熒光ptpcr檢測方法是什麼

1. PCR,RT-PCR,實時熒光定量PCR的區別與聯系

1、所說的PCR應該就是最常規的PCR，以DNA為模板，通過上下游引物，實現DNA的擴增。

2、RT-PCR一般情況下是指反轉錄PCR（reverse transcription），盡管有些資料上說實時熒光定量PCR也（realtime fluores-cence quantitative PCR）也簡稱RT-PCR，但是這是不對的，不推薦。

基本操作過程是將所提取的RNA進行反轉錄，然後將所獲得的cDNA作為模板，設計引物進行擴增，是一種檢測基因表達的常用方法。

3、實時熒光定量PCR也就是Real-Time PCR，其最大的作用是檢測樣品中的初始DNA濃度。

至於三者的關系，RT-PCR和實時定量PCR應該都屬於PCR，在RNA實驗中，這二者都會應用到。

例如你要比較2個組織中的某基因的表達差異，首先你要提取2個組織的總RNA，然後通過RT-PCR檢測該基因是否在2個組織中有表達，然後通過實時定量PCR測定該基因在2個組織中的表達量是否具有顯著性差異。

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PCR原理

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據鹼基互補配對原則復製成同樣的兩分子拷貝。

在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。

耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發現對於PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，並逐步應用於臨床。

PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的「半保留復制鏈」，

而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

2. RT-PCR，QRT-PCR，real-timePCR之間什麼區別

PCR：一種快速的DNA復制方法,由變性--退火(復性）--延伸三個基本反應步驟構成。

RT-PCR：反轉錄PCR(reverse transcription-PCR)，是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA（cDNA），再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。

QRT-PCR在RT-PCR體系中同時加入內參標基因的引物，使目的基因和內參基因在同一條件下同時擴增。在擴增反映結束之後，可以通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行半定量分析，但分析的是PCR終產物，不能准確分析未經PCR信號放大之前的起始模板量。

real-time PCR：實時PCR(real-time PCR)屬於定量PCR（Q-PCR）的一種，以一定時間內DNA的增幅量為基礎進行DNA的定量分析。

Real-timePCR與reverse transcription PCR相結合，能用微量的RNA來找出特定時間細胞組織內的特別表達的遺傳基因。這兩種RT PCR的組合又被稱之為定量RT-PCR（QRT-PCR）。

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聚合酶鏈式反應是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。

PCR(聚合酶鏈式反應）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

3. RT-PCR的原理是什麼有何用途

原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，採用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。

該技術主要用於：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。

RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆轉錄PCR，是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。

首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用於檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。

用於反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對於短的不具有發卡結構的真核細胞mRNA，三種都可。

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反轉錄酶的選擇

1、Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。

2、禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。

3、Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩定性反轉錄酶：在Mn存在下，允許高溫反轉錄RNA，以消除RNA模板的二級結構。

4、MMLV反轉錄酶的RNase H突變體：商品名為SuperScript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA，這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。

4. RT-PCR是什麼

RT-PCR簡介
RT-PCR是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用於檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。使用天為時代公司的總RNA提取系統（如目錄號 DP405和DP406），所獲得的RNA的純度高，基因組DNA污染少，用於RT-PCR系統可得到滿意結果。用於反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對於短的不具有發卡結構的真核細胞mRNA，三種都可。

5. rt pcr的原理及步驟

原理：RT-PCR 為反轉錄RCR（reverse transcription PCR）和實時PCR（real timePCR）共同的縮寫.逆轉錄PCR,或者稱反轉錄PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR),是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形.在RT-PCR中,一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA,再以此為模板通過PCR進行DNA擴增.
步驟：（一）預變性：
破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級結構.使DNA充分變性,減少DNA 復雜結構對擴增的影響,以利於引物更好的和模板結合,特別是對於基因組來源的DNA模板,最好不要吝嗇這個步驟.此外,在一些使用熱啟動Taq酶的反應中,還可激活Taq酶,從而使PCR反應得以順利進行.
（二）變性--退火--延伸循環：
①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備；
②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；
③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按鹼基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈.（三）PCR儀擴增循環後72度延伸10分鍾。

6. rtpcr和實時熒光定量pcr區別是什麼

所說的PCR應該就是最常規的PCR，以DNA為模板，通過上下游引物，實現DNA的擴增。RTPCR一般情況下是指反轉錄PCRreverse，transcription，盡管有些資料上說實時熒光定量PCR也realtime，fluores，cencequantitativePCR也簡稱RTPCR，但是這是不對的，不推薦。

rtpcr和實時熒光定量pcr區別

基本操作過程是將所提取的RNA進行反轉錄，然後將所獲得的cDNA作為模板，設計引物進行擴增，是一種檢測基因表達的常用方法實時熒光定量PCR也就是RealTimePCR，其最大的作用是檢測樣品中的初始DNA濃度至於三者的關系，RTPCR和實時定量PCR應該都屬於PCR，在RNA實驗中，這二者都會應用到。

例如你要比較2個組織中的某基因的表達差異，首先你要提取2個組織的總RNA，然後通過RT-PCR檢測該基因是否在2個組織中有表達，然後通過實時定量PCR測定該基因在2個組織中的表達量是否具有顯著性差異。

7. RT-PCR檢測方法的具體步驟

RT-PCR檢測方法的具體步驟如下：

（一）RNA提取
1、根據標本數量分裝RLT液：從Kit中取出RLT液，用1.5mL離心管分裝，每管500μL（在體系配製區操作）。
2、在生物安全櫃內將采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養物（雞胚尿囊液或細胞培養液）取100μL加入RLT液管中，充分混勻。 3、每管分別加入5μL β-巰基乙醇，混勻後依次加入600μL 70%的乙醇，充分混勻。
4、從Kit中取出帶濾柱的2mL收集管，打開包裝將其做好標記。取步驟（3）中的混合液600μL加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。
5、濾柱仍放回收集管上，將步驟（3）剩餘的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。
6、於濾柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，離心15s。
7、從QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支幹凈的2mL收集管，將離心後的濾柱移到新的收集管上，於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，離心15s。
8、棄收集管中的離心液，再於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，離心2min。
9、將濾柱移到一個干凈的1.5mL eppendorf管上，向濾柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室溫靜置1~3min。
10、12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實驗或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之間加44mL無水乙醇。
（二）反應體系配製
1、實驗設計： 檢測標本RNA
陰性對照：無菌水（標本RNA提取時，跟標本同時提取無菌水。） 陽性對照：已知病毒RNA

2、PCR反應體系配製（在體系配製區配反應液） 1）按下表加入試劑： PCR反應體系
對每一個建立的反應確定反應數（n=擬進行的PCR管數，包括陰性，陽性對）。考慮到陰性無模板對照，陽性對照，誤差，制備過量的反應混合物是必要的。具體如下：
（1）如果包括對照，樣品的數量（n）為1到14，那麼N=n+1；
（2）如果包括對照，樣品的數量（n）大於15，那麼N=n+2。
2）將上述反應液混勻，分裝到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分別做好標記。

3）加RNA模板（在核酸提取區）
將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對照管（5μL無菌水），然後分別加標本RNA（每管5μL），最後加入陽性對照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反應
將上述加好模板的反應管混勻，短暫離心後放入PCR儀進行RT-PCR 擴增。

4、RT-PCR產物檢測
1）2.0％瓊脂糖凝膠制備：稱取2.0g Agarose，倒入耐熱玻璃瓶內，再加入電泳液（1×TBE）100mL，輕輕混勻後加熱，使Agarose完全熔化。待Agarose膠溫度降至50～60℃左右，加入核酸染料，輕輕混勻（不要產生氣泡）。待膠溫度降至50℃左右時，將其倒入制膠板，插好電泳梳子。待膠完全凝固（約30～60min）之後，將梳子拔出。
2）將制備好的電泳膠放入電泳槽（帶梳子孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TBE）浸過膠面即可。
3）PCR產物各取10μL，加入2μL上樣緩沖液（6×Loading Buffer），混勻後加入電泳膠孔內（先加Marker（DL－2000）5μL，然後依次加標本PCR產物，再加陰性對照，最後加陽性對照產物）。 4）電泳電壓100V，約30～40min後看結果。 5）將電泳膠放入凝膠成像系統觀察結果並照相。
5、結果判斷。

8. 與其他分子生物學方法相比,用熒光探針RT-PCR法檢測諾如病毒有什麼優勢

方法包括等溫核酸擴增（NASBA）、逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、熒光染料RT-PCR、熒光探針RT-PCR、多重RT-PCR等，是目前檢測諾如病毒應用最廣泛的方法，被稱為檢測諾如病毒的「金標准」。
NASBA直接擴增RNA來進行檢測，儀器相對簡便，通過瓊脂糖凝膠電泳、印跡雜交或者熒光檢測來鑒定結果，靈敏度低於RT-PCR；RT-PCR通過逆轉錄RNA模板、PCR擴增特異性產物，使用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定結果；熒光染料RT-PCR通過向RT-PCR反應體系中添加非特異性的熒光染料，可以在反應過程中監測擴增產物的生成量，但需要做熔解曲線分析來確定反應的特異性；熒光探針RT-PCR通過特異性的熒光探針與引物，可實時監控反應過程中特異性產物的變化，並且可以實現同一管中多個基因的檢測（多重），特異性較好，假陽性率低，檢測靈敏度可達10-100拷貝/反應，可用於取代普通RT-PCR。

9. 實時熒光定量PCR——RT-QPCR

目前實時熒光定量PCR已得到廣泛應用，如：擴增特異性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等......熒光定量PCR最常用的方法是DNA結合染料SYBR Green I 的非特異性方法和Taqman水解探針的特異性方法

SYBR Green I 的非特異性方法(試劑盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）

SYBR Green I是一種結合於所有dsDNA 雙螺旋 小溝區域的具有綠色 激發波長 的染料。在游離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合後，熒光大大增強。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，可以根據熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。

一、實驗前准備：

實驗試劑及耗材：

試劑：特異性PCR引物，新鮮提取備用的總RNA

試劑盒:Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler 480 SYBR Green I Master

1號管包含：

熱啟動Taq DNA Polymerase、反應緩沖液、dNTP mix、SYBR Green I染料、MgCI2

儀器及耗材：

羅氏LightCycler 480全自動實時定量PCR儀以及配套使用的48或96孔板；Thermo Scientific Arktik PCR儀、F1單道移液器、冰盒、QSP盒裝吸頭等

正式實驗開始前，冰上解凍各個試劑【注意：SYBR Green I Master 需要避光放置】

二、反轉錄

實驗操作時注意：所有RNA相關的操作均需要佩戴手套，防止RNase污染。嚴格按照試劑盒使用說明進行相關操作。

按照體系配方在冰上的Rnasefree的滅菌PCR管中配置Templateprimer mix，總體系13ul。本實驗是聯合使用anchored oligo dT引物和隨機六聚體引物進行的反轉錄。

(1)配製NTC對照：（總13ul）

水——10ul

oligo dT引物 ——1ul

隨機六聚體引物——2ul

混勻

（2）配製1、2、3、4號管：（總13ul）

總RNA（s1、s2、s3、s4）——1ul

oligo dT引物——1ul

隨機六聚體引物——2ul

水——9ul

混勻

【Note：可將總RNA的模板量適當調整至10ng—5ug，mRNA調整至1—100ng。若RNA樣品濃度較低，則可加入10ug/ml的MS2 RNA 來穩定模板RNA】

（3）將配好的反應mix在PCR儀中65℃變性10min，可有效減少RNA的二級結構。加熱後，迅速置於冰上製冷，放置5min

（4）在反應Templateprimer mix中分別加入以下試劑：

配製總mix（除了RNA模板和引物）

5X反轉錄酶buffer——24ul（4ulX6管）

dNTP mix ——12ul（2ulX6管）

40U/ul RNase抑制劑——3ul（0.5ulX6管）

20U/ul反轉錄酶——3ul（0.5ulX6管）

mix總體積——42ul（7ulX6管）

若樣品數量多，先配製反應mix再分裝到各個反應管，小心吹打混勻，切勿渦旋震盪。混勻後於微型離心機上離心，使樣品和離心管落至管底。

將離心管放置PCR儀中，根據使用的引物和目標RNA的長度進行程序設置：

25℃ 10min

55℃ 30min

85℃ 5min

最後置於冰上停止反應。

此反應產物可於2℃—8℃存放1—2h，或在﹣15℃至﹣25℃下存放更長時間。cDNA產物無需進行純化即可用於後續的PCR反應。20ul的PCR反應體系可取2—5ulcDNA反應產物進行擴增。此試劑盒中的反轉錄酶具有RNase H 活性，可以在cDNA合成之後去除RNA模板，減少其對後續PCR的影響

SYBR Green 反應體系的配製：

使用LightCycler 480 SYBR Green I Master使用進行基礎的絕對定量分析。

實驗設計：5個標准樣品（包含1個空白對照）

                    5個反轉錄樣品（包含1個NTC對照【Negative Template Control縮寫】）

由於樣本數較多，如下配置：

不含模板的總體系（594ul）—分裝為10管（每管55ul）—每管加入各自的模板（6ul）—每個樣分裝為3個復管（每管20ul）

按照體系配方配製：

2x Master mix （綠色蓋）——330ul（10ulX33）

10x Primer mix  —— 66ul（2ulX33）

PCR級別水（無色蓋）——198ul（6ulX33 ）

總體積 ——594ul

用移液槍輕柔吹打混勻，然後分裝為10管，每管55ul。

標准對照組:在各個管中分別加入各個樣品對應的調整好濃度的cDNA，空白對照加入6ul水代替模板，其餘加入6ul已經逐級稀釋好的標量模板。

反轉錄樣品組:分別加入6ul濃度調整好的模板DNA，包含NTC。

混勻後將每個樣按照20ul/孔分裝至96孔板中，用封口膜蓋好96孔板。將多孔板置於合適的離心機中室溫1500g配平離心2min，然後將准備好的96孔板放入羅氏LightCycler 480中

PCR程序設置與運行：

（1）雙擊打開LightCycler 480 Software release1.5.0SP4中登錄，自動進入軟體界面。

（2）點擊New Experiment

（3）設置反應體積（對於96孔板，反應體積為10ul—100ul）此次設置20ul

（4）在Program中輸入反應名稱preincubation，預備性設置一個循環，無需進行熒光收集

（5）點擊增加按鈕，輸入amplification，定義擴增循環的次數為445次，選擇熒光的收集功能Quantification

（6）設定PCR擴增循環的溫度與時間為95℃10s

（7）點擊增加按鈕，設定退火溫度為60℃10s

【6.7兩步 Analysis Mode默認None】

（8）設置延伸溫度和時間為72℃20s Acquisition Mode選擇Single

（9）設置溶解曲線，在program新的一行中輸入Melting curve，Acquisition Mode選擇Melting Curves 95℃ 5s，新增設置溫度，再點擊增加按鈕，65℃ 1min 以上兩步Acquisition Mode默認選擇None

（10）點擊增加按鈕，95℃ Acquisition Mode選擇Continuous ，其他設置無需改動

（11）設置保溫的過程cooling，1個循環，無需熒光，40℃ 1min

（12）設置完成後，點擊右方保存按鈕，保存設置的程序

（13）點擊start run，開始運行PCR反應，此時可在軟體上實時監測樣品擴增情況。

樣品編輯

（1）實驗結束，點擊Sample editor，進入樣本編輯程序

（2）在select Workflow中選擇ABs Quant進行絕對定量，根據樣本在板中的排布方式進行樣本編輯，設置陰性對照、空白對照、標准品等，在SELECT Sample中選擇樣品孔

（3）在Sample Name中輸入被選擇樣品名稱

（4）最後點擊make replicates設置復孔

（5）標准品設置時，需填寫拷貝數、稀釋倍數、初始濃度即可

（6）編輯好樣品後，可進行數據分析，如有需要，也可進行組間分析

結果分析

（1）點擊左下方的SUM，將顯示出所有信息，包括設置的反應程序、實驗結果分析等。

（2）點擊Analysis，可對已有的數據進行細致的分析

（3）點擊Abs Quant/2nd DerivativeMax，彈出Create new analysis窗口

（4）在Subset中選擇分析樣品的區域即可出現分析圖，相應樣品的擴增曲線

（5）Standard Curve是根據標准品得出的標准曲線，左側有擴增效率、斜率、截距、線性關系以及錯誤率 （一般error值越小，說明實驗准確率越高，擴增效率如果越接近「2」，說明這次的擴增反應越好）

（6）在數據表格，可顯示樣本的Cp值，以及相應的樣本濃度值，按復孔進行數據統計，顯示Cp平均值、方差，濃度的平均值以及方差