可以用寫字板或 Editsequence 軟體打開，將所得序列通過 Blast 程序與 GenBank 中核酸數據進行比對分析 ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast ) ，具體步驟如下：點擊網站中 Nucleotide BLAST 下 Nucleotide-nucleotide BLAST [blastn] 選項，將測序所得序列粘貼在「 search 」網頁空白處，或輸入測序結果所在文件夾目錄，點擊核酸比對選項，即「 blast 」，然後點擊「 format 」，計算機自動開始搜索核苷酸資料庫中序列並進行序列比較，根據同源性高低列出相近序列及其所屬種或屬，以及菌株相關信息，從而初步判斷 16S rDNA 鑒定結果。
比對分析
* 遺傳距離矩陣與系統發育樹構建，可採用 DNAStar 軟體包中的 MegAlign 程序計算樣本間的遺傳距離。由 GenBank 中得到相關菌株的序列，與本研究分離菌株所測得序列一起輸入 Clustalx1.8 程序進行 DNA 同源序列排列，並經人工仔細核查。在此基礎上，序列輸入 Phylip3.6 軟體包，以簡約法構建系統發育樹。使用 Kimura 2-parameter 法，系統樹各分枝的置信度經重抽樣法（ Bootstrap ） 500 次重復檢測， DNA 序列變異中的轉換和顛換賦於相同的加權值。
（二）細胞化學成分的鑒定* 除上述核酸成分外的其它化學成分的測定，是微生物化學分類法的重要內容，主要包括：1.細胞壁的化學成分。2.全細胞水解液的糖型。3.磷酸類脂成分的分析。4.枝菌酸的分析。5. 醌類的分析。6.氣相色譜技術的應用。
（二）細胞化學成分的鑒定
* 微生物分類中，根據微生物細胞的特徵性化學組分對微生物進行分類的方法稱化學分類法 (chemotaxonomy) 。在近二十多年中，採用化學和物理技術采研究細菌細胞的化學組成，已獲得很有價值的分類和鑒定資料，各種化學組分在原核微生物分類中的意義見表
細菌的化學組分分析及其在分類水平上的應用
細胞化學成分鑒定的意義
* 隨著分子生物學的發展，細胞化學組分分析用於微生物分類日趨顯示出重要性。細胞壁的氨基酸種類和數量現己被接受為細菌屬的水平的重要分類學標准。在放線菌分類中，細胞壁成分和細胞特徵性糖的分析作為分屬的依據，已被廣泛應用。脂質是區別細菌還是古菌的標准之一，細菌具有醯基脂 ( 脂鍵 ) ，而古菌具有醚鍵脂，因此醚鍵脂的存在可用以區分古菌。黴菌酸的分析測定己成為諾卡氏菌形放線菌分類鑒定中的常規方法之一。鞘氨醇單胞菌和鞘氨醇桿菌等細胞膜都含有鞘氨醇，因此鞘氨醇的有無可作為此類細菌的一個重要標志。此外某些細菌原生質膜中的異戊間二烯醌，細胞色素，以及紅外光譜等分析對於細菌、放線菌中某些科、屬、種的鑒定也都十分有價值。
（三）數值分類法
* 數值分類法亦稱統計分類法，是在約200年前與林奈同代人M.Adanson (1727 ~1806，法國植物學家)發展的分類原理基礎上藉助於現代的電子計算機技術而發展起來的。數值分類的基本步驟為：（1）計算兩菌株間的相似系數；（2）列出相似度矩陣；（3）將矩陣圖轉換成樹狀譜。
數值分類的基本步驟
數值分類法
* 又稱阿德遜氏分類法 。它的特點是根據較多的特徵進行分類，一般為 50 ～ 60 個，多者可達 100 個以上，在分類上，每一個特性的地位都是均等重要。通常是以形態、生理生化特徵，對環境的反應和忍受性以及生態特性為依據。最後，將所測菌株兩兩進行比較，並借用電子計算機計算出菌株間的總相似值，列出相似值矩陣 ( 圖 14-5) 。為便於觀察，應將矩陣重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然後將矩陣圖轉換成樹狀譜 (dendrogram) ，再結合主觀上的判斷 ( 如劃分類似程度大於 85 ％者為同種，大於 65 ％者為同屬等 ) ，排列出—個個分類群。
數值分類法的優越性
* 數值分類法的優越性在於它是以分析大量分類特徵為基礎，對於類群的劃分比較客觀和穩定；而且促進對細菌類群的全面考查和觀察，為細菌的分類鑒定積累大量資料。但在使用數值分類法對細菌菌株分群歸類定種或定屬時，還應做有關菌株的 DNA 鹼基的 G + Cmol% 和 DNA 雜交，以進一步加以確證。

B. 微生物遺傳學的研究方法

除了一般的微生物學研究方法以外，在微生物遺傳研究中最突出的方法是突變型的篩選和選擇性培養方法的應用。突變型一方面可作為染色體的標記，另一方面可用來剖析各種生命活動的遺傳控制。為了後一目的，必須獲得特定類型的突變型。在高等動植物中，雖然也有一些篩選特定類型的突變型的例子，但是多數突變型是由於偶然出現枝察猜而長期積累起來的。微生物遺傳學研究則不同，一般工作常從篩選特定的突變型開始，例如篩選不能合成某一種氨基酸的突變型（營養缺陷型）、對於某一種葯物或噬菌體具有抗性的突變型、在較高溫度中不能進行DNA 復制的突變型、轉化過程中發生遺傳性障礙的突變型、某一特定的酶發生缺陷的突變型以及導致某一種蛋白質的某一功能區發生變化的突變型等。微生物遺傳學的迅速發展和便於取得所需要的突變型有著密切的關系。
特定類型的突變型的篩選之所以能夠成功，主要是應用選擇性培養基的結果。例如把大量對某種葯物敏感的細菌接種在含有該種葯物的培養基上，在這上面能形成菌落的細菌便是發生了抗葯性突變的細菌。這一原理也應用於突變的研究、細菌接合的研究、轉導的研究、基因精細結構分析的研究(見基因定位)和基因調控的研究等。選擇性培養方法的應用大大提高了工作效率，在基因重組的分析中一般需要測定雜交子代中親本組合和重組類型的比率；兩個基因的距離愈近，則發現重組類型猛型所須分析的子代個體愈多。同一基因內部的兩個突變位點的距離必然更近，因此在高等動植物中較難發現它們之間的重組。在微生物中應用選擇性培養方法，可以檢出距離十分接近的兩個突變位點之間的重組，因為特定的選擇條件能淘汰絕大多數非重組個體，而只使為數有限的重組體存活。例如大腸桿菌T4噬菌體的快速溶菌突變型rⅡ能感染寄主細菌大腸桿菌B而形成噬菌斑，但在大腸桿菌K上則不能形成噬菌斑。用大腸桿菌K作為選擇性培養條件,便能檢出兩個十分接近的rⅡ突變位點之間發生重組而出現的野生型噬菌體。由於選擇性培養方法的應用，才有可能在較短時間測定大量的這沒滲類突變型，非但提高了工作效率，還從根本上改變了對基因的認識。

C. 微生物遺傳研究利器—Tn-Seq 轉座子測序技術

轉座子測序技術（Tn-seq）是一種結合了轉座子插入誘變與二代測序技術的高效研究方法，主要用於細菌基因功能的深入探究。此技術的核心是構建轉座子插入文庫，其中大部分或全部非必需基因（non-essential genes）均攜帶插入片段。通過特定體外或體內培養，測序確定實驗前後種群中突變體的相對頻率。從數據中，量化每種情況下的基因適應性貢獻，識別必需基因與特定表型的相關性，如抗生素抗性基因的鑒定。

Tn-seq技術自2009年首次發布以來，已發展出多種用於細菌的轉座子插入測序方法，包括INSeq、HITS和轉座子定向插入位點測序等。杭州沃森生物技術有限公司自主開發的Tn-seq建庫流程，能兼容多種突變體庫構建方法，僅需提供轉座子序列信息，即可構建二代測序文庫進行後續分析。

技術流程包括轉座子插入、構建文庫、測序和數據分析等步驟。流程圖具體展示了各步驟的操作細節。數據分析階段，將測序數據轉換為可解讀的生物信息，以便進一步研究和理解基因功能。結果可視化則以直觀的方式展示研究發現，如基因活性、突變頻率等。

已有文獻證明了Tn-seq技術的效能，如Jiawen Xiao的研究分析了在營養壓力下Pantoea agglomerans關鍵基因的生存機制，Fan Yin的研究揭示了多重耐葯豬腸外病原性大腸桿菌在體內適應性的關鍵基因。

杭州沃森生物技術有限公司，憑借豐富的分子生物學尤其是NGS應用經驗，為精準醫學和科研領域提供高品質產品和成本優化解決方案。公司產品線涵蓋分子生物學、細胞生物學實驗相關產品，前沿生物技術平台如數字PCR、單細胞測序，以及分子診斷、細胞基因治療等方向的試劑、原料、耗材、儀器等。在紫金港科技城設有專業生物學實驗平台和十萬級潔凈度標准生產車間，自有品牌麥伯生物，提供定製化的試劑耗材解決方案和產品。

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D. 請教病原微生物分型的方法種類及優劣勢比較。謝謝！

病原微生物的分子分型方法
近年來，隨著分子牛物學技術快速發展，新的診斷技術和方法不斷涌現並廣泛應用於臨床微生物的檢測，為病原微牛物的致病性、流行性、變異性以及耐葯性分析等方面提供J，重要的信息。目前，應用分子生物學技術對病原微牛物進行分型的方法包括：脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gelelectrophoresis。PFGE)分型、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)分型、生物晶元分型、多位點序列分型(muhilocus sequencetyping，MI。ST)、質粒DNA圖譜分型以及限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分型等。
1．脈沖場凝膠電泳分型PFGE技術以其重復性好、分辨力強而被譽為細菌分子分型的「金標准」。它可以用於大分子DNA的分離，其分辨范圍達到10 Mb，而普通瓊脂糖凝膠電泳僅能分離小於500 Kb的DNA。PFGE的基本原理是通過電場的不斷改變，使包埋在凝膠中的DNA分子的泳動方向發
生改變，小分子DNA比大分子DNA泳動快，從『『ii在凝膠上按DNA分子大小呈現出特異的電泳圖譜。病原微生物的基因組DNA經脈沖場凝膠電泳，使大片段DNA有效分離。DNA條帶的密度反映了病原微生物基因組DNA的含量以及分子的大小，最終達到分型的目的。目前，PFGE已被廣泛的應用於病原微牛物的分型，Swaminathan等∽J已經建立了針對大腸桿菌0157：H7、沙門菌屬的Typhimurium血清型、李斯特菌、志賀菌屬等病原微生物分型的標准PFGE操作方法。有研究認
為PFGE的分辨力強於核糖體分型和隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)分型。當採用1個限製件核酸內切酶的分辨力不強時，可以採用2種限制性核酸內切酶加以提高。當然，PFGE也有一些局限，如耗時長、成本高等。另外，電泳圖譜易受操作人員技術水平等因素的影響，這為不同實驗室問的比較帶米一定困難¨
2．聚合酶鏈反脫分犁PCR技術自1985年發明以來，以其靈敏度高和特異性強受到了人們的高度重視，成為核酸擴增和檢測的一種常規方法H]。用於病原微生物分子分型的PCR方法主要有RAPD分型和重復序列PCR分犁2種。RAPD是建移在PCR基礎卜-的1種可對整個未知序列的基因
組進行多態性分析的分子生物學方法。該方法以基岡組DNA為模板，以單個人T．合成的隨機多態核苷酸序列(通常為10個鹼基)為引物，在熱穩定的DNA聚合酶的作用下進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖或聚內烯醯胺凝膠電泳後，對其進行多態性分析。反應小同基因組DNA特點，從而對病原微生物進行分型。RAPD可以在物種沒有任何基因組信息的情況下分析其DNA多態性，對模板DNA的純度要求不高。無需DNA探針和分子雜交。重復序列PCR分型足Versalovic於1996
年描述的1種細菌基因組指紋分析方法，即PCR擴增細菌基因組中廣泛分布的短重復序列，經電泳圖譜比較分析揭示基因組間的差異[5]。研究表明重復序列PCR分型與RAPD分型有相同的分辨力[6]，但操作相對復雜。然而，重復序列PCR分型的再現性非常好，這是RAPD無法比擬的。此外，多重PCR、巢式PCR等也呵用於病原微生物的分型，雖然各有長處，但也存在分辨力弱、重復性差、結果解析困難等不足，因此，還未廣泛應用於臨床。
3．生物晶元分型 生物晶元技術是將生物大分子，如寡核苷酸、cDNA、基岡組DNA、肽、抗原以及抗體等固定在諸如矽片、玻璃片、塑料片、凝膠和尼龍膜等固相介質上形成生物分子點陣，當待測樣品中的生物分子與生物晶元的探針分子發生雜交或相互作用後，利．}}j激光共聚焦顯微掃描儀對雜交信號進行檢測和分析例。其用於病原微生物分型的基本原理是將代表各個亞型的特異基因製成1張晶元，經反轉錄就可檢測樣本中病原微生物的亞型進行辨別。液態晶元(suspension arraytechnology，SAT)，又稱微球蛋白晶元(proteinbeadarrays，PBA)，是近年來出現的1種新的晶元技術。其原理是甩2種熒光染料按照不同比例將直徑為5．6 ttm的微球染成100種顏
色，每種顏色的微球共價結合1種牛物探針，可以是抗原、抗體、配體，也可以是核酸或酶，分針對1種待檢物。混合載有100種不同顏色的微球，就可以在1個反應孔里同時完成100種不同的生物反應。隨後微球成單列通過2束激光照射的管道，計算機採集並處理每種顏色微球的熒光強度變化就可以分別對每個待測物進行定性或定量的檢測。該系統口『用於多種微生物抗原、抗體和特定基因的聯合檢測。目前，該方法已應用於臨床HPV的分型檢測。與固態晶元相比，液態晶元在反
應動力學、反應速度、檢測敏感性、穩定性以及自動化程度方面都有較大的優勢，因此，不少學者看好液態晶元的應用前景。
4．多位點序列分型 隨著DNA測序技術的快速發展，分子分型日益趨向於染色體的單一或多個位點的多態性上。MI。ST分型是指測定對多個管家基囡中長度約為470 bp的核心片段的核苷酸序列，對其組合進行索引編號，不同的菌株對應不同的序列型，從而揭示菌株間等位基因的多樣性。Maid—en等[83發現，MI，ST可用於腦膜炎奈瑟球菌的分型。他們認為，多個管家基因的序列分析比較在實驗過程的ⅡI操作性與結果的可靠性之間取得了平衡，且結果准確，所得數據在不同的實驗竄問具有良好的可比性，即MLST對某哆菌株具有較強的種內分辨力【9 J。Chen等no]應用MLST對我國台灣地區12家醫院分離到的51株白色假絲酵母菌進行遺傳特徵分析，結
果發現了7個管家基因序列的83個多態性位點和45個二倍體序列類型。其中，36．1％是同義突變，63．9 oA為非同義突變。他們認為，MI。ST的分辨力較PFGE更強，能分辨某患者所感
染的白色假絲酵母菌隨時間推移『『ii發生的微小種內進化。但MLST的缺點是它的高額費用和操作過程所需的特定儀器。這使得這項技術只能局限在大型的全球性流行病學研究中心
使用，影響其在醫院推廣普及。
5．質粒DNA圖譜分型 細菌質粒分析是較早被使用的病原微牛物分子分型方法。該方法包括萃取質粒DNA和瓊脂糖凝膠電泳。由於不同菌株質粒DNA序列和大小不同，
通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的DNA質粒圖譜也不同，從而可以對不同菌株進行分型。菌株攜帶的質粒越多則質粒DNA圖譜分型方法的特異性越強。質粒網譜分型的優點是操作相對簡單，只需要簡單的設備就可以完成，耗時短，費用低廉。但質粒圖譜分型有一難以克服的缺陷。即質粒可以自發的丟失、獲取以及在同種細菌甚至是在異種細菌之間轉移，這就造成了質粒圖譜的不穩定性。另外，質粒圖譜型方法小能區分那些大小相同而DNA序列不同的質粒¨「。
6．限制性片段長度多態性分型 RFI。P是指基因組DNA經限制性核酸內切酶消化，消化後的片段再通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離。用限制性核酸內切酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因組DNA，可以產生大量短的片段，通過電泳後得到的DNA圖譜可用於病原微生物的分型。幾乎所有
的病原微牛物分離株都町以通過這種方法分型，但由於基因組DNA巨大，酶切後產生的片段眾多，且含有大量的鶯疊片段，這使得蔚株間圖譜的一致性分析面I臨諸多用難口「。RFLP分
型分辨力弱於PFGE分型，且操作比較復雜。

E. 哪些標識可以簡單識別細菌、病毒的遺傳

細菌與病毒是兩種完全不同的微生物。

細菌是微生物的一大類。大小約一至數微米，呈球形、桿形、弧形、螺形或長絲形。有的具芽孢、鞭毛或英膜。以二等分分裂繁殖為主。除部分自養細菌外，多營腐生或寄生生活。遍布於土壤、水、空氣、有機物質中及生物體內和體表。對自然界物質循環起著巨大作用。某些種類能提高土壤的肥力。不少種類可用於發酵工業，生產食品、化學品和醫葯品等。某些種類可用於細菌冶金和石油脫蠟。若干種類能引起人和動植物病害或工農業產品的霉腐。一般來就構成細菌的細胞沒有細胞核。在細菌的內部，多數具有一層粘滑外罩的剛性細胞壁，上面有些被稱為纖毛的微細絨毛，其中較長較粗的另被稱之為鞭毛，它的蠕動能使細菌運動起來。另外細菌也沒有能獲取能量的線粒體。不過它們卻有一個單一的DNA環，是一病毒核心，還有粒狀斑點和核蛋白體，它可產生出細菌蛋白質。

以細菌為宿主的病毒。又稱噬菌體。分為10科，其中肌病科，如T2、T4噬菌體等；長尾病毒科，如λ、T5噬菌體等；短尾病毒科，如T7、P22噬菌體等。噬菌體因其所具有的特性而成為探討核酸（DNA和RNA）的復制、轉錄、重組、基因表達的調節控制、病毒與宿主的關系等各方面的研究對象，促進了病毒學、分子生物學、遺傳學的發展。在臨床醫學中，曾試用噬菌體診治某些細菌性感染的疾病。噬菌體的污染可能給發酵工業（如食
細菌和病毒的區別可以從三個方面來闡述：

1.形態方面

細菌的大小遠比病毒大，通常細菌的大小以微米來衡量，而病毒的大小以納米來衡量。

細菌的外部形態大多為球狀、桿狀、螺旋狀，並且也因此命名為球菌、桿菌以及螺旋菌。而病毒為多面體結構，為了能達到最佳穩定結構，以及最佳比表面積，病毒多位一十二面體。

2.結構方面

雖然細菌沒有細胞核只有類似的擬核結構，但是細菌仍具有一定的細胞結構，即細胞壁、細胞膜、細胞質。更進一步的，根據細菌細胞壁結構和成分的不同，發展出的革蘭氏染色機制，將細菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌。病毒不具有以上所述的細胞結構，它由核衣殼包裹遺傳物質所構成。

3.生存繁殖方面

細菌根據其生存方式可以分為自養性和異樣性，即一部分細菌可以通過光合作用（比如一些藍藻Cyanobacteria）或者是將無機物轉化成為有機物質的化能（比如一些硫細菌）方式而達到生存的目的；另一部分細菌則和人一樣不能自己合成有機物質供自身的生長繁殖，必須從外界攝取營養來養活自己。病毒就沒細菌那樣能幹了，它們只能依靠寄生於宿主（host）體內的形式而存活，當然這並不是說病毒完全不能脫離宿主，它們可以暫時脫離宿主，以休眠體的形式待在外 界對於它們而言非常「惡劣」的環境中。

在繁殖時細菌主要採用二分裂的方法，就是我們通常所說的一個變兩，兩變四的方式。病毒則必須侵入到宿主體內，利用宿主的合成機制來合成它們自己所需的蛋白質等物質來構建自己的「身體」。

細菌是微生物，而病毒是DNA(脫氧核糖核酸），與蛋白質一樣，是由氨基酸合成的。 病毒、細菌在結構與感染的方式不同所產生的。病毒是一種非細胞形態的微生物，它體積小，小到高倍數的光學顯微鏡也看不到，只能用電子顯微鏡才能觀察到。它無細胞器，由基因組核酸和蛋白質外殼組成。基因組僅含一種類型的核酸，或者是核糖核酸（RNA）或者是脫氧核糖核酸（DNA）。 在感染後的生存方式上，細菌與病毒有很大的區別細菌是單細胞生物。在人體內合適的條件下，如各種粘膜上就可能自我繁殖使人致病。只要改變細菌的繁殖條件就可能殺死細菌把病治好。而病毒則是非細胞微生物，缺乏完整的酶系統，不能獨立進行代謝活動，因而不能像細菌一樣進行自我繁殖。病毒感染後，先進入人體血液內，形成病毒血症。隨後只能嚴格地寄生在人體靶細胞內，利用細胞的生物合成機器進行自身的復制並釋放子代病毒。換言之，病毒只有進入了人體細胞內才能生存和復制，此時只要能識別病毒並能區分哪是被感染細胞哪是健康細胞，把病毒和被感染細胞殺死就能把病治好。可惜的是，到目前為止，現有的合成葯物和治療方法還不具備這種識別和區分功能，又不可能把人體所有細胞都殺死。而具備這種特異性識別功能的只有人體自身的免疫細胞和免疫球蛋白。如果感染者此時的免疫力低下，特異性抗體不足以清除病毒，病毒性疾病難治就是不言而喻的了。而且乙型肝炎病毒進入肝細胞後,它還可改變肝細胞膜的性質。使體內的免疫系統發生紊亂, 誤把自身的肝細胞當做「敵人」來破壞, 而造成肝細胞損傷。即使你用抗病毒葯物殺死了病毒,但自身的免疫功能仍會繼續對肝細胞發生攻擊。因此乙型肝炎比較難治癒, 除抗病毒治療外, 還需進行免疫調節治療。 細菌是一大類能獨立生活的單細胞微生物，它們的新陳代謝就是從周圍環境中攝取營養，以獲得能量和合成自身組分的原料。細菌的表面積大，新陳代謝活躍且多樣化，生長繁殖迅速。 細菌在代謝過程中不同菌可產生不同的代謝產物，有些產物對人有害，例如細菌產生的毒素和酶與其致病性有關；有些產物對人有利，例如細菌產生的維生素；有些產物對鑒別診斷細菌有作用，例如色素及糖分解產物等。一、細菌的營養 1．水分：占細胞漿的70%～90%，水是細胞的組成成分，也是良好的溶劑。 2．碳源（carbonsource）：碳源既是細菌的組成成分，又是細菌的能量來源。 3．氮源（nitrogensource）：氮是組成細菌蛋白質、酶和核酸的成分。 4．無機鹽類：細菌所需無機鹽包括磷、硫、鎂、鐵、鉀、鈉、鈣、氯、錳、鋅、鈷、銅等。其中磷、硫、鎂、鉀、鈉、鐵需要量較多，其他只需微量。 5．生長因子（growthfactors）：生長因子是某些細菌生長所必需而其自身又不能合成的一類營養物質，包括維生素、嘌呤和嘧啶等。營養物質主要功用：①供給細菌所需要的碳源和氮源；②用以產生能量；③有的營養物如維生素主要用於調節新陳代謝。二、營養物質的吸收 1．擴散（diffusion）：是一種簡單的吸收方式。受滲透壓及溶質濃度的調節。 2．促進擴散（facilitated diffusion）：不需代謝能，不能逆濃度運輸。需要載體蛋白參與。 3．主動運輸（active transport）：細菌從低濃度向高濃度逆濃度梯度積累營養物質的過程稱為主動運輸。主動運輸需要能量和透性酶或結合蛋白。 4．基團轉位（grouptranslocation）：需要代謝能量主要存在於厭氧微生物中。葡萄糖、果糖等單糖以及核苷與脂肪酸的運輸均以此種方式進行。三、細菌的營養類型 根據細菌對碳源利用情況的差異，可將細菌分為兩大營養類型： 1．自養菌（autotrophicbacteria）：此類細菌能利用二氧化碳或碳酸鹽作為唯一碳源。 2．異養菌（heterotrophicbacteria）： 需要利用有機物質碳作為營養和能源的細菌。異養菌又可以分為兩類： （1）腐生菌（saprophytes）：有些異養菌能從無生命的有機物質中攝取營養。 （2）寄生菌：有些異養菌寄生於活的動植物體內，從宿主體內的有機物質中獲得營養和能量，這類細菌稱為寄生菌（parasites）。 大部分致病菌屬於寄生菌。

1、細菌：原核生物的一種，主要特點是沒有核膜，其遺傳物質分散在細胞質內一個相對固定的區域內，稱為核區。細菌的外邊包裹著一層細胞壁，一般為多糖聚合而成。

2、病毒：構造很簡單，外面是一層蛋白質，稱為病毒外殼。蛋白質外殼內部包裹著病毒的遺傳物質，可以是DNA，也可以是RNA。病毒自己不能完成新陳代謝，也不能完成繁殖，需要寄生在其它細胞內完成。

病毒和細菌的絕大部分是對人類沒有害的，有害的只是很小的一部分。

有的病毒對人類是有益的，比方說煙草花葉病毒，是使植物煙草葉片感染的一種植物病毒，感染的煙草葉片象綉上了美麗的花紋。這種病毒用來進行轉基因研究，對科學家幫助很大。

細菌也有很多是有益的。如人體大腸內寄生的大腸桿菌，幫助人類分解食物中的營養成分，可以給人體提供多種維生素。牛、羊等動物能夠消化植物纖維，是因為他們的消化道內寄生了一種細菌，這種細菌可以分解纖維素；要是沒有這種細菌的話牛和羊是沒法吃草的。同時人們依靠細菌生產葯品、食品、飼料、抗生素、味精、調料等。同時細菌也是大自然的分解者，分解動物的糞便、動植物的屍體等。沒有細菌的世界是無法想像的世界，所有的生物將無法生存。

抗生素只能殺滅細菌。比方說青黴素，能破壞細菌細胞壁上的多糖，使細菌的表面暴露，失去了應有的保護作用，細菌也就不能生存了。病毒外部是蛋白質，抗生素對它們是沒有作用的。但干擾素可以干擾病毒DNA或RNA的復制，使病毒的數量不再增加，然後依靠人體自身的免疫系統清除剩下的病毒。

F. 微生物的菌種鑒定方法與步驟(鑒定到 「 株 「 一級)

微生物的菌種鑒定方法主要可以分為以下幾個步驟，直至鑒定到「株」一級：

一、樣品採集與保存

首先，需要從待鑒定的微生物環境中採集樣品。樣品的採集需注意其代表性和無污染性。採集後，應按照微生物保存的要求，對樣品進行妥善保存，以防止菌種發生變異或污染。

二、初步鑒定

初步鑒定主要通過微生物的形態學特徵、培養特性以及生理生化特性進行。這些特性的觀察和分析能夠提供微生物的初步信息，如菌落的形態、顏色、大小等。

三、純種分離

為了准確鑒定微生物，需要進行純種分離。通過劃線分離法、塗布分離法等方法，將微生物分散成單個菌落，以便進一步分析和鑒定。

四、生理生化特徵分析

對純種微生物進行生理生化特徵的分析，包括菌株的生長曲線、酶活性測試、代謝產物的檢測等。這些分析有助於確定微生物的種類和特性。

五、分子生物學鑒定

為了進一步確認微生物的種類，需要進行分子生物學鑒定。主要包括DNA提取、PCR擴增和序列分析。通過比對序列信息，可以確定微生物的種屬。

六、鑒定到「株」一級

完成以上步驟後，根據形態學、培養特性、生理生化特性以及分子生物學鑒定的結果，綜合判斷並確定微生物的種屬及亞型，即達到「株」一級的鑒定。每一株微生物都具有其獨特的遺傳信息和表型特徵，是微生物菌種鑒定的重要目標。

總的來說，微生物的菌種鑒定是一個復雜且嚴謹的過程，需要藉助多種方法和技術，結合微生物的特徵和信息，逐步深入分析和判斷，直至鑒定到「株」一級。這一過程對於了解微生物的多樣性、研究微生物的生態學意義以及微生物的應用都具有重要意義。