Ⅰ 定點突變的流程
定點突變一般須有含有待突變基因的高純度質粒，不少於10μg，電泳圖清晰，達酶切及測序要求；
1.對待突變基因測序結果進行分析，設計突變方案；
2.根據突變方案設計合成覆蓋突變位點的雙向引物，合成目的DNA兩端引物，進行高保真PCR反應；
3.默認情況下，將PCR產物克隆至T載，或者根據要求亞克隆至目的載體；DNA測序驗證突變序列的正確性。
Ⅱ 跪求PCR方法定點誘變示意圖，並附帶說明（詳細），謝謝！
Step1.單一基因經過易錯PCR得到許多隨機突變拷貝（圖中為「DNA隨機突變庫」）
Step2.用限制酶將這些DNA切成許多隨機片段（圖中為「隨機片段庫」）
Step3.這些帶有突變的片段【互為引物和模板】進行PCR擴增，那麼這些突變會積累到子代DNA上。
注意：這一步會將突變傳遞給子代DNA，所以一部分子代DNA中會積累有許多有利突變，即對蛋白質性能的提高有利。
Step4.篩選出含有較多有利突變的子代DNA（圖中表示為「正突變重組子」），去除含有較多不利突變的子代DNA。
Step5.重復上述步驟2~3次，則可以獲得較好的結果。
Ⅲ 6，dna點突變常用的檢測方法有哪些
基因突變檢測方法：
（1）
pcr-sscp法是在非這性聚丙烯醯胺凝膠上，短的單鏈dna和rna分子依其大街基序列不同而形成不同構象，一個鹼基的改變將影響其構象而導致其在凝膠上的移動速度改變。其基本原理為單鏈dna在中性條件下會形成二級結構，這種二級結構依賴於其鹼基組成，即使一個鹼基的不同，也會形成不同的二級結構而出刺同的遷移率。由於該法簡單快速，因而被廣泛用於未知基因突變的檢測。
（2）異源雙鏈分析法（ha）
ha法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型dna雙鏈。由於突變和野生型dna形成的異源雜合雙鏈dna在其錯配處會形成一突起，在非變性凝膠中電泳時，會產生與相應的同源雙dna不同的遷移率。該法與sscp相似，所不同的是sscp分離的是單鏈dna，ha法分離的是雙鏈dna，也只適合於小片段的分析。
（3）突變體富集pcr法（mutant-enriched
pcr）本法的基本原理是利用ras基因家族某個密碼子部位存在已知的限制性內切酶位點，如k-ras基因第12密碼子的bstni位點，第13密古巴子有bgⅰⅱ位點。用鏈續二次的巢式pcr來擴增包括k-ras第12、13密碼子的dna片段，在兩次擴增反應之間用相應的內切酶消化擴增的dna片段，野生型因被酶切而不能進入第二次pcr擴增，而突變型則能完整進入第二次pcr擴增並得到產物的富集。
Ⅳ 常用的基因突變檢測方法有哪些
1、焦磷酸測序法
測序法的基本原理是雙脫氧終止法，是進行基因突變檢測的可靠方法，也是使用最多的方法。但其過程繁瑣、耗時長，靈敏度不高，對環境和操作者有危害，故在臨床應用中存在一定的限制。
焦磷酸測序法適於對已知的短序列的測序分析，其可重復性和精確性能與SangerDNA測序法相媲美，而速度卻大大的提高。
焦磷酸測序技術產品具備同時對大量樣品進行測序分析的能力。為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進行單核苷酸多態性研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術操作平台。
2、微數字聚合酶鏈反應
該方法為將樣品作大倍數稀釋和細分，直至每個細分試樣中所含有的待測分子數不超過1個，再將每個細分試樣同時在相同條件下聚合酶鏈反應後，通過基因晶元逐個計數。該方法為絕對定量的方法。
3、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析技術
聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。該法一般用於檢測已知的突變位點。
因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。
由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到如今2013年，PCR已發展到第三代技術。1976年，台灣科學家錢嘉韻，發現了穩定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。
PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右）。
DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。
4、高效液相色譜法
該方法是基於發生錯配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特徵的差異而進行檢測的，可檢測出含有單個鹼基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段。
與測序法相比，該法簡單、快速，不僅可用於已知突變的檢測，還可用於未知突變的掃描。但只能檢查有無突變，不能檢測出突變類型，結果判斷容易出錯。
5、單鏈構象異構多態分析技術
依據單鏈DNA在某一種非變性環境中具有其特定的第二構象，構象不同導致電泳的遷移率不同，從而將正常鏈與突變鏈分離出來。與測序法相比，靈敏性更高。
Ⅳ 如何利用pcr進行定點突變以及如何檢測突變成功
如何利用pcr進行定點突變以及如何檢測突變成功
定點突變是先把突變位點設計在引物上（通常是接近引物中央），正反引物最好互補，然後通過普通PCR擴增前後兩個片段，膠回收。將兩個片段的回收產物混合，用重疊PCR擴增得到全長。這樣就通過在中間引物上設計突變的方式達到定點突變。採用重疊引物PCR介導的定點突變實驗是一種快速有效的在基因中特定位點引入特定突變的有效技術。該技術採用具有互補末端的引物，使PCR產物形成了重疊鏈, 從而在隨後的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。
Ⅵ 熒光定量pcr檢測點突變的原理
我們實驗室曾經通過熒光定量PCR的熔解曲線來檢測過SNP，單鹼基的變異也會影響熔解溫度的，不過對儀器要求很高，好像是羅氏的480
探針的話你也只可能檢測那一段的位置，如果你換了其他的突變你還是檢測不出啊
Ⅶ 如何通過基因晶元技術檢測點突變
基因晶元技術主要包括四個主要步驟：晶元制備、樣品制備、雜交反應和信號檢測和結果分析。
1、晶元制備-目前制備晶元主要以玻璃片或矽片為載體，採用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。晶元的制備除了用到微加工工藝外，還需要使用機器人技術。以便能快速、准確地將探針放置到晶元上的指定位置。
2、樣品制備-生物樣品往往是復雜的生物分子混合體，除少數特殊樣品外，一般不能直接與晶元反應，有時樣品的量很小。所以，必須將樣品進行提取、擴增，獲取其中的蛋白質或DNA、RNA，然後用熒游標記，以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。
3、雜交反應-雜交反應是熒游標記的樣品與晶元上的探針進行的反應產生一系列信息的過程。選擇合適的反應條件能使生物分子間反應處於最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配率。
4、信號檢測和結果分析-雜交反應後的晶元上各個反應點的熒光位置、熒光強弱經過晶元掃描儀和相關軟體可以分析圖像，將熒光轉換成數據，即可以獲得有關生物信息。 基因晶元技術發展的最終目標是將從樣品制備、雜交反應到信號檢測的整個分析過程集成化以獲得微型全分析系統（micro total analytical system）或稱縮微晶元實驗室（laboratory on a chip）。使用縮微晶元實驗室，就可以在一個封閉的系統內以很短的時間完成從原始樣品到獲取所需分析結果的全套操作。
四、基因晶元的應用及其商業價值
目前，基因晶元技術應用領域主要有基因表達譜分析、新基因發現、基因突變及多態性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預測、葯物篩選、基因測序等。另外基因晶元在農業、食品監督、環境保護、司法鑒定等方面都將作出重大貢獻。 基因晶元的飛速發展引起世界各國的廣泛關注和重視。
鑒於基因晶元的巨大潛力和誘人的前景，基因晶元已成為各國學術界和工業界研究和開發的熱點。尤其在美國，正處於人類基因組計劃以來的第二次浪潮之中，美國總統柯林頓在1998年1月的國情咨文中指出：「在未來的12年內，基因晶元將為我們一生的疾病預防指點迷津」。1998年6月29日美國宣布正式啟動基因晶元計劃，聯合私人投資機構投入了20億美元以上的研究經費。世界各國也開始加大投入，以基因晶元為核心的相關產業正在全球崛起，目前美國已有8家生物晶元公司股票上市，平均每年股票上漲75％，專家今統計：全球目前生物晶元工業產值為10億美元左右，預計今後5年之內，生物晶元的市場銷售可達到200億美元以上。美國財富雜志載文：在20世紀科技史上有兩件事影響深遠，一是微電子晶元，它是計算機和許多家電的心臟，它改變了我們的經濟和文化生活，並已進入每一個家庭；另一件事就是生物晶元它將改變生命科學的研究方式，革新醫學診斷和治療，極大地提高人口素質和健康水平。鑒於生物晶元技術具有巨大理論意義和實際價值，基因晶元研究在國內也有了很快的發展，例如，復旦大學、中科院上海冶金所、清華大學、聯合基因有限公司、軍事醫學科學院、中科院上海細胞所等單位已在生物晶元技術方面取得了較大突破，相信不久將有我國生產的生物晶元產品投放市場。
總之，以基因晶元為代表的生物晶元技術的深入研究和廣泛應用，將對21世紀人類生活和健康產生極其深遠的影響。
Ⅷ 如何用PCR的方法檢測已知點突變
我接觸國的點突變檢測方法包括：1、KASP、TaqMAN標記都是可以通過PCR區分點突變的。2，PCR產物測序。3，CEL I酶切，最早的突變篩選就是用的這酶。
Ⅸ 基因突變檢測方法
基因突變檢測方法：
1.
PCR-SSCP法是在非這性聚丙烯醯胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同構象，一個鹼基的改變將影響其構象而導致其在凝膠上的移動速度改變。其基本原理為單鏈DNA在中性條件下會形成二級結構，這種二級結構依賴於其鹼基組成，即使一個鹼基的不同，也會形成不同的二級結構而出刺同的遷移率。由於該法簡單快速，因而被廣泛用於未知基因突變的檢測。
2.
異源雙鏈分析法（HA）
HA法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA雙鏈。由於突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成一突起，在非變性凝膠中電泳時，會產生與相應的同源雙DNA不同的遷移率。該法與SSCP相似，所不同的是SSCP分離的是單鏈DNA，HA法分離的是雙鏈DNA，也只適合於小片段的分析。
3.
突變體富集PCR法（mutant-enriched
PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某個密碼子部位存在已知的限制性內切酶位點，如K-ras基因第12密碼子的BstNI位點，第13密古巴子有BgⅠⅡ位點。用鏈續二次的巢式PCR來擴增包括K-ras第12、13密碼子的DNA片段，在兩次擴增反應之間用相應的內切酶消化擴增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進入第二次PCR擴增，而突變型則能完整進入第二次PCR擴增並得到產物的富集。
Ⅹ 如何檢測基因的點突變
一種檢測等位基因點突變的方法是採用基因擴增技術，在擴增反應體系中的引物，一條是按常規設計的引物，另一條是在3』端第二位鹼基與目的基因對應的鹼基按不互補原則設計的特異引物。該方法可檢測等位基因的不同點突變，特異性強，敏感性高，操作簡便，使用的試劑價格低廉，實用性強，便於推廣。
