單克隆檢測方法

Ⅰ 單克隆抗體中兩次篩選分別是什麼方法

第二次篩選出能產生特異性抗體的雜交瘤細胞，用連續注射抗原，下面具體介紹一下：

1、在實際免疫過程中，由於採用連續注射抗原的方法，且一種抗原決定簇刺激機體形成相對應的一種效應B淋巴細胞，因此，從小鼠脾臟中取出的效應B淋巴細胞的特異性是不同的，經HAT培養液篩選的雜交瘤細胞特異性也存在差異，所以必須從雜交瘤細胞群中篩選出能產生針對某一預定抗原快定簇的特異性雜交瘤細胞；

2、通常採用有限稀釋克隆細胞的方法，將雜交瘤細胞多倍稀釋，接種在多孔的細胞培養板上，使每一孔含一個或幾個雜交瘤細胞（理論上30%的孔中細胞數為0時，才能保證有些孔中是單個細胞），再由這些單細胞克隆生長，最終選出分泌預定特異抗體的雜交細胞株進行擴大培養。

拓展資料：

單克隆抗體是由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。通常採用雜交瘤技術來制備，雜交瘤（hybridoma）抗體技術是在細胞融合技術的基礎上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。

參考資料：單克隆抗體網路：網頁鏈接

Ⅱ 如何用單克隆抗體進行疾病診斷

為研製一種特異性強、靈敏度高、操作簡便快速的甲胎蛋白（AFP）單克隆抗體酶聯免疫診斷試劑盒，用於定量檢測血清中的AFP。方法 將自行研製的AFP單克隆抗體（AFP-McAb）標記辣根過氧化物酶，AFP多抗（AFP-PcAb）包被微孔反應板，研製成AFP單克隆抗體酶聯免疫診斷試劑盒。血清中的AFP與包被於微孔板上的AFP多抗結合，再與AFP酶標抗體結合，在TMB底物液作用下形成肉眼可見的藍色。結果 該診斷試劑盒對305份臨床病人血清進行了檢測，結果與放射免疫法相比總符合率為98．6％；對215份臨床病人血清進行檢測，結果與化學發光法相比總符合率為99

Ⅲ 單克隆抗體技術怎樣鑒別植物病毒

運用細胞融合技術，將小鼠骨髓瘤細胞和小鼠脾細胞雜交，產生雜交瘤細胞。其增殖能力很強，可在體外連續培養產生抗體。選擇其中能產生某單一抗體的細胞株，所產抗體稱「單克隆抗體」。單克隆抗體靈敏度和專一性比多克隆抗體高，而且可以穩定地再繁殖，無需再用免疫動物，因此被廣泛應用於植物病毒等病原的檢測和鑒定。目前已有多種園藝花卉植物病毒的單克隆抗體應用於病毒的鑒定和檢測。

Ⅳ 單克隆抗體的純化技術操作步驟

從培養液或腹腔積液獲得的單克隆抗體，不需要純化即可應用於日常診斷或定性研究。如果用於免疫標記測定，須分離和純化。可用半飽和、飽和硫酸銨進行沉澱，進行初步濃縮和純化；可用親和層析法進一步純化。

一、腹水型單抗的純化

在單抗純化之前，一般均需對腹水進行預處理，目的是為了進一步除去細胞及其殘渣、小顆粒物質、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和過濾離心法，以前者處理效果為佳，而且操作簡便。

1、二氧化硅吸附法

新鮮採集的腹水（或凍存的腹水），2000r/min 15分鍾，除去細胞成分（或凍存過程中形成的固體物質）等；取上層清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥緩沖鹽水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀釋；然後以每10ml稀釋腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鍾，不時搖動；2000g離心20分鍾，脂質等通過該法除去，即可得澄清的腹水。

2、過濾離心法

用微孔濾膜過濾腹水，以除去較大的凝塊及脂肪滴；用10000g 15分鍾高速離心（4℃）除去細胞殘渣及小顆粒物質。

3、混合法

即上述兩法的組合，先將腹水高速離心，取上清液再用二氧化硅吸附處理。

二、單抗的粗提

1、硫酸銨沉澱法

（1）飽和硫酸銨溶液的配製

500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至完全溶解，室溫過夜，析出的結晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/L NaOH調PH至7.8。

（2）鹽析

吸取10ml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液5.0ml；繼續緩慢攪拌30分鍾；10000r/min離心15分鍾；棄去上清液，沉澱物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30分鍾，同法離心；重復前一步1-2次；沉澱物溶於1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl緩沖液中。

（3）脫鹽

常用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過Sephadex G-50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速每分鍾1ml。第一個蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋於2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分鍾，用蒸餾水清洗透析袋內外表面，再用蒸餾水煮透析袋10分鍾，冷至室溫即可使用（並可於0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存備用）。將鹽析樣品裝入透析袋中，對50-100倍體積的PBS或Tris-HCl緩沖液透析（4℃）12-24小時，其間更換5次透析液，用萘氏試劑（碘化汞11.5g，碘化鉀8g，加蒸餾水50ml，待溶解後，再加20% NaOH 50ml）檢測，直至透析外液無黃色物形成為止。

（4）蛋白質含量的測定

（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀釋倍數；或（Pr）=OD280×稀釋倍數/1.3

（5）分裝凍存備用

2、辛酸-硫酸銨沉澱法

該法簡單易行，適合於提純IgG1和IgG2b，但對IgG3和IgA的回收率及純化效果差。其主要步驟如下：取1份預處理過的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸緩沖液，用1mol/L HCl調PH至4.8；按每毫升稀釋腹水加11ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，於30分鍾內加完，4℃靜置2小時，取出15000g離心30分鍾，棄沉澱；上清經尼龍篩過濾（125um），加入1/10體積的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH調PH至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45%飽和度，作用30分鍾，靜置1小時；10000g離心30分鍾，棄上清；沉澱溶於適量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，對50-100倍體積的PBS透析，4℃過夜，其間換水3次以上；取出10000g離心30分鍾，除去不溶性沉渣，測定蛋白質含量後，分裝，凍存備用。

3、優球蛋白沉澱法

該法適用於IgG3和IgM型單抗的提取，所獲製品的抗體活性幾乎保持不變，對IgG3單抗的回收率高於90%，對IgM單抗的回收率為40-90%不等。其操作步驟如下：取一定量的預處理過的腹水，先後加入NaCl和CaCl2，使各自的濃度分別達0.2mol/L和25mmol/L，隨之可見纖維蛋白的產生；經濾紙過濾後，濾液對100倍體積的去離子水透析，4℃ 8-15小時（若是IgG3單抗，也可室溫2小時），其間換水1-2次；取出後22000g離心30分鍾，棄上清；將沉澱溶於PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重復上述的透析與離心；將沉澱的優球蛋白濃度調至5-10mg/ml，分裝凍存備用。

三、單抗純化的方法

單抗純化的方法有很多種，應根據具體單抗的特性和實驗條件選擇適宜的方法，常用的技術有DEAE離子交換層析柱、凝膠過濾法和親和層析法三種。

1、離子交換層析：

分離蛋白質是根據在一定pH 條件下，蛋白質所帶電荷不同而進行的分離方法。常用於蛋白質分離的離子交換劑有弱酸型的羧甲基纖維素(CM纖維素) 和弱鹼型的二乙基氨基乙基纖維素(DEAE纖維素)。前者為陽離子交換劑，後者為陰離子交換劑。

離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來

2、凝膠過濾法：

一定型號的凝膠網孔大小一定，只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內部，大分子則被排阻在外。洗脫時，大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小，小分子則在顆粒網狀結構中穿來穿去，歷程長，後洗脫下來，洗脫體積大。

缺點：從凝膠過濾的原理可知，蛋白質分子通過凝膠柱的速度(即洗脫體積的大小)並不直接取決於分子的質量，而是它的斯篤克半徑，利用凝膠過濾法測定蛋白質分子量時，標准蛋白質(已知分子量和斯篤克半徑)和待測蛋白質必須具有相同的分子形狀(接近球體)，否則不能得到比較准確的分子量。分子形狀為線形的或與凝膠能發生吸附作用的蛋白質，則不能用此方法測定分子量。而且柱子成本比較高，整個實驗過程耗時很長。

3、免疫親和層析法：

是利用生物體內存在的抗原、抗體之間高度特異性的親和力進行分離的方法。親和層析的應用主要是生物大分子的分離、純化。利用抗原、抗體之間高特異的親和力而進行分離的方法又稱為免疫親和層析。例如將抗原結合於親和層析基質上，就可以從血清中分離其對應的抗體。在蛋白質工程菌發酵液中所需蛋白質的濃度通常較低。

用離子交換、凝膠過濾等方法都難於進行分離，而親和層析法則是一種非常有效的方法。將所需蛋白質作為抗原，經動物免疫後制備抗體，將抗體與適當基質偶聯形成親和吸附劑，就可以對發酵液中的所需蛋白質進行分離純化。

Ⅳ 單克隆金標法和人絨毛膜促性腺激素哪個測懷孕准確性高

這個說法是有問題的哦.
我本身就是做試紙的.
實際上醫院使用的和你購買的就是同樣原理的試紙,都是檢測你的人絨毛膜促性腺激素(hcg),檢測出濃度,即有線,一般就表示懷孕了.
而你所謂的單克隆金標法指的是一種檢測方法,就是我們會把金顆粒標記到抗體上,來檢測你的人絨毛膜促性腺激素.
你的問題可能有三個原因,一是醫院的試紙有問題,失效了.二是你購買的的早孕試紙靈敏度過高,導致假陽性產生(常見!)特別是國內的一些小企業生產的試紙,抗體質量不好,或者技術不夠,又或者你有服用什麼葯物產生干擾都會發生這種情況.
第三個原因,也就是你購買的試紙,或者是驗孕棒是三根線的產品(國內少見).也就是一根控制線,一個對照線,一根檢測線.不論你是否懷孕,一定會出現兩根線:控制線和對照線.控制線用來表示產品運做正常,可以不去管它.對照線的作用僅僅是當你檢測出第三根線,也就是懷孕了的情況下,可以和對照線的濃度進行比較,判斷懷孕時間.可能越濃表示越久.是半定量的方法.
從經驗來說,如果已經過了三天。理論上檢測線有線的話應該很強了.
驗血的話就是直接檢測你血液中的激素含量,相當准確的.

Ⅵ 如何用elisa檢測單克隆抗體和底物的請合理

方法一：用於檢測未知抗原的雙抗體夾心法：1.包被：用0.05MPH9,碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml,在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4℃過夜.次日,棄去孔內溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鍾.2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時.然後洗滌.（同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔）.3.加酶標抗體：於各反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定後的稀釋度）0.1ml,37℃孵育0.1小時,洗滌.4.加底物液顯色：於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液0.1ml,37℃10～30分鍾.5.終止反應：於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml.6.結果判定：可於白色背景上,直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據所呈顏色的深淺,以「+」、「-」號表示.也可測OD值：在ELISA檢測儀上,於450nm（若以ABTS顯色,則410nm）處,以空白對照孔調零後測各孔OD值,若大於規定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性.方法二：用於檢測未知抗體的間接法：用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml,每孔加0.1ml,4℃過夜.次日洗滌3次.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml於上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌.（同時做空白、陰性及陽性孔對照）於反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml,37℃孵育30～60分鍾,洗滌,最後一遍用DDW洗滌.其餘步驟同「雙抗體夾心法」的4、5、6.

Ⅶ 單克隆挑不出如何解決（單克隆，轉染，細胞液，稀

你確定每孔1-2個細胞了嗎？分完孔當然要在鏡下確認每孔的細胞。

如果有細胞長不起來，有可能是折騰時間太久，細胞狀態不好了。
細胞還貼壁嗎？如果貼壁接換回液。

單克隆化沒什麼技巧。
單克隆熒光陽性細胞的挑選：熒光蛋白標記的細胞以熒光倒置顯微鏡和FACS檢測熒光細胞百分比，必要時重復轉染一次，有限稀釋法獲得熒光陽性單克隆：於96孔板中8孔為一組，每組除第一孔外其餘7孔每孔加入含15%FBS的IMDM50uL（無刻度巴斯德滴管1滴），第1孔中加入100uL細胞密度為1000個/mL的含15%FBS的IMDM，即100個/孔，（以排槍）自第1孔中吸取50ul，以後每孔依次做2：1倍比稀釋，丟棄最後1孔中吸出的50uL，常規培養數天~1周後於熒光顯微鏡下挑選eGFP＋單克隆並擴增。
這個方法可以確保一定有細胞生長，如果比例足夠，96孔板中至少有12~24個孔是有1個到2個細胞的，一般會有陽性孔。這種方法起始細胞數可以比較靈活，適合懶人。不象上面提及的經典方法，算得人頭暈。我也沒有去對過文獻，自己想的。

Ⅷ 求大神講解一下單克隆篩選的原理，最好通俗一點哈

謝邀！
細胞單克隆篩選
細胞單克隆篩選是根據細胞所具有的特性將單個細胞從混合的細胞樣品中分離出來的一種技術,是抗體制備細胞株優化、穩轉細胞株構建、葯物靶點篩選等應用中重要的一環,優質的單克隆細胞能夠更好地為不同領域科學研究和葯物研發提供支持。
通俗的講:就是將混合細胞通過3D列印技術（更精準高效）/直接用96孔板分離，此時一部分目標細胞就與其他細胞分離開來，經過篩選，得到目標細胞進行培養就能得到同種細胞了

Ⅸ 單克隆抗體的性質鑒定的方法有哪些

答案A 點撥：單克隆抗體是蛋白質，不是細胞，所以①不正確；其制備過程中至少有兩次篩選，一次是篩選出雜交瘤細胞，第二次是篩選出能產生特定抗體的雜交瘤細胞，所以②正確；由於是單個雜交瘤細胞無性繁殖產生的高度單一的抗體，所以叫單克隆抗體...

Ⅹ 如何篩選動物單克隆抗體

單克隆抗體制備過程中,總共有兩次篩選,第一次篩選出雜交瘤細胞,第二次篩選出能產生特異性抗體的雜交瘤細胞,兩次篩選的原理和方法是不相同的.
第一次篩選的原理與方法：細胞融合後,雜交瘤細胞的選擇性培養是第一次篩選的關鍵.普遍採用的HAT選擇性培養液是在普通的動物細胞培養液中加入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）.其依據是細胞中的DNA合成有兩條途徑：一條途徑是生物合成途徑（「D途徑」）,即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,為DNA分子的合成提供原料.在此合成過程中,葉酸作為重要的輔酶參與這一過程,而HAT培養液中氨基喋呤是一種葉酸的拮抗物,可以阻斷DNA合成的「D途徑」.另一條途徑是應急途徑或補救途徑（「S途徑」）,它是利用次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應的核苷酸,兩種酶缺一不可.因此,在HAT培養液中,未融合的效應B細胞和兩個效應B細胞融合的「D途徑」被氨基喋呤阻斷,雖「S途徑」正常,但因缺乏在體外培養液中增殖的能力,一般10d左右會死亡.對於骨髓瘤細胞以及自身融合細胞而言,由於通常採用的骨髓瘤細胞是次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶缺陷型（HGPRT）細胞,因此自身沒有「S途徑」,且「D途徑」又被氨基喋呤阻斷,所以在HAT培養液中也不能增殖而很快死亡.惟有骨髓瘤細胞與效應B細胞相互融合形成的雜交瘤細胞,既具有效應B細胞的「S途徑」,又具有骨髓瘤細胞在體外培養液中長期增殖的特性,因此能在HAT培養液中選擇性存活下來,並不斷增殖.
第二次篩選的原理和方法：在實際免疫過程中,由於採用連續注射抗原的方法,且一種抗原決定簇刺激機體形成相對應的一種效應B淋巴細胞,因此,從小鼠脾臟中取出的效應B淋巴細胞的特異性是不同的,經HAT培養液篩選的雜交瘤細胞特異性也存在差異,所以必須從雜交瘤細胞群中篩選出能產生針對某一預定抗原快定簇的特異性雜交瘤細胞.通常採用有限稀釋克隆細胞的方法,將雜交瘤細胞多倍稀釋,接種在多孔的細胞培養板上,使每一孔含一個或幾個雜交瘤細胞（理論上30%的孔中細胞數為0時,才能保證有些孔中是單個細胞）,再由這些單細胞克隆生長,最終選出分泌預定特異抗體的雜交細胞株進行擴大培養.