檢測組織中的肽和蛋白質的方法

❶ 怎樣檢測生物組織中的糖類，脂肪和蛋白質

糖類中還原糖(例葡萄糖、果糖、麥芽糖等)可用斐林試劑檢測。先准備組織樣液，再准備0·1g/ml的氫氧化鈉溶液、0.05g/ml硫酸銅溶液。方法步驟:1.(1)取2ml組織樣液加入1支潔凈的試管。
(2)再另取2支試管，分別加入2mlNaOH與硫酸銅溶液，再把硫酸銅溶液倒入氫氧化鈉溶液的試管，振盪混合均勻，即為斐林試劑。
(3)把新配製的斐林試劑與組織樣液,等體積混合，振盪搖勻，然後放入50~60度水浴中保溫，觀察顏色變化。如出現磚紅色沉澱，即說明有還原糖。
非還原糖(澱粉用碘液檢測即可)碘遇澱粉變藍。
脂肪用蘇丹三或蘇丹四檢測，材料可用浸泡過"的花生種子，先製成臨時裝片，再用顯微鏡觀察。或者把試劑滴加到組織樣液中，觀察顏色變化。
臨時裝片製作:用刀片先在花子葉切開，然後做徒手切片，放在清水中，然後用毛筆蘸取最薄的一片放在載玻片中央，滴加蘇丹三溶液染色3到5分鍾，用吸水紙吸取多餘染液，再用體積分數為50%酒精洗去浮色，蓋上蓋玻片。放在顯微鏡下觀察。脂肪粒被蘇丹三染成橘黃色、蘇丹四染成紅色。(上述徒手切片做不好，可在花生子葉上
刮取少量粉末，直接塗在載玻片上來替代。

蛋白質用雙縮脲試劑來檢測。雙縮脲是由A液(0.1g/ml的氫氧化鈉)、B液(O.01g/mL的硫酸銅溶液組成。)
使用時取組織樣液(用蛋清稀釋液或豆漿)一2mL加入潔凈試管，然後先滴加1mLA液，振盪試管搖勻，再滴加3~4滴硫酸銅溶液，搖勻。蛋白質遇雙縮脲生成紫色。

❷ 生葯中氨基酸，肽類及蛋白質類常用檢查方法有哪些

①.氨基酸：
a.分光光度法：只有絡氨酸和苯丙氨酸對紫外線有吸收，氨基酸與衍生物反 應生成有色物質，常用的衍生物是：茚三酮、乙醯丙酮-甲醛。
b.氣象色譜法：將氨基酸衍 生為易氣化的物質，利用氣態樣品中各組成在兩相中的分配系數不同進行分析，常用的有硅 烷化、酯化、醯化等方法。
c.液相色譜法。
②.肽鏈：
a.N-末端降解法。
b.高效液相色譜法。
c.毛細管電泳技術。
d.C-末端酶解法。
③.蛋白質：
a.凱氏定氮法：樣品與濃硫酸共熱，有機物則分解產生NH 3 ，與H 2 SO 4 作用產生 （NH 4 ） 2 SO 4 。經強鹼鹼化後，分解釋放NH 3 蒸到溶液中，計算其含量。
b.雙縮脲法： （NH 4 ） 2 SO 4·Tris 緩沖液，在強鹼溶液中，雙縮脲與 CuSO 4 形成絡合物。
c.Tolin 酚法：與雙 縮脲原理相似。
d.考馬斯亮藍反應：蛋白質與染料結合測定吸光值。

❸ 一般採用什麼方法檢驗蛋白質即鑒定

一般用雙縮脲試劑鑒定，雙縮脲試劑可以和蛋白質發生紫色反應。

❹ 蛋白的常用蛋白鑒定方法

傳統的蛋白鑒定方法，如免疫印跡法、內肽的化學測序、已知或未知蛋白comigration分析，或者在一個有機體中有意義的基因的過表達通常耗時、耗力，不適合高流通量的篩選。目前，所選用的技術包括對於蛋白鑒定的圖象分析、微量測序、進一步對肽片段進行鑒定的氨基酸組分分析和與質譜相關的技術。 「滿天星」式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺，每一個圖象上斑點的上調、下調及出現、消失，都可能在生理和病理狀態下產生，必須依靠計算機為基礎的數據處理，進行定量分析。在一系列高質量的2-DE凝膠產生(低背景染色，高度的重復性)的前提下，圖象分析包括斑點檢測、背景消減、斑點配比和資料庫構建。
首先，採集圖象通常所用的系統是電荷耦合CCD(charge coupled device)照相機;激光密度儀(laser densitometers)和Phospho或Fluoro imagers，對圖象進行數字化。並成為以象素(pixels)為基礎的空間和網格。
其次，在圖象灰度水平上過濾和變形，進行圖象加工，以進行斑點檢測。利用Laplacian，Gaussian，DOG(difference of Gaussians) opreator使有意義的區域與背景分離，精確限定斑點的強度、面積、周長和方向。
圖象分析檢測的斑點須與肉眼觀測的斑點一致。在這一原則下，多數系統以控制斑點的重心或最高峰來分析，邊緣檢測的軟體可精確描述斑點外觀，並進行邊緣檢測和鄰近分析，以增加精確度。通過閾值分析、邊緣檢測、銷蝕和擴大斑點檢測的基本工具還可恢復共遷移的斑點邊界。以PC機為基礎的軟體Phoretix-2D正挑戰古老的Unix為基礎的2-D分析軟體包。
第三，一旦2-DE圖象上的斑點被檢測，許多圖象需要分析比較、增加、消減或均值化。由於在2-DE中出現100%的重復性是很困難的，由此凝膠間的蛋白質的配比對於圖象分析系統是一個挑戰。IPG技術的出現已使斑點配比變得容易。因此，較大程度的相似性可通過斑點配比向量演算法在長度和平行度觀測。用來配比的著名軟體系統包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，計算機方法如相似性、聚類分析、等級分類和主要因素分析已被採用，而神經網路、子波變換和實用分析在未來可被採用。配比通常由一個人操作，其手工設定大約50個突出的斑點作為「路標」，進行交叉配比。之後，擴展至整個膠。
例如：精確的PI和MW(分子量)的估計通過參考圖上20個或更多的已知蛋白所組成的標准曲線來計算未知蛋白的PI和MW。 在凝膠圖象分析系統依據已知蛋白質的pI值產生PI網路，使得凝膠上其它蛋白的PI按此分配。所估計的精確度大大依賴於所建網格的結構及標本的類型。已知的未被修飾的大蛋白應該作為標志，變性的修飾的蛋白的PI估計約在±0。25個單位。 同理，已知蛋白的理論分子量可以從資料庫中計算，利用產生的表觀分子量的網格來估計蛋白的分子量。 未被修飾的小蛋白的錯誤率大約30%，而翻譯後蛋白的出入更大。 故需聯合其他的技術完成鑒定。 蛋白質的微量測序已成為蛋白質分析和鑒定的基石，可以提供足夠的信息。盡管氨基酸組分分析和肽質指紋譜(PMF)可鑒定由2-DE分離的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是進行鑒定的主要技術。目前已實現蛋白質微量測序的自動化。 首先使經凝膠分離的蛋白質直接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上，染色、切割，然後直接置於測序儀中，可用於subpicomole水平的蛋白質的鑒定。 但有幾點需注意：Edman降解很緩慢，序列以每40 min 1個氨基酸的速率產生;與質譜相比，Edman降解消耗大;試劑昂貴，每個氨基酸花費3～4$。 這都說明泛化的Edman降解蛋白質不適合分析成百上千的蛋白質。然而，如果在一個凝膠上僅有幾個有意義的蛋白質，或者如果其他技術無法測定而克隆其基因是必需的，則需要進行泛化的Edman降解測序。
近來，應用自動化的Edman降解可產生短的N-末端序列標簽，這是將質譜的序列標簽概念用於Edman降解，業已成為一種強有力的蛋白質鑒定。當對Edman的硬體進行簡單改進，以迅速產生N-末端序列標簽達10～20個/d，序列檢簽將適於在較小的蛋白質組中進行鑒定。若聯合其他的蛋白質屬性，如氨基酸組分分析、肽質質量、表現蛋白質分子量、等電點，可以更加可信地鑒定蛋白質。選擇BLAST程序，可與資料庫相配比。目前，採用一種Tagldent的檢索程序，還可以進行種間比較鑒定，又提高了其在蛋白質組研究中的作用。 質譜已成為連接蛋白質與基因的重要技術，開啟了大規模自動化的蛋白質鑒定之門。用來分析蛋白質或多肽的質譜有兩個主要的部分，(1)樣品入機的離子源，(2)測量被介入離子的分子量的裝置。
首先是基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)為一脈沖式的離子化技術。它從固相標本中產生離子，並在飛行管中測其分子量。
其次是電噴霧質譜(ESI-MS)，是一連續離子化的方法，從液相中產生離子，聯合四極質譜或在飛行時間檢測器中測其分子量。
在MALDI-TOF中，最重要的進步是離子反射器(ion reflectron)和延遲提取(delayed ion extraction)，可達相當精確的分子量。在ESI-MS中，納米級電霧源(nano-electrospray source)的出現使得微升級的樣品在30～40 min內分析成為可能。
將反相液相色譜和串聯質譜(tandem MS)聯用，可在數十個picomole的水平檢測;若利用毛細管色譜與串聯質譜聯用，則可在低picomole到高femtomole水平檢測;當利用毛細管電泳與串聯質譜連用時，可在小於femtomole的水平檢測。甚至可在attomole水平進行。目前多為酶解、液相色譜分離、串聯質譜及計算機演算法的聯合應用鑒定蛋白質。下面以肽質指紋術和肽片段的測序來說明怎樣通過質譜來鑒定蛋白質。
(1)肽質指紋術
由Henzel等人於1993年提出。用酶(最常用的是胰酶)對由2-DE分離的蛋白在膠上或在膜上於精氨酸或賴氨酸的C-末端處進行斷裂，斷裂所產生的精確的分子量通過質譜來測量(MALDI-TOF-MS，或為ESI-MS)，這一技術能夠完成的肽質量可精確到0。1個分子量單位。所有的肽質量最後與資料庫中理論肽質量相配比(理論肽是由實驗所用的酶來「斷裂」蛋白所產生的)。配比的結果是按照資料庫中肽片段與未知蛋白共有的肽片段數目作一排行榜，「冠軍」肽片段可能代表一個未知蛋白。若冠亞軍之間的肽片段存在較大差異，且這個蛋白可與實驗所示的肽片段覆蓋良好，則說明正確鑒定的可能性較大。
(2)肽片段的部分測序
肽質指紋術對其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白質。為進一步鑒定蛋白質，出現了一系列的質譜方法用來描述肽片段。用酶或化學方法從N-或C-末端按順序除去氨基酸，形成梯形肽片段(ladder peptide)。
首先以一種可控制的化學模式從N-末端降解，可產生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定數目的肽質量由MALDI-TOF-MS測量。另一種方法涉及羧基肽酶的應用，從C-末端除去不同數目的氨基酸形成肽片段。化學法和酶法可產生相對較長的序列，其分子量精確至以區別賴氨酸和谷氨醯胺。或者，在質譜儀內應用源後衰變(post-source decay，PSD)和碰撞誘導解離(collision-inced dissociation，CID)，目的是產生包含有僅異於一個氨基酸殘基質量的一系列肽峰的質譜。因此，允許推斷肽片段序列。 肽片段PSD的分析在MALDI反應器上能產生部分序列信息。首先進行肽質指紋鑒定。 之後，一個有意義的肽片段在實驗儀器質譜儀被選作「母離子」，在飛行至離子反應器的過程中降解為「子離子」。在反應器中，用逐漸降低的電壓可測量至檢測器的不同大小的片段。但經常產生不完全的片段。現在用肽片段來測序的方法始於70年代末的CID，可以一個三聯四極質譜ESI-MS或MALDI-TOF-MS聯合碰撞器內來完成。在ESI-MS中，由電霧源產生的肽離子在質譜儀的第一個四極質譜中測量，有意義的肽片段被送至第二個四極質譜中，惰性氣體轟擊使其成為碎片，所得產物在第三個四極質譜中測量。與MALDI-PSD相比，CID穩定、強健、普遍，肽離子片段基本沿著醯胺鍵的主架被轟擊產生梯形序列。 連續的片段間差異決定此序列在那一點的氨基酸的質量。由此，序列可被推測。由CID圖譜還可獲得的幾個序列的殘基，叫做「肽序列標簽」。這樣，聯合肽片段母離子的分子量和肽片段距N- C端的距離將足以鑒定一個蛋白質。 1977年首次作為鑒定蛋白質的一種工具，是一種獨特的「腳印」技術。利用蛋白質異質性的氨基酸組分特徵，成為一種獨立於序列的屬性，不同於肽質量或序列標簽。Latter首次表明氨基酸組分的數據能用於從2-DE凝膠上鑒定蛋白質。 通過放射標記的氨基酸來測定蛋白質的組分，或者將蛋白質印跡到PVDF膜上，在155℃進行酸性水解1 h，通過這一簡單步驟的氨基酸的提取，每一樣品的氨基酸在40min內自動衍生並由色譜分離，常規分析為100個蛋白質/周。依據代表兩組分間數目差異的分數，對資料庫中的蛋白質進行排榜，「冠軍」蛋白質具有與未知蛋白質最相近的組分，考慮冠亞軍蛋白質分數之間的差異，僅處於冠軍的蛋白質的可信度大。Internet上存在多個程序可用於氨基酸組分分析，如AACompIdent，ASA，FINDER，AAC-PI，PROP-SEARCH等，其中，在PROP-SEARCH中，組分、序列和氨基酸的位置被用來檢索同源蛋白質。 但仍存在一些缺點，如由於不足的酸性水解或者部分降解會產生氨基酸的變異。故應聯合其他的蛋白質屬性進行鑒定。

❺ 怎樣檢測生物組織中的蛋白質

蛋白質的鑒定原理:鑒定生物組織中是否含有蛋白質時，常用雙縮脲法，使用的是雙縮脲試劑。雙縮脲試劑的成分是質量濃度為0.1 g／mL的氫氧化鈉溶液和質量濃度為0.01 g／mL的硫酸銅溶液。在鹼性溶液(NaOH)中，雙縮脲(H2NOC—NH—CONH2)能與Cu2+作用，形成紫色或紫紅色的絡合物，這個反應叫做雙縮脲反應。由於蛋白質分子中含有很多與雙縮脲結構相似的肽鍵，因此，蛋白質可與雙縮脲試劑發生顏色反應。

用於鑒定還原糖的實驗材料准備植物組織是常用的實驗材料，但必須加以選擇。在雙子葉植物中，光合作用的主要產物葡萄糖形成後，合成為澱粉，暫時儲藏在葉子內，因此最好不用雙子葉植物的葉子作實驗材料。有些單子葉植物，如韭菜、鳶尾，並不將光合作用的初始產物轉變為澱粉，因此葉內含有大量的可溶性單糖，但是，由於葉片中葉綠素的顏色較深，對於鑒定時的顏色反應起著掩蓋作用，導致實驗現象不明顯，因此，也不宜用單子葉植物的葉子作實驗材料。

本實驗最理想的實驗材料是還原糖含量較高的植物組織(或器官)，而且組織的顏色較淺或近於白色的，如蘋果和梨的果實。經試驗比較，顏色反應的明顯程度依次為蘋果、梨、白色甘藍葉、白蘿卜。

❻ 常用來測定蛋白質含量的方法有哪些優缺點是什麼

1、凱氏定氮法

凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然後在鹼性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來並為過量的硼酸液吸收，再以標准鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。

由於蛋白質含氮量比較恆定，可由其氮量計算蛋白質含量，故此法是經典的蛋白質定量方法。

優點：可用於所有食品的蛋白質分析中；操作相對比較簡單；實驗費用較低；結果准確，是一種測定蛋白質的經典方法；用改進方法（微量凱氏定氮法）可測定樣品中微量的蛋白質。

缺點：凱氏定氮法只是一個氧化還原反應,把低價氮氧化並轉為氨鹽來測定,而不能把高價氮還原為氮鹽的形式,所以不可以測出物質中所有價態的氮含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是一個用於鑒定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑是一個鹼性的含銅試液，呈藍色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配製。

當底物中含有肽鍵時（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應蛋白質單位1-10mg。

優點：測定速度較快，干擾物質少，不同蛋白質產生的顏色深淺相近。

缺點：①靈敏度差； ② 三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會干擾該反應。

3、酚試劑法

取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

優點：靈敏度高，對水溶性蛋白質含量的測定很有效。

缺點：①費時，要精確控制操作時間；②酚法試劑的配製比較繁瑣。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

優點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定後能回收。 

缺點：①測定蛋白質含量的准確度較差，專一性差； ②干擾物質多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。

5、考馬斯亮藍法

考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合後，其對可見光的最大吸收峰從 465nm 變為 595nm。

在考馬斯亮藍 G-250 過量且濃度恆定的情況下，當溶液中的蛋白質濃度不同時，就會有不同量的考馬斯亮藍 G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉變有一定的數量關系。

一般情況，當溶液中的蛋白質濃度增加時，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用考馬斯亮藍 G-250 顯色法來測定溶液中蛋白質的含量。

優點：靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡合劑的影響，適合大量樣品的測定。

缺點：由於各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用於不同蛋白質測定時有較大的偏差。

❼ 如何檢測生物組織中的糖類，脂肪，和蛋白質

一．實驗目的：嘗試用化學試劑檢測生物組織中糖類、脂肪和蛋白質
二．實驗原理：某些化學試劑能使生物組織中的有關有機化合物,產生特定的顏色反應.
1．可溶性還原糖（如葡萄糖、果糖、麥芽糖）與斐林試劑發生作用,可生成磚紅色的Cu 2O沉澱.即Cu ( OH ) 2被還原成Cu 2O,葡萄糖被氧化成葡萄糖酸.
2．脂肪可以被蘇丹Ⅲ染液染成橘黃色（或被蘇丹Ⅳ染液染成紅色）.
3．蛋白質與雙縮脲試劑發生作用,產生紫色反應.（蛋白質分子中含有很多肽鍵,在鹼性NaOH溶液中能與雙縮脲試劑中的Cu2+作用,產生紫色反應.）
4.澱粉遇碘變藍色.
三．實驗材料
1．做可溶性還原性糖鑒定實驗,應選含糖高,顏色為白色的植物組織,如蘋果、梨.（因為組織的顏色較淺,易於觀察.）
2．做脂肪的鑒定實驗.應選富含脂肪的種子,以花生種子為最好,實驗前一般要浸泡3-4小時（也可用蓖麻種子）.
3．做蛋白質的鑒定實驗,可用富含蛋白質的黃豆或雞蛋清.
四、實驗試劑
斐林試劑（包括甲液：質量濃度為0.1g/ mL NaOH溶液和乙液：質量濃度為0.05g/ mL CuSO4溶液）、蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ染液、雙縮脲試劑（包括A液：質量濃度為0.1g/ mL NaOH溶液和B液：質量濃度為0.01g/ mL CuSO4溶液）、體積分數為50%的酒精溶液,碘液、蒸餾水.
五、方法步驟：
（一） 可溶性糖的鑒定
1.制備組織樣液.
蘋果或梨組織液必須臨時制備，因蘋果多酚氧化酶含量高,組織液很易被氧化成褐色,將產生的顏色掩蓋.
2.注入2mL組織樣液.
3.注入1mL新制的斐林試劑,振盪.
（現配現用、先混後加）
應將組成斐林試劑的甲液、乙液分別配製、儲存,使用前才將甲、
乙液等量混勻成斐林試劑；切勿將甲液、乙液分別加入蘋果組織樣液中進行檢測.
斐林試劑很不穩定,甲、乙液混合保存時,生成的Cu ( OH ) 2在70-900C下分解成黑色CuO和水；甲、乙液分別加入時可能會與組織樣液發生反應,無
Cu ( OH ) 2生成.
4.水浴加熱：試管放在盛有50-650C溫水的大燒杯中,加熱約2分鍾,觀察到溶液顏色：淺藍色 → 棕色 → 磚紅色（沉澱）
最好用試管夾夾住試管上部,使試管底部不觸及燒杯底部,試管口不朝向實驗者.
也可用酒精燈對試管直接加熱.
防止試管內的溶液沖出試管,造成燙傷；
縮短實驗時間.
（二）脂肪的鑒定
取材、切片、製片：花生種子浸泡、去皮、切下一些子葉薄片,將薄片放在載玻片的水滴中,用吸水紙吸去裝片中的水.

干種子要浸泡3-4小時,新花生的浸泡時間可縮短.
浸泡時間短,不易切片,浸泡時間過長,組織較軟,切下的薄片不易成形.切片要盡可能薄些,便於觀察.
染色：在子葉薄片上滴2-3滴蘇丹Ⅲ（染色3分鍾）或蘇丹Ⅳ染液（染色1分鍾）.
染色時間不宜過長.
漂洗：用吸水紙吸去薄片周圍染液,用50%酒精洗去浮色,吸去酒精.
酒精用於洗去浮色,不洗去浮色,會影響對橘黃色脂肪滴的觀察.同時,酒精是脂溶性溶劑,可將花生細胞中的脂肪顆粒溶解成油滴.
用吸水紙吸去薄片周圍酒精,滴上1-2滴蒸餾水,蓋上蓋玻片.
滴上清水可防止蓋蓋玻片時產生氣泡.
鏡檢：先低後高（高倍鏡用法：移物換器時針反）,低倍鏡下找到花生子葉薄片的最薄處,可看到細胞中有染成橘黃色或紅色圓形小顆粒.
裝片不宜久放.
時間一長,油滴會溶解在乙醇中.
三、蛋白質的鑒定
制備組織樣液.（浸泡、去皮研磨、過濾.）黃豆浸泡1至2天,容易研磨成漿,也可購新鮮豆漿以節約實驗時間.加樣液約2ml於試管中,加入雙縮脲試劑A,搖勻；再加入雙縮脲試劑B液3-4滴,搖勻,溶液變紫色.
A液和B液也要分開配製,儲存.鑒定時先加A液後加B液.
CuSO4溶液不能多加.
先加NaOH溶液,為Cu2+與蛋白質反應提
供一個鹼性的環境.A、B液混裝或同時加入,會導致Cu2+變成Cu ( OH ) 2沉澱,而失效.
否則CuSO4藍色會遮蓋反應的真實顏色.可用蛋清代替豆漿.蛋清要先稀釋.
如果稀釋不夠,在實驗中蛋清粘在試管壁,與雙縮脲試劑反應後會粘固在試管內壁上,使反應不容易徹底,並且試管也不易洗干凈.
附：澱粉的檢測和觀察用試管取2ml待測組織樣液,向試管內滴加2滴碘液,觀察顏色變化.碘液不要滴太多，以免影響顏色觀察

❽ 常用的蛋白質含量測定方法有哪些

①凱氏定氮法
原理：蛋白質平均含氮量為16%。當樣品與濃硫酸共熱，蛋白氮轉化為銨鹽，在強鹼性條件下將氨蒸出，用加有指示劑的硼酸吸收，最後用標准酸滴定硼酸，通過標准酸的用量即可求出蛋白質中的含氮量和蛋白質含量。
②雙縮脲法
原理：尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲，在鹼性溶液中雙縮脲可與Cu2+形成穩定的紫紅色絡合物。蛋白質中的肽鍵實際上就是醯胺鍵，故多肽、蛋白質等都有雙縮脲（biuret）反應，產生藍色或紫色復合物。比色定蛋白質含量。
缺點：靈敏度低，樣品必須可溶，在大量糖類共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 (數mg)，且會受樣品中 硫酸銨 及 Tris 的干擾，但 准確度 較高，不受蛋白質的種類影響。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當於雙縮脲試劑（鹼性銅試劑），試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。
在鹼性條件下，蛋白質中的巰基和酚基等可將Cu2+還原成Cu+， Cu+能定量地與Folin－酚試劑反應生成藍色物質，600nm比色測定蛋白質含量。
靈敏度較高(約 0.1 mg)，但較麻煩，也會受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。 步驟中各項試劑的混合，要特別注意均勻澈底，否則會有大誤差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收進行測定。
280nm-260nm的吸收差法：若樣品液中有少量核酸共存按下式計算：
蛋白質濃度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260為角標）
⑤色素結合法（Bradford 法）
直接測定法：利用蛋白質與色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）結合物的光吸收用分光光度法進行測定。
考馬斯亮蘭（CBG）染色法測定蛋白質含量。CBG 有點像指示劑，會在不同的酸鹼度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍色。當 CBG接到蛋白質上去的時候，因為蛋白質會提供 CBG一個較為中性的環境，因此會變成藍色。當樣本中的蛋白質越多，吸到蛋白質上的CBG也多，藍色也會增強。因此，藍色的呈色強度，是與樣本中的蛋白質量成正比。
間接測定法：蛋白質與某些酸性或鹼性色素分子結合形成不溶性的鹽沉澱。用分光光度計測定未結合的色素，以每克樣品結合色素的量來表示蛋白質含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4』-二羧-2,2』-二喹啉）法與Lowry法相似，主要差別在鹼性溶液中，蛋白質使Cu2+轉變Cu+後，進一步以BCA 取代Folin試劑與Cu+結合產生深紫色，在波長562 nm有強的吸收。
它的優點在於鹼性溶液中BCA 比Folin試劑穩定，因此BCA與鹼性銅離子溶液結合的呈色反應只需一步驟即完成。靈敏度Lowry法相似。
本方法對於陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度，較不受干擾，但會受還原糖 及EDTA的干擾。
⑦膠體金測定法
膠體金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶膠，呈洋紅色，具有高電子密度，並能與多種生物大分子結合。
膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體遇蛋白質轉變為藍色，顏色的改變與蛋白質有定量關系，可用於蛋白質的定量測定。
⑧其他方法
有些蛋白質含有特殊的 非蛋白質基團，如 過氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團，可測 403 nm 波長的吸光來定量之。 含特殊金屬的酶 (如鎘)，則可追蹤該金屬。

❾ 如何鑒定蛋白質

鑒定蛋白質可以用雙縮脲試劑。

雙縮脲（NH2CONHCONH2）由兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨後得到的產物，在強鹼性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，雙縮脲反應產生的紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。

優點：雙縮脲法測定蛋白質的測定范圍是1~10mg蛋白質，操作簡單、快捷。既適合手工操作，又適合自動化分析，重復性好、線性關系好， 雙縮脲試劑可以長期保存（ 若貯存瓶中有黑色沉澱出現，則需要重新配製）。

缺點：靈敏度差，測定范圍窄，樣品需要量大，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，因此它常用於需要快速，但並不需要十分精確的蛋白質測定。 干擾測定的物質包括有：在性質上是氨基酸或肽的緩沖液，如TrIs緩沖液，因為它們產生陽性呈色反應，銅離子也容易被還原，有時出現紅色沉澱。

蛋白質的作用：

人體內的一些生理活性物質如胺類、神經遞質、多肽類激素、抗體、酶、核蛋白以及細胞膜上、血液中起「載體」作用的蛋白都離不開蛋白質，它對調節生理功能，維持新陳代謝起著極其重要的作用。人體運動系統中肌肉的成分以及肌肉在收縮、作功、完成動作過程中的代謝無不與蛋白質有關，離開了蛋白質，體育鍛煉就無從談起。

在生物學中，蛋白質被解釋為是由氨基酸借肽鍵聯接起來形成的多肽，然後由多肽連接起來形成的物質。通俗易懂些說，它就是構成人體組織器官的支架和主要物質。蛋白質缺乏：成年人：肌肉消瘦、肌體免疫力下降、貧血，嚴重者將產生水腫。

未成年人：生長發育停滯、貧血、智力發育差，視覺差。蛋白質過量：蛋白質在體內不能貯存，多了肌體無法吸收，過量攝入蛋白質，將會因代謝障礙產生蛋白質中毒甚至於死亡。

以上內容參考網路-雙縮脲試劑

以上內容參考網路-蛋白質