Ⅰ 單克隆抗體的制備技術路線和關鍵點
動物的選擇與免疫
1．動物的選擇 純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環境潔凈的實驗室均能飼養成活。目前開展雜交瘤技術的實驗室多選用純種BALA/C小鼠。
2．免疫方案 選擇合適的免疫方案對於細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb至關重要。一般在融合前兩個月左右根據確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應根據抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。
初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點）
↓3周後
第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）
↓3周後
第三次免疫 劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天後采血測其效價）
↓2～3周
加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內注射）
↓3天後
取脾融合
目前，用於可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎免疫可直接採用脾內注射。③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應答水平，增強免疫細胞對抗原的反應性。
（2）顆粒抗原免疫性強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細胞。
初次免疫 1×107/0.5ml ip
↓2～3周後
第二次免疫 1×107/0.5ml ip
↓3周後
加強免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv
↓
取脾融合
細胞融合
1．細胞融合前准備
（1）骨髓瘤細胞系的選擇：骨髓瘤細胞應和免疫動物屬於同一品系，這樣雜交融合率高，也便於接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內產生大量McAb。常用的骨髓瘤細胞系見表2-4。
表2-4用於融合試驗的主要骨髓瘤細胞系
名 稱
來 源
耐 受 葯 物
Ig鏈
H L
P3/X63-Ag8(X63)
BALB/C骨髓瘤MOPC-21
8-氮鳥嘌呤
r1 K
P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)
P3/X63-Ag8
8-氮鳥嘌呤
－ －
P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)
P3/X63-Ag8
8-氮鳥嘌呤
－ K（不分泌型）
P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)
（X63×BALB/C脾細胞）雜交瘤
8-氮鳥嘌呤
－ －
SP2/0-Ag14(SP2/0)
（X63×BALB/C脾細胞）雜交瘤
8-氮鳥嘌呤
－ －
F0
BALB/C骨髓瘤
8-氮鳥嘌呤
－ －
S194/5.XXO.BU.1
P3/X63-Ag8
5-溴脫氧尿嘧啶核苷
－ －
MPC11-45.6TG1.7
BALB/C骨髓瘤MPC-11
6-巰鳥嘌呤
r2b K
210.RCY3.Ag1.2.3
LOU大鼠骨髓瘤R210
8-氮鳥嘌呤
－ K
GM15006TG-A12
人骨髓瘤GM1500
6-巰鳥嘌呤
r1 K
U-266AR
人骨髓瘤U-266
8-氮鳥嘌呤
ε λ
骨髓瘤細胞的培養可用一般的培養液，如RPMI1640，DMEM培養基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當細胞處於對數生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現象，應定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。
（2）飼養細胞：在組織培養中，單個或少數分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它活細胞，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的這種細胞數被稱為飼養細胞。在制備McAb的過程中，許多環節 需要加飼養細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養過程中，加入飼養細胞是十分必要的。常用的飼養細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經放射線照射後作為飼養細胞。飼養細胞的量為一般為2×104或105細胞/孔。
2．細胞融合的步驟
（1）制備飼養細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。
與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周
↓
拉頸 處死，浸泡在75%酒精內，3～5min
↓
用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜
↓
用無菌注射器注入5～6ml預冷的培養液（嚴禁刺破腸管）
↓
反復沖洗，吸出沖洗液
↓
沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min
↓
用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養液混懸，調整細胞數至1×105/ml
↓
加入96孔板，100μl/孔
↓
放入37。c CO2孵箱培養
（2）制備免疫脾細胞
最後一次加強免疫3天後小鼠拉頸處死
↓
無菌取脾臟，培養液洗 一次
↓
脾臟研碎，過不銹鋼篩網
↓
離心，細胞用培養液洗2次
↓
計數
↓
取108脾淋巴細胞懸液備用
（3）制備骨髓瘤細胞
取對數生長骨髓瘤細胞離心
↓
用無血清培養液洗2次
↓
計數，取得×107細胞備用
（4）融合
①將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉澱略松動。
②90s內加入37℃預溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。
③加37。C預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。
④離心，800rpm, 6min。
⑤充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養液重懸。
⑥將上述細胞，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。
⑦將培養板置37℃、5%CO2培養箱中培養。
選擇雜交瘤細胞及抗體檢測
1．HAT選擇雜交瘤細胞 脾細胞和骨髓瘤細胞經PEG處理後，形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT選擇培養液中培養時，由於骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養液可以生長繁殖。
在用HAT選擇培養1～2天內，將有大量瘤細胞死亡，3～4天後瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養液維持7～10天後應換用HT培養液，再維持2周，改用一般培養液。在上述選擇培養期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養期間，一般每2～3天換一半培養液。
2．抗體的檢測 檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。
常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用於可溶性抗原、細胞McAb的檢測。（2）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）可用於可溶性抗原、細胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合於細胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉粘附雙層吸附試驗等。
雜交瘤的克隆化
雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經過HAT篩選後的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關抗體的分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開就需要克隆化。克隆化的原則是，對於檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。
克隆化的方法很多，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。
1．有限稀釋法克隆
（1）克隆前1天制備飼養細胞層（同細胞融合）。
2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養孔內輕輕吹乾，計數。
（3）調整細胞為3～10個細胞/ml。
（4）取頭天准備的飼養細胞層的細胞培養板，每孔加入稀釋細胞100μl。孵育於37℃、5%CO2孵箱中 。
（5）在第7天換液，以後每2～3天換液1次。
（6）8～9天可見 細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。
（7）將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養。
（8）每個克隆應盡快凍存。
2．軟瓊脂培養法克隆
（1）軟瓊脂的配製：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。
①1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。
②0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配製而成。置42℃保溫。
（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養細胞）15ml傾注於直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固後作為基底層備用。
（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配製需克隆的細胞懸液。
（4）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。
（5）混勻後立傾注於瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育於37℃、5%CO2孵箱中。
（6）4～5天 後即可見針尖大小白色克隆，7～10天後，直接移種至含飼養細胞的24孔中進行培養。
（7）檢測抗體，擴大培養，必要是地再克隆化。
雜交瘤細胞的凍存與復甦
1．雜交瘤細胞的凍存 及時凍存原始孔的雜交瘤細胞每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養過程中隨時可能發生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。
雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。
細胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養液；10%DMSO（二甲基亞碸）。
凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃後放入-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復甦，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩定性，在液氮中細胞可保存數年或更長時間。
2．細胞復甦方法 將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內使凍存的細胞解凍，將細胞用完全培養液洗滌兩次，然後移入頭天已制備好的飼養層細胞的培養瓶內，置37℃、5%CO2孵箱中培養，當細胞形成集落時，檢測抗體活性。
單克隆抗體的大量生產
大量生產單克隆抗體的方法主要有兩種：
（1）體外使用旋轉培養管大量培養雜交瘤細胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產量低，一般培養液內抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產，費用較高。
（2）體內接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。
①實體瘤法：對數生長期的雜交瘤細胞按1～3×107/ml接種於小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點。待腫瘤達到一定大小後（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達到1～10mg/ml。但采血量有限。
②腹水的制備：常規是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液體石蠟於BALB/C鼠，1～2周後腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天後可產生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水徵象，待腹水盡可能多，而小鼠頻於死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一隻小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復收集數次。腹水中單克隆抗體含量可達到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復甦後轉種小鼠腹腔則產生腹水塊、量多。
單克隆抗體的鑒定
對制備的McAb進行系統的鑒定是十分必要的，應做下述幾個方面的鑒定：
1．抗體特異性的鑒定 除用免疫原（抗原）進行抗體的檢測外，還應該用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應外，還應該用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應，其次是與其它細胞因子間有無交叉。
2．McAb的Ig類與亞類的鑒定 一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時已經基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至於亞類則需要用標准抗亞類血清系統作雙擴或夾心ELISA來確定。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG（3%），更有利於沉澱線的形成。
3．McAb中和活性的鑒定 用動物或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種於易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。
4．McAb識別抗原表位的鑒定 用競爭結合試驗，測相加指數的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。
5．McAb親合力的鑒定 用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親合力。
參考：http://www.foodmate.net/topic/163/3/34067.html
Ⅱ 如何找到高靈敏度的抗體
抗體的靈敏度跟很多因素相關，例如抗體本身的親和力就不太高，免疫的好壞，或者放久了降解等等因素。
僅就單抗和多抗來說，單抗的特異性較高，但是不能進行沉澱和凝集反應，所以很多檢測方法不能用單抗，單抗的反應強度也不如多抗。多抗的親和力比較好，但是特異性比較差。如果用幾株單抗組成單抗的復合體，那麼就可以得到特異性好，親和力高（靈敏度高）的抗體。
Ⅲ 單克隆抗體技術的程序
(1) 抗原制備。制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應 根據所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質不穩定，提純時易變性，或其免疫原性很強，或所需單抗是用於抗原不同組分的純化 或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與 免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定於所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。
(2) 免疫動物的選擇。根據所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源於BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來 源於LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一 般分泌抗體的能力不穩定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便於操作。
(3) 免疫程序的確定。免疫是單抗制備過程中的重要環節之一，其目的在於使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利於細胞融合形成雜交細胞，並增加獲得分泌特異性抗體的雜交 瘤的機會。因此在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免 疫程序能適用於各種抗原。現用的免疫程序中多數是參照制備常規多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內免疫法包括皮下注 射、腹腔或靜脈注射，也採用足墊、皮內、滴鼻或點眼。最後一次加強免疫多採用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇後者，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。 在最後一次加強免疫後第3天取脾融合為好，許多實驗室的結果表明，初次免疫和再次免疫應答反應中，取脾細胞與骨髓瘤細胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗 體。筆者體會陽性雜交瘤出現的高峰與小鼠血清抗體的滴度並無明顯的平行關系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿 母細胞，這在最後一次加強免疫後第3天取脾進行融合較適宜。已有人報道採用脾內免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應性，且節省時間，一般免疫3天後即可融合。 （1）雜交瘤細胞的凍存。在建立雜交瘤細胞的過程中，有時一次融合產生很多「陽性」孔，來不及對所有的雜交瘤細胞作進一步的工作，需要把其中一部分細胞凍存起來；另一方面，為了防 止實驗室可能發生的意外事故，如停電、污染、培養箱的溫度或CO2控制器失靈等給正在建立中的雜交瘤帶來災難，通常盡可能早地凍存一部分細胞作為種子，以 免遭到不測。在雜交瘤細胞建立以後，更需要凍存一大批，以備今後隨時取用。
（2）雜交瘤細胞的復甦。雜交瘤細胞、骨髓瘤細胞或其他細胞在液氮中保存，若無意外情況時，可保存數年至數十年。復甦時融解細胞速度要快，使之迅速通過最易受損的-5℃—0℃，以防細胞內形成冰晶引起細胞死亡。 ⑴ 單克隆性的確定 包括雜交瘤細胞的染色體分析、單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定和單抗純度鑒定等。
⑵ 單抗理化特性的鑒定。從實用意義上說，單抗對溫度和PH變化的敏感性以及單抗的親合力都是理化特性鑒定的主要項目，它們可為單抗的使用和保存提供重要依據。
⑶ 單抗與相應抗原的反應性測定。單抗與相應抗原的反應性決定於它所識別的抗原表位，確定單抗針對的表位在抗原結構上的位置，是單抗特性鑒定的關鍵環節，同時，進一步分析這類表位的差別， 可正確評價單抗的特異性和交叉反應性。
Ⅳ 你好！單抗制備中抗體檢測除了elisa還可以用wb檢測嗎！我們是想做檢測試劑盒用的！
抗體檢測要看你做什麼，以及做的是定性或定量。取兩對半乙肝，現在基本上做的是乙肝大三陽對（加上前SI抗原），這是一個質的，主要是為了檢測這三組全負，抗體和乙肝病毒攜帶者。全人口負，一般是盡快推薦的疫苗接種，因為這些人的機會感染了該病毒，超過一大群人的抗體。有抗體的人群中，一組人是比較安全的，但如果有與血液，並在對乙肝病毒攜帶者的一些點接觸，最好是做抗 - HBs的定量檢測。如果抗體滴度低，那麼我們就應該注意了，你可以去爭取防疫站助推器。如果你是攜帶病毒的人口（包括治療感染者），全科醫生會做一個定量的HBV DNA，病毒復制和感染窗口期，那麼，很可能會涉及到他們的器官，引起器質性病變的肝臟。還檢查肝功能也可用於進一步檢測乙肝病毒的肝受累存在或不存在。當檢查一般空腹抽，檢查肝功能在一起。以上就是我認為暫時的，可能是不完整的，但大概意思是這樣的。
乙型肝炎是重新我國發病率很高，所以我們應該引起重視。因為到目前為止一直沒能找到治癒乙肝，它只能部分地負。這些虛假廣告說徹底治癒乙肝是沒有意義的。
Ⅳ 單克隆抗體的純化方法有哪些
單克隆抗體技術(monoclonal antibody technique) 1975英科家MilsteinKohler所發明並獲1984諾貝爾醫獎 1984 德G. J. F.Kohler、阿根廷C. Milstein[3]丹麥科家N. K. Jerne由於發展單克隆抗體技術完善極微量蛋白質檢測技術享諾貝爾理醫獎 其原理: B淋巴細胞能夠產抗體 體外能進行限裂; 瘤細胞雖體外進行限傳代 能產抗體兩種細胞融合雜交瘤細胞具兩種親本細胞特性免疫反應類疾病具抵抗力重要素物體受抗原刺激產抗體抗體特異性取決於抗原決定簇各種抗原具抗原決定簇免疫物所產抗體實種抗體混合物用種傳統制備抗體效率低、產量限且物抗體注入體產嚴重敏反應外要些同抗體極困難近單克隆抗體技術現免疫領域重突破
Ⅵ 單克隆抗體時體內培養與體外培養各自的優缺點
（1） 動物體內生產單抗的方法
迄今為止,通常情況下均採用動物體內生產單抗的方法.
優點：該法操作簡便、經濟.
缺點：腹水中常混有小鼠的各種雜蛋白（包括Ig）,因此在很多情況下要提純後才能使用,而且還有污染動物病毒的危險,故而最好用SPF級小鼠.
（2） 體外培養生產單抗的方法
優點：單克隆抗體的濃縮和純化比較方便.
缺點：需要特殊設備.而且這種方法制備的單抗量極為有限,不適用於單抗的大規模生產.要想在體外大量制備單抗,就必須進行雜交瘤細胞的大量（高密度）培養.單位體積內細胞數量越多,細胞存活時間越長,單抗的濃度就越高,產量就越大.
Ⅶ 高中生物單克隆抗體實驗總結
考試是檢測學生學習效果的重要手段和方法，考前需要做好各方面的知識儲備。下面是我為大家整理的高中生物單克隆抗體實驗總結，希望對大家有所幫助!
高中生物單克隆抗體實驗總結
(一)動物的選擇
目前應用最廣的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠為好。就品系而言以Balb/c小白鼠應用最廣，由於所有的小白鼠骨髓瘤系均從Balb/c小白鼠系誘導出來。Balb/c系小白鼠必須用純系的，雌雄均可，以8~12周齡為宜。
大白鼠也可，能產生較多量的單抗體。現在已經在小鼠雜交瘤的基礎上，發展了小鼠-大鼠，小鼠-人以及人-人雜交瘤技術。
(二)免疫
一般而言，抗原的純度不很重要，特別是免疫原性較強的抗原。
免疫程序、劑量和方法是關繫到是否能得到所需要的單抗體的關鍵之一。
正常小鼠脾臟含有能產生各種不同抗體的B淋巴細胞，一隻純種小白鼠估計能產生1.0×107~5.0×107種不同的抗體。因此一隻正常的小白鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤融合，只能有千萬分之一的機會獲得某一種特定抗體。所以為了進步得到某種雜交瘤的機會，必須加強免疫，使產生特異性抗體的B淋巴細胞大量增加。
B淋巴細胞的不同發育階段對獲得陽性雜交瘤也有很大影響。有人以為處在轉化時期的B淋巴細胞可能更易於融合，而免疫以後7~8天，固然是抗體產生的高峰時期，但形成有活力的雜交瘤細胞的可能反而減少。故一般以為加強免疫後的第三天應殺鼠取脾做細胞融合。
1.可溶性抗原(蛋白質) 以1mg/ml～5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐劑乳化，分多點小鼠皮下注射，總量為0.3ml～0.6ml，間隔3～5周再同樣注射一次，10天後，斷尾取血一滴，測抗體效價，選滴度高的小鼠做融合試驗。一個月後可以經靜脈(尾靜脈)給予無佐劑抗原0.2ml～0.4ml，3～4天後，殺死小鼠取脾做融適用。
2.顆粒性抗原 如抗原來源方便，可以不加佐劑而增加免疫次數，縮短間隔時間。例如用羊紅血球免疫小白鼠，以1%濃度每隻皮下注射0.2ml，每周2次，共免疫5～8次，取脾前3天，再免疫一次即可。有人以為最後一次免疫劑量要大，大到近於免疫耐受的程度更好。
單抗技術是主要由抗原制備，免疫動物，細胞融合，篩選雜交瘤細胞，克隆化培養，單克隆抗體的大量制備與鑒定等一系列實驗組成的實驗系統，其核心部分是細胞融合。細胞融合是單克隆抗體技術的中心環節，基本步驟是將脾細胞和骨髓瘤細胞混合後加入PEG使細胞彼此融合。
實驗原理:B淋巴細胞能夠產生抗體，但在體外不能進行無限分裂;而骨髓瘤細胞可以在體外無限傳代，但不能產生抗體。將這兩種細胞融合後，用一特殊選擇培養基(HAT)阻斷正常細胞或自體融合細胞的DNA合成通路，而雜交瘤細胞可利用補救通路合成DNA得以生存，且既能產生抗體，又能無限增殖，並以此生產抗體的技術。
實驗方法
材料：Balb/c小鼠，SP2/0骨髓瘤細胞，50%PEG，不完全培養液，HAT培養液，75%酒精，剪刀，鑷子，紗布，離心管，網篩，大小瓶 皿，直頭滴管，彎頭滴管，瓶塞，培養瓶蓋，離心管蓋，燒杯(加入37℃水)，泡沫板，大頭針，96孔培養板，計時器，顯微鏡，計數板等。
單克隆抗體技術方法：
顯微鏡下觀察血片或骨髓片，找出異常細胞。
(1)飼養細胞的制備
1.常用Balb/c小鼠，拉頸處死，浸泡於75%酒精內，3～5min。
2.用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜，剪一小口，用滴管注入5～6ml不完全培養液(嚴禁刺破腸管)。
3.反復沖洗，將沖洗液吸入15ml離心管，1000rpm5min離心，用完全培養液混懸，調整細胞密度。
(2)SP2/0骨髓瘤細胞的制備
1.選取狀態良好、處於對數生長期的SP2/0骨髓瘤細胞。
2.棄去原瓶中培養上清，用不完全培養液沖洗三遍。
3.再以不完全培養液對細胞進行充分吹打，得到的細胞懸液移入15ml離心管。
4.細胞計數。
(3)脾細胞的制備
1.3天前加強免疫的小鼠，摘眼球取血後，拉頸處死，75%酒精浸泡3～5min。
2.將小鼠固定於泡沫板上，打開腹腔，取出脾臟，用不完全培養液反復沖洗。
3.在平皿中的網篩中，用鑷子夾取脾臟進行反復研磨，邊磨邊滴加不完全培養液，直到脾細胞單個化，將細胞懸液轉入15ml離心管中。
4.細胞計數。根據兩種細胞計數結果，調整懸液用量，配平之後(SP2/0細胞與脾細胞數量比值在1：5～1：10之間)，以1000rpm5min離心。
5.棄上清，每管加入5ml不完全培養液，吹打混勻後合並於同一15ml離心管中，再次以1000rpm5min。
6.離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。
(4)細胞融合
1.前面步驟所得到的細胞沉澱，輕彈離心管管底，使其呈糊狀。
2.在37℃水浴中，輕輕振盪，一邊緩緩加入1mlPEG，邊加邊搖，PEG於1min內加完。
3.加完PEG之後，將懸液在37℃水浴中靜置1min。
4.繼續在37℃水浴中，邊搖邊加入不完全培養液2ml，於2min內加完。
5.慢慢加入不完全培養液，800rpm，8min。
6.棄上清，加入含1%HAT、20%FCS的培養液，輕輕混勻。
(5)在96孔細胞培養板中加入飼養細胞上清，1滴/孔;之後加入融合細胞懸液，1滴/孔。
(6)鏡下觀察96孔板中細胞情況，CO2孵箱中培養。
Ⅷ 如何提高單抗小鼠腹水產量
1、單抗的大規模製備
目前大量制備單抗的方法主要有兩大系統，一是動物體內生產法，這是國內外實驗室所廣泛採用；另一是體外培養法。
（1）動物體內生產單抗的方法
迄今為止，通常情況下均採用動物體內生產單抗的方法，鑒於絕大多數動物用雜交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤細胞與同品系的脾細胞融合而得，因此使用的動物當然首選BALB/c小鼠。本方法即將雜交瘤細胞接種於小鼠腹腔內，在小鼠腹腔內生長雜交瘤，並產生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高。可見該法操作簡便、經濟，不過，腹水中常混有小鼠的各種雜蛋白（包括Ig），因此在很多情況下要提純後才能使用，而且還有污染動物病毒的危險，故而最好用SPF級小鼠。
（2）體外培養生產單抗的方法
總體上講，雜交瘤細胞系並不是嚴格的貼壁依賴細胞（anchoragedependentcell，ADC），因此既可以進行單層細胞培養，又可以進行懸浮培養。雜交瘤細胞的單層細胞培養法是各個實驗室最常用的手段，即將雜交瘤細胞加入培養瓶中，以含10-15%小牛血清的培養基培養，細胞濃度以1×106-2×106/ml為佳，然後收集培養上清，其中單抗含量約10-50ug/ml。顯然，這種方法制備的單抗量極為有限，無疑是不適用於單抗的大規模生產。要想在體外大量制備單抗，就必須進行雜交瘤細胞的大量（高密度）培養。單位體積內細胞數量越多，細胞存活時間越長，單抗的濃度就越高，產量就越大。
