從組織細胞中獲得酶的粗提純樣品有哪些方法

❶ 酶進行提純的方法是什麼

酶，從動植物細胞和微生物中提取之後，往往不能直接應用，這是因為生物在合成酶的同時也合成其他大分子物質。而這些大分子物質會嚴重干擾酶的作用，因此必須把酶從中分離出來。如果酶不純，那麼極有可能在應用中形成幾個生化反應同時進行，結果得到的產物也就不是單一的。當然，酶並不是越純越好。不同的生物化學反應，對酶的純度要求也不一樣。因此，要把酶製成不同的酶制劑，以便適應各種需求。

要對酶進行分離和提純，有多種方法。當酶從生物細胞以及微生物中產生之後，可能留在細胞內，也可能分泌到細胞外面。如果是胞外酶，這就方便多了，只要收集微生物和細胞的培養液進行分離和提純就可以了。如果酶在細胞內(稱胞內酶)，則必須研碎細胞，才能把酶提取出來。不論是胞外酶還是胞內酶，都可能會含有一些其他大分子物質，如核酸、蛋白質和澱粉之類的東西。

對付核酸，只要在酶溶液中加入核酸酶，就可以去掉核酸。對於澱粉也比較好辦。最難對付的是蛋白質，因為酶也是蛋白質，能破壞蛋白質的方法也可以破壞酶，所以提純是件比較困難的事。但隨著現代科學技術的不斷進步，經過研究，已找到沉澱法、分子過濾法等。採用以上提純方法，就可以得到不同純度的酶，這為酶的廣泛應用打開了方便之門。

❷ 常用酶的提取方法有哪些並解釋提取機理

血中DNA的提取血液中DNA提取的原理：如果以外周血為DNA提取材料,在外周血中提取DNA就是從有核的白細胞中提取DNA.因此,從外周血中提取DNA包括以下幾個關鍵步驟：第一,破壞紅細胞,通常利用紅細胞與白細胞膜結構的差異,先使紅細胞裂解,經離心後收集白細胞；第二,白細胞裂使膜蛋白和核蛋白變性,游離DNA,通常是採用離子型表面活性劑使蛋白質變性；第三,除去變性蛋白質：通常採用蛋白沉澱劑沉澱變性蛋白質,使DNA留在上清液中；第四,在高鹽環境下使DNA從有機溶劑如無水乙醇中析出. 取材 取外周血5ml,EDTA抗凝 1.新鮮抗凝血,離心棄去上清液； 2.取出4℃冰箱預冷的ELS裂解液,按1:6-10的比例向細胞沉澱中加入ELS裂解液（1ml細胞壓積加入6-10ml裂解液）,輕輕吹打混勻；紅細胞裂解液ELS配方： NH4Cl:4.15克加雙蒸水500ml,取450ml; Tris:1.0297克加雙蒸水50ml,再加上上面的450ml,共計500ml,高壓滅菌, 用時加10-20ml 3.800-1000rpm離心5-8分鍾,離心棄去上層紅色清液； 4.收集沉澱部分,加入Hank』s液或無血清培養液離心洗2-3次； 5.如裂解不完全可重復步驟2和3； 6.重懸細胞,用於後續實驗；提取DNA,最好是於步驟4開始使用DEPC水配製的溶液進行. 酚氯仿方法提取DNA 在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素,以保證DNA的完整性,為後續的實驗打下基礎.是採用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細胞,隨後用酚抽提而實現的.這一方法獲得的DNA不僅經酶切後可用於Southern分析,還可用於PCR的模板、文庫構建等實驗. 原則：（1）防止和抑制DNase對DNA的降解；（2）盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞. 一、試劑准備 1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0). 2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl. 3．裂解緩沖液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml. 4．20% SDS 5．2mg/ml蛋白酶K 6．Tris飽和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿 7．無水乙醇、75%乙醇二、操作步驟（一）材料處理 1．白細胞處理 ⑴ 取紅細胞裂解完全後收集的沉澱,加入0.5ml TE ⑵ 將勻漿液轉移到1.5ml離心管中. ⑶ 加20% SDS 25 μl,蛋白酶K (2mg/ml) 25 μl,混勻. ⑷ 60°C水浴1-3hr. 2．培養細胞處理： ⑴ 將培養細胞懸浮後,用TBS洗滌一次. ⑵ 離心4000g×5min,去除上清液. ⑶ 加10倍體積的裂解緩沖液. ⑷ 50-55°C水浴1-2hr. （二）DNA提取 1. 加等體積飽和酚至上述樣品處理液中,溫和、充分混勻3min. 2. 離心5000g×10min,取上層水相到另一1.5ml離心管中. 3. 加等體積飽和酚,混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中. 4. 加等體積酚/氯仿,輕輕混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中.如水相仍不澄清,可重復此步驟數次. 5. 加等體積氯仿,輕輕混勻,離心5000g×10min,取上層水相到另一管中. 6. 加1/10體積的3M醋酸鈉（pH 5.2）和2.5倍體積的無水乙醇,輕輕倒置混勻. 7. 待絮狀物出現後,離心5000g×5min,棄上清液. 8. 沉澱用75%乙醇洗滌,離心5000g×3min ,棄上清液. 9. 室溫下揮發乙醇,待沉澱將近透明後加50-100ml TE溶解過夜. (三）DNA定量和電泳檢測 1.DNA定量： DNA在260nm處有最大的吸收峰,蛋白質在280nm處有最大的吸收峰,鹽和小分子則集中在230nm處.因此,可以用260nm波長進行分光測定DNA濃度,OD值為1相當於大約50μg/ml雙鏈DNA.如用1cm光徑,用 H2O稀釋DNA樣品n倍並以H2O為空白對照,根據此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前的濃度：DNA（mg/ml）=50×OD260讀數×稀釋倍數/1000. DNA純品的OD260/OD280為1.8,故根據OD260/OD280的值可以估計DNA的純度.若比值較高說明含有RNA,比值較低說明有殘余蛋白質存在.OD230/OD260的比值應在0.4-0.5之間,若比值較高說明有殘余的鹽存在. 2.電泳檢測：取1μg基因組DNA用行0.8%瓊脂糖凝膠上電泳,檢測DNA的完整性,或多個樣品的濃度是否相同.電泳結束後在點樣孔附近應有單一的高分子量條帶. 三、注意事項 1. 所有用品均需要高溫高壓,以滅活殘余的DNA酶. 2. 所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配製. 3. 用大口滴管或吸頭操作,以盡量減少打斷DNA的可能性. 4. 用上述方法提取的DNA純度可以滿足一般實驗（如Southern 雜交、PCR等）目的.如要求更高,可參考有關資料進行DNA純化.

❸ 如何將酶從細胞中分離

植物細胞有堅韌的細胞壁，需要強烈的方法去破碎，少量樣品可用研缽加石英砂研磨，或用玻璃勻漿器。大量樣品則需用電動勻漿器。為減低研磨或勻漿過程中發熱，所用器皿和溶液需要預冷，提取液的用量一般為組織的1梍5倍，用量大些有利於提高得率，但工作量大，一般寧可用量小些，將殘渣再提取一次。提取勻漿時加入酚類結合劑PVPP，金屬螯合劑 Na2─EDTA，以及─SH化合物以保護蛋白質，或加入非離子型去垢劑如Triton X─100，以增加蛋白質的可溶度，常用於與膜脂結合的酶。總之，可以通過試驗以確定提取蛋白質的最佳條件。

❹ 酶分離提純的方法有哪些

酶是蛋白質，因此一般蛋白質的分離原則都應該遵行。但酶作為特殊的蛋白質，最重要的原則是一定在純化過程中保持酶的活性，所以純化過程中一般要注意保持低溫、緩沖液配方避免酶的抑制。每個步驟都要檢測酶活性，一方面直觀了解純化的回收率，另一方面可以計算酶的純度。
酶的分離純化方法一般根據酶的分子量、等電點、疏水性等生化性質，選擇相應的沉澱、鹽析、層析方法，其中親和層析可以應用可逆性底物作為配基或特異性抗體，制備親和層析膠。

❺ 從各種組織細胞中獲取酶的方法

從動物胰臟中提取胰蛋白酶,一般是用稀酸將胰腺細胞中含有的胰蛋白酶原提取出來,然後根據等電點沉澱的原理將提取液的pH值調至酸性（pH三.0左右）,使大量的酸性蛋白沉澱出來.經硫酸銨分級鹽析將胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和彈性蛋白酶原沉澱.沉澱物經水溶解並調至pH吧.0,用極少量的胰蛋白酶將胰蛋白酶原激活,同時溶液中的胰凝乳蛋白酶原和彈性蛋白酶原也被激活,三種酶原相互作用過程如下： 也可採用從胰臟中提取出胰蛋白酶原,利用合適的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶,並通過溶液中Ca二+的環境,使胰蛋白酶原被開始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活,轉變為具有活性的胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶原及彈性蛋白酶原亦同時被胰蛋白酶激活成有活性的酶）. 激活後的酶溶液再進一步分離純化. 〔試劑和器材〕 一、試劑 （一）pH二.三.0乙酸化的水溶液 （二）一0%（體積分數）乙酸 （三）二mol/L硫酸 （四）固體硫酸銨 （5）無水CaCl二 （陸）結晶胰蛋白酶 （漆）二5%乙醇溶液(含0.0一5mol/LHCl 、0.05mol/LCaCl二) （吧）95%（體積分數）乙醇 （9）5mol/L NaOH （一0）丙酮 二、器材 （一）胰臟 （二）組織搗碎機 （三）離心機 （四）磁力攪拌器 （5）透析袋、二0目篩中國、紗布、水浴鍋 （陸）燒杯、量筒、刻度吸管、試管、玻璃漏斗 （漆）布氏漏斗、抽濾瓶、溫度計、滴管、玻璃攪棒、紗布、pH試紙等 〔方法和步驟〕 方法一 一、 胰蛋白酶原的提取 取新鮮胰臟約一50g,剝去結締組織和脂肪,取凈重一00g,切成碎塊,在組織搗碎機中搗碎,並加入二倍體積預冷的pH二.三.0乙酸化水溶液,製成勻漿.漿液倒入500mL燒杯中,用一0%（體積分數）乙酸調節pH在二.三.0之間,在5～一0℃下提取陸h以上,並間隙輕輕攪拌.用四層紗布過濾,盡量擠出濾液.組織殘渣中再加入0.5倍體積（約50mL左右）預冷的pH二.三.0乙酸化水溶液再提取一次（放置一～二h）,再用四層紗布過濾.合並兩次濾液,用二.5mol/L硫酸調節濾液pH在二.三.0之間,四℃放置四h（pH始終保持在二.三.0）,使提取液中酸性蛋白沉澱析出.提取液用折疊濾紙於玻璃漏斗中自然過濾,收集濾液,量取體積（約二00mL左右）. 濾液中加入粉末狀固體硫酸銨,使溶液達0.漆5飽和度（每升濾液加四9二g,5℃）.放置過夜,使胰蛋白酶原完全析出.次日抽濾,棄濾液,壓緊並收集濾餅,即胰蛋白酶原粗品. 二、 胰蛋白酶原的激活 將胰蛋白酶原粗品稱重（濕重）,分次加入一0倍體積預冷的蒸餾水（按濾餅重量計算）,使濾餅完全溶解（一般情況濾餅中硫酸銨含量約占餅重一/四）.用5mol/L NaOH將溶液調至pH吧.0,慢慢地攪拌下加入固體無水CaCl二使溶液的Ca二+終濃度達到0.一mol/L（要減去一部分氯化鈣與硫酸銨結合生成硫酸鈣的鈣離子）.取出二mL溶液用於測定激活前的蛋白含量及酶活性.原溶液中加入5mg結晶胰蛋白酶,輕輕攪拌均勻,二5℃放置二～四h,或四℃放置一二～一陸h,使胰蛋白酶原活化.每隔一h取樣測定胰蛋白酶活性增長情況,直至酶激活速度變慢或停止增長.一般比活可達到三 500～四 000 BAEE單位/mg.留取二mL溶液用於測定激活後的蛋白質含量和酶活性.激活酶溶液用二mol/L硫酸調pH至二.三.0,濾紙過濾,濾去硫酸鈣沉澱,收集濾液,四℃保存備用. 方法二 稱取冷凍豬胰臟一00g,在二～5℃下解凍,切成小塊,用組織搗碎機中絞碎成胰漿,在5～一0℃存放二四h以上,使胰酶自身活化.胰漿中加入二5%（質量分數）乙醇溶液二50mL（二5%乙醇溶液中加0.0一5mol/L HCl 、0.05mol/L CaCl二）,搗碎機中搗碎一min.胰漿倒入500mL燒杯中,間隙攪拌,溫度二0℃左右,活化5～陸h.每隔一.5h,吸取二mL活化液用於測定激活後的蛋白質含量和酶活性. 活化反應結束後,胰漿三 500 r/min離心二0min,將離心後上清液用二層紗布過濾.濾液置二50mL燒杯中,以過濾清液的體積為准,加入粉末狀硫酸銨,攪拌溶解,使溶液硫酸銨飽和度為二0%.放置 陸h後,三 500 r/min離心二0min,保存上清液待用,取沉澱.沉澱分別用適量95%乙醇洗滌過濾,再用丙酮洗滌,過濾.最後將沉澱置於表面皿上自然乾燥,即得胰蛋白酶粗品Ⅰ. 在上述離心上清液中,加入粉末狀硫酸銨,攪拌溶解,使上清液溶液達到55%硫酸銨飽和度,放置 陸h後,三 500 r/min離心三0min,取離心沉澱,分別用適量95%乙醇、丙酮洗滌,過濾後將沉澱置於表面皿上自然乾燥,即得胰蛋白酶粗品Ⅱ

❻ 提取酶的方法有哪些

酶是蛋白質，可以根據其特點選擇適當的蛋白質提取純化方法！

選擇材料及預處理

以蛋白質和結構與功能為基礎，從分子水平上認識生命現象，已經成為現代生物學發展的主要方向，研究蛋白質，首先要得到高度純化並具有生物活性的目的物質。蛋白質的制備工作涉及物理、化學和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結晶等；二是將混合物置於單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配於來同區域而達到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機械作用而導致所提物質生物活性的喪失。蛋白質的制備一般分為以下四個階段：選擇材料和預處理，細胞的破碎及細胞器的分離，提取和純化，濃細、乾燥和保存。

微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質的原材料，所選用的材料主要依據實驗目的來確定。對於微生物，應注意它的生長期，在微生物的對數生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產量，以微生物為材料時有兩種情況：（1）得用微生物菌體分泌到培養基中的代謝產物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質，如蛋白質、核酸和胞內酶等。植物材料必須經過去殼，脫脂並注意植物品種和生長發育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節性關系密切。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進行絞碎、脫脂等處理。另外，對預處理好的材料，若不立即進行實驗，應冷凍保存，對於易分解的生物大分子應選用新鮮材料制備。

蛋白質的分離純化

一，蛋白質（包括酶）的提取

大部分蛋白質都可溶於水、稀鹽、稀酸或鹼溶液，少數與脂類結合的蛋白質則溶於乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可採用不同溶劑提取分離和純化蛋白質及酶。

（一）水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利於蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利於溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基於這一點考慮提取蛋白質和酶時一般採用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。
1、pH值
蛋白質，酶是具有等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH 范圍內。用稀酸或稀鹼提取時，應防止過酸或過鹼而引起蛋白質可解離基團發生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，鹼性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏鹼性的提取液。
2、鹽濃度
稀濃度可促進蛋白質的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常採用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

（二）有機溶劑提取法

一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀鹼中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內（度為10%，40度為6.6%）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用於動植物及微生物材料。

二、蛋白質的分離純化

蛋白質的分離純化方法很多，主要有：

（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法

1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。
蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。
蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。

2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。

3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。

（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。
超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。

2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。

（三）根據蛋白質帶電性質進行分離

蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。

1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。

2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。（詳見層析技術章）

（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法

親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。

細胞的破碎

1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關後，逐步加速至所需速度。此法適用於動物內臟組織、植物肉質種子等。

2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用於量少和動物臟器組織。

3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震盪破裂，此法多適用於微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾，此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應採取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。

4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。

5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可採用溶菌酶處理效果更好。

無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺醯氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合於目的物質的提取。

濃縮、乾燥及保存

一、樣品的濃縮

生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
2、空氣流動蒸發濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對准吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於大量溶液的濃縮。
3、冰凍法 生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
4、吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，外加聚乙二醇復蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積。
5、超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo 超濾膜的分子量截留值：

膜名稱
分子量截留值
孔的大的平均直徑

XM－300
300，000
140

XM－200
100，000
55

XM－50
50，000
30

PM－30
30，000
22

UM－20
20，000
18

PM－10
10，000
15

UM－2
1，000
12

UM05
500
10

用上面的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。

二、乾燥

生物大分子制備得到產品，為防止變質，易於保存，常需要乾燥處理，最常用的方法是冷凍乾燥和真空乾燥。真空乾燥適用於不耐高溫，易於氧化物質的乾燥和保存，整個裝置包括乾燥器、冷凝器及真空乾燥原理外，同時增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時一般先將待乾燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，然後在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干後的產品具有疏鬆、溶解度好、保持天然結構等優點，適用於各類生物大分子的乾燥保存。

三、貯存

生物大分子的穩定性與保存方法的很大關系。乾燥的製品一般比較穩定，在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化，貯藏要求簡單，只要將乾燥的樣品置於乾燥器內（內裝有乾燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可，液態貯藏時應注意以下幾點。
1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。
2、一般需加入防腐劑和穩定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標准緩沖液中。
3、貯藏溫度要求低，大多數在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應視不同物質而定。

❼ 酶的分離和純化方法是什麼

酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結晶或制劑。

首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質，然後再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質，然後製成純化的酶制劑。

酶分離純化的最終目的是獲得單一純凈的酶，因此，容許在不破壞「目的酶」的限度內，使用各種手段;酶與底物和抑制劑的結合常使其理化性質和穩定性發生改變，這種特性已被用於酶的分離純化。

由於酶及其來源的多樣性及與之共存的高分子物質的復雜性，目前還很難找到一種通用的方法以適用於一切酶的純化。為了使一種酶達到高度純化，往往需要多種方法協同作用，通過酶活性的跟蹤檢測確定最佳流程。

(7)從組織細胞中獲得酶的粗提純樣品有哪些方法擴展閱讀：

酶的本性是蛋白質，凡可用於蛋白質分離純化的方法都同樣適用於酶，但酶易失活，故分離純化需在低溫(4℃)、溫和pH(4<pH>10)等條件下進行。

與蛋白質類似，酶易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性，因此操作中應盡量減少泡沫形成，此外重金屬易使酶失效，有機溶劑能使酶變性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破壞。

在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養物。得到純培養的過程稱是分離純化。

❽ DNA粗提取實驗步驟

一 教學目的
1.初步掌握DNA的粗提取和鑒定的方法。
2.觀察提取出來的DNA物質。
二 教學建議
在本實驗的教學中，教師應注意以下幾點。
1.實驗材料必須准備充足。本實驗所用的實驗材料是雞血細胞液,由活雞的鮮血經沉澱後獲得。每組(2個學生)需用5 mL 雞血細胞液,則每班(50人)至少需要130 mL,而雞血細胞液與雞血的體積比為1:3,這樣每班至少需要390 mL 雞血細胞液。宰殺1隻中等大小的活雞,一般可得120 mL 左右的鮮血,因此,1個班實驗需要買4隻活雞。如果不具備購買活雞的條件,也可以到市場售活雞處去索取雞血,但所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑。
2.盛放雞血細胞液的容器,最好是塑料容器。雞血細胞破碎以後釋放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由於細胞內DNA的含量本來就比較少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就會更少。因此,實驗過程中最好使用塑料的燒杯和試管,這樣可以減少提取過程中DNA的損失。
3.獲取較純凈的DNA的關鍵步驟。
(1)充分攪拌雞血細胞液DNA存在於雞血細胞的細胞核中。將雞血細胞液與蒸餾水混合以後,必須用玻璃棒沿一個方向快速攪拌,使雞血細胞加速破裂,並釋放出DNA。
(2)沉澱DNA時必須用冷酒精實驗前必須准備好大量的體積分數為95%的酒精,並在冰箱(至少5S以下)中至少存放24 h。
(3)正確攪拌含有懸浮物的溶液實驗步驟3、5、7,都需要用玻璃棒攪拌。教師應提醒學生注意,在進行步驟3、5時,玻璃棒不要直插燒杯底部,而且攪拌要輕緩,以便獲得較完整的DNA分子。進行步驟7時,要將玻璃棒插入燒杯中溶液的中間,用手緩慢轉動510 min。
三 參考資料
實驗原理的補充介紹
1.DNA的釋放 DNA位於雞血細胞的細胞核中,正常情況下不會釋放出來。為了使DNA從細胞核中釋放出來,實驗中採用了向雞血細胞液中加入蒸餾水並且攪拌的方法。蒸餾水對於雞血細胞來說,是一種低滲液體,水分可以大量進入血細胞內,使血細胞破裂。同時,再加上攪拌的機械作用,就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂),於是釋放出DNA,當然也有RNA。但是,釋放出來的大量DNA和RNA往往與蛋白質結合在一起。
2.將DNA與蛋白質分離 根據二者的特性,即在濃度較高的氯化鈉溶液(物質的量濃度為2 moL/L )中,核蛋白容易解聚,游離出DNA。而DNA在濃度較高的氯化鈉溶液中的溶解度很高,Na+與帶負電的DNA結合成DNA鈉鹽。這時DNA在溶液中呈溶解狀態。
3.DNA的析出與獲取 利用DNA在濃度較低的氯化鈉溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的濃度較高的氯化鈉溶液中加入大量(300 mL )蒸餾水,稀釋氯化鈉溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白質的溶解度增高(這就是蛋白質的鹽溶現象),從而使二者分離。這時,加上不停地攪拌,溶解度下降的DNA逐漸呈絲狀物。再通過過濾,濾去蛋白質,就可以獲取DNA的黏稠物了。如果採用離心法則更好,用4 000 r/min 的旋轉頻率,離心15 min ,除去上清液(含有蛋白質),留下的沉澱物中含DNA。
4.DNA的再溶解 再用較高濃度的氯化鈉溶液去溶解DNA黏稠物。
5.DNA的沉澱和濃縮 除去了蛋白質的核酸溶液,必須再進一步沉澱和濃縮。最常用的方法是酒精沉澱法。就是將含有Na+的DNA溶液,加入到相當於其兩倍體積的體積分數為95%冷酒精溶液中,混勻以後可以使DNA沉澱、濃縮,形成含雜質較少的DNA絲狀物,懸浮於溶液中。如果出現的絲狀物較少,可以將此混合液再放入冰箱中冷卻幾分。濃縮後的DNA絲狀物,可以用緩緩旋轉玻璃棒的方法捲起(因為玻璃棒有吸附DNA的作用)。
6.DNA的鑒定 本實驗中鑒定DNA的方法為二苯胺法(配方見下述的「葯品配製」)。二苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成ω-羥基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而顯現藍色(溶液呈淺藍色)。
鑒定時溶液藍色的深淺,與溶液中DNA含量的多少有關。
二苯胺試劑的配製
A液： 15 g二苯胺溶於100 mL 冰醋酸中,再加15 mL濃硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈結晶狀態,則需加溫後待其熔化,再使用。
B液： 乙醛的體積分數為0.2%的溶液。
配製： 將0.1 mL B液加入到10 mL A液中,現配現用。
DNA粗提取與鑒定的另一種方法
1.材料用具
新鮮菜花(或蒜黃、菠菜)。
塑料燒杯,量筒,玻璃棒,尼龍紗布,陶瓷研缽,試管,試管架,試管夾,漏斗,酒精燈,石棉網,三角架,火柴,刀片,天平。
研磨液,體積分數為95%的酒精溶液,二苯胺試劑,蒸餾水。
2.方法步驟
(1)DNA的粗提取
①准備材料 將新鮮菜花和體積分數為95%的酒精溶液放入冰箱冷凍室,至少24 h。
②取材 稱取30 g菜花,去梗取花,切碎。
③研磨 將碎菜花放入研缽中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min 。
④過濾 在漏斗中墊上尼龍紗布,將菜花研磨液濾入燒杯中(有條件的學校可將濾液倒入塑料離心管中進行離心,用1 000r/min的旋轉頻率,離心25 min,取上清液放入燒杯中)。在4 ℃冰箱中放置幾分後,再取上清液。
⑤加冷酒精 將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分數為95%的冷酒精溶液中,並用玻璃棒緩緩地輕輕攪拌溶液(玻璃棒不要直插燒杯底部)。沉澱35 min後,可見白色的DNA絮狀物出現。用玻璃棒緩緩旋轉,絮狀物會纏在玻璃棒上。
(2)DNA的鑒定
①配製二苯胺試劑 取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混勻。
②鑒定 取4 mL DNA提取液放入試管中,加入4 mL 二苯胺試劑,混勻後觀察溶液顏色(不變藍)。用沸水浴(100 ℃)加熱10 min 。在加熱過程中,隨時注意試管中溶液顏色的變化(逐漸出現淺藍色)。
研磨液的配製方法
Tris：10.1 g(相對分子質量為121.14),先加50 mL 蒸餾水溶解,用物質的量濃度為2 moL/L 的鹽酸調至pH8.0,再加下述葯品。
NaCl：8.76 g(相對分子質量58.44)
EDTA：37.2 g(相對分子質量372.24)
SDS：20 g(相對分子質量288.3)
待上述葯品全部溶解後,再用蒸餾水定容至1 000 mL。
若在室溫低於20 ℃時配製葯液,SDS呈沉澱析出,此時需要加溫,才能將SDS溶解。如果提前配製的研磨液出現了沉澱,則應加溫使沉澱溶解後再使用。
研磨液中幾種葯品的作用
SDS(十二烷基磺酸鈉):可使蛋白質變性,與DNA分離。
EDTA(乙二胺四乙酸二鈉):為DNA酶的抑制劑,可以防止細胞破碎後DNA酶降解DNA。
物質的量濃度為0.15 moL/L的氯化鈉溶液：能很好地溶解DNA。
Tris/HCl：提供緩沖體系,DNA在這個緩沖體系中呈穩定狀態。(Tris為三羥甲基氨基甲烷)
鑒定DNA的其他方法 用紫外燈照射法鑒定DNA效果很好。具體鑒定方法如下。
1.配製染色劑。用蒸餾水配製萬分之五的溴化乙錠(EB)溶液。
2.將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹於蠟紙上,再滴1滴EB溶液染色。
3.將蠟紙放在紫外燈(260 nm)下照射(暗室中),可見橙紅色的螢光(DNA的紫外吸收高峰在280 nm處)。