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液相色譜最常用的分析方法

發布時間:2022-06-23 16:11:18

『壹』 HPLC法中定量分析方法大致有哪幾種

氣相色譜定量檢測一般就兩種,一個是外標法,一個是標法,對於沒有標准物質的,就只能靠容面積歸一法粗略定量。

通過對人類和環境有影響的各種物質的含量、排放量的檢測,跟蹤環境質量的變化,確定環境質量水平,為環境管理、污染治理等工作提供基礎和保證。簡單地說,了解環境水平,進行環境監測,是開展一切環境工作的前提。


(1)液相色譜最常用的分析方法擴展閱讀:

HPLC根據固定相和流動相的成分分為正相色譜和反向色譜。

正相色譜法

採用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相);流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環已烷),常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等)。

『貳』 高效液相色譜法的主要類型有哪些

高效液相色譜法分為:液-固色譜法、液-液色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法。
1、液-固色譜法(液-固吸附色譜法)
固定相是固體吸附劑,它是根據物質在固定相上的吸附作用不同來進行分配的。
①液-固色譜法的作用機制
吸附劑:一些多孔的固體顆粒物質,其表面常存在分散的吸附中心點。
流動相中的溶質分子X(液相)被流動相S帶入色譜柱後,在隨載液流動的過程中,發生如下交換反應:
X(液相)+nS(吸附)<==>X(吸附)+nS(液相) 其作用機制是溶質分子X(液相)和溶劑分子S(液相)對吸附劑活性表面的競爭吸附。
吸附反應的平衡常數K為:
K值較小:溶劑分子吸附力很強,被吸附的溶質分子很少,先流出色譜柱。 K值較大:表示該組分分子的吸附能力較強,後流出色譜柱。
發生在吸附劑表面上的吸附-解吸平衡,就是液-固色譜分離的基礎。
②液-固色譜法的吸附劑和流動相
常用的液-固色譜吸附劑:薄膜型硅膠、全多孔型硅膠、薄膜型氧化鋁、全多孔型氧化鋁、分子篩、聚醯胺等。
一般規律:對於固定相而言,非極性分子與極性吸附劑(如硅膠、氧化銅)之間的作用力很弱,分配比k較小,保留時間較短;但極性分子與極性吸附劑之間的作用力很強,分配比k大,保留時間長。
對流動相的基本要求: 試樣要能夠溶於流動相中 流動相粘度較小
流動相不能影響試樣的檢測
常用的流動相:甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。
③液-固色譜法的應用
常用於分離極性不同的化合物、含有不同類型或不;數量官能團的有機化合物,以及有機化合物的不同的異構體;但液-固色譜法不宜用於分離同系物,因為液-固色譜對不同相對分子質量的同系物選擇性不高。
2、液-液色譜法(液-液分配色譜法)
將液體固定液塗漬在擔體上作為固定相。
①液-液色譜法的作用機制 溶質在兩相間進行分配時,在固定液中溶解度較小的組分較難進入固定液,在色譜柱中向前遷移速度較快;在固定液中溶解度較大的組分容易進入固定液,在色譜柱中向前遷移速度較慢,從而達到分離的目的。
液-液色譜法與液-液萃取法的基本原理相同,均服從分配定律:K=C固/C液 K值大的組分,保留時間長,後流出色譜柱。
②正相色譜和反相色譜
正相分配色譜用極性物質作固定相,非極性溶劑(如苯、正己烷等)作流動相。 反相分配色譜用非極性物質作固定相,極性溶劑(如水、甲醇、己腈等)作流動相。
一般地,正相色譜是固定液的極性大於流動相的極性,而反相色譜是固定相的極性小於流動相的極性。正相色譜適宜於分離極性化合物,反相色譜則適宜於分離非極性或弱極性化合物。
③液-液色譜法的固定相 常用的固定液為有機液體,如極性的β,β′氧二丙腈(ODPN),非極性的十八烷(ODS)和異二十烷(SQ)等。
缺點:塗漬固定液容易被流動相沖掉。 採用化學鍵合固定相則可以避免上述缺點。
使固定濃與擔體之間形成化學鍵,例如在硅膠表面利用硅烷化反應:形成Si-O-Si-C型鍵,把固定液的分子結合到擔體表面上。
優點:
化學鍵合固定相無液坑,液層薄,傳質速度快,無固定液的流失。 固定液上可以結合不同的官能團,改善分離效能。 固定液不會溶於流動相,有利於進行梯度洗提。
④液-液色譜法的應用
液-液色譜法既能分離極性化合物,又能分離非極性化合物,如烷烴、烯烴、芳烴、稠環、染料、留族等化合物。化合物中取代基的數目或性質不同,或化合物的相對分子質量不同,均可以用液-液色譜進行分離。
3、離子交換色譜法
原理:離子交換色譜法是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的被測離子進行可逆交換,由於被測離子在交換劑上具有不同的親和力(作用力)而被分離。
①離子交換色譜法的作用機制
聚合物的分子骨架上連接著活性基團,如:-SO3-,-N(CH3)3+等。為了保持離子交換樹脂的電中性,活性基團上帶有電荷數相同但正、負號相反的離子X,稱為反離子。
②溶劑和固定相
兩種類型:多孔性樹脂與薄殼型樹脂。
多孔性樹脂:極小的球型離子交換樹脂,能分離復雜樣品,進樣量較大;缺點是機械強度不高,不能耐受壓力。
薄殼型離子交換樹脂:在玻璃微球上塗以薄層的離子交換樹脂,這種樹脂柱效高,當流動相成分發生變化時,不會膨脹或壓縮;缺點是但柱子容量小,進樣量不宜太多。
③離子交換色譜法的應用
主要用來分離離子或可離解的化合物,凡是在流動相中能夠電離的物質都可以用離子交換色譜法進行分離。
廣泛地應用於:無機離子、有機化合物和生物物質(如氨基酸、核酸、蛋白質等)的分離。 4.凝膚色譜法(空間排阻色譜法)
凝膠是一種多孔性的高分子聚合體,表面布滿孔隙,能被流動相浸潤,吸附性很小。凝膠色譜法的分離機制是根據分子的體積大小和形狀不同而達到分離目的。
①凝膠色譜法的作用機制
體積大於凝膠孔隙的分子,由於不能進入孔隙而被排阻,直接從表面流過,先流出色譜柱;小分子可以滲入大大小小的凝膠孔隙中而完全不受排阻,然後又從孔隙中出來隨載液流動,後流出色譜柱;中等體積的分子可以滲入較大的孔隙中,但受到較小孔隙的排阻,介乎上述兩種情況之間。
凝膠色譜法是一種按分子尺寸大小的順序進行分離的一種色譜分析方法。
②凝膠色譜法的固定相
軟質凝膠、半硬質凝膠和硬質凝膠三種。
③凝膠色譜法的應用特點
保留時間是分子尺寸的函數,適宜於分離相對分子質量大的化合物,相對分子質量在400~8×105的任何類型的化合物。
保留時間短,色譜峰窄,容易檢測。
固定相與溶質分子間的作用力極弱,趁於零,柱的壽命長。
不能分辨分子大小相近的化合物,分子量相差需在10%以上時才能得到分離。

『叄』 液相色譜法按操作形式分類為

按操作形式可分為:紙色譜法(按操作形式可分為:紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法.
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【色譜法分類】
按兩相的物理狀態可分為:氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC).氣相色譜法適用於分離揮發性化合物.GC根據固定相 不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC),其中以GLC應用最廣.液相色譜法適用於分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質.LC同樣 可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC).此外還有超臨界流體色譜法(SFC),它以超臨界流體(界於氣體和液體之間的一種物相)為流動相(常 用CO2),因其擴散系數大,能很快達到平衡,故分析時間短,特別適用於手性化合物的拆分.
按原理分為:吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC,又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC)和親和色譜法.(此外還有電泳.)
按操作形式可分為:紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法.
【色譜分離原理】
高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法.

『肆』 色譜分析中常用的定量分析方法有哪幾種

色譜分析中常用的定量分析方法有哪幾種
環境監測中常用到的色譜分析方法有: 氣相色 譜法、 高效液相色譜法、 離子色譜法。 環境監測是通過對人類和環境有影響的各種物質的含量、排放量的檢測,跟蹤環境質量的變化,確定環境質量水平,為環境管理、污染治理等工作提供基礎和保證。簡單地說,了解環境水平,進行環境監測,是開展一切環境工作的前提。環境監測通常包括背景調查、確定方案、優化布點、現場采樣、樣品運送、實驗分析、數據收集、分析綜合等過程。總的來說,就是計劃-采樣-分析-綜合的獲得信息的過程。

『伍』 高效液相色譜的使用方法

高效液相色譜儀操作步驟如下:
1).
過濾流動相,根據需要選擇不同的濾膜.
2).
對抽濾後的流動相進行超聲脫氣10-20分鍾。
3).
打開hplc工作站(包括計算機軟體和色譜儀),連接好流動相管道,連接檢測系統。
4).
進入hplc控制界面主菜單,點擊manual,進入手動菜單。
5).
有一段時間沒用,或者換了新的流動相,需要先沖洗泵和進樣閥。
6).
調節流量,初次使用新的流動相,可以先試一下壓力,流速越大,壓力越大,一般不要超過2000。
7).
設計走樣方法。
8).
進樣和進樣後操作。
9).
關機時,先關計算機,再關液相色譜。
10).
填寫登記本,由負責人簽字。
11).
流動相均需色譜純度,水用20m的去離子水。
12).
柱子是非常脆弱的,第一次做的方法,先不要讓液體過柱子。
13).
所有過柱子的液體均需嚴格的過濾。
14).
壓力不能太大,最好不要超過2000
psi。
高效液相色譜法(HPLC)又稱「高壓液相色譜」、「高速液相色譜」、「高分離度液相色譜」、「近代柱色譜」等。它是在生化和分析化學中常用的柱層析儀。
高效液相色譜是色譜法的一個重要分支,以液體為流動相,採用高壓輸液系統,將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱,在柱內各成分被分離後,進入檢測器進行檢測,從而實現對試樣的分析。
該方法有效方便快捷地解決化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中得出想要的數據,成為重要的分離分析技術。

『陸』 高效液相色譜儀的使用和原理分析

高效液相色譜儀(HPLC)是分析實驗室常用的測試儀器之一,其應用越來越廣泛。此種儀器在使用過程中,難免會出現各種各樣的問題,並將直接影響到所測數據的准確性和儀器的正常工作。操作者如果能了解故障的成因,即可清楚預防和排除這些故障的方法,就可正確地使用儀器並最大限度地發揮儀器的性能。今天我們要從以下幾個方面和您分享下在使用高效液相色譜儀中需注意的幾個問題。

一、使用試管的問題

1、試管的潔凈問題。

高效液相色譜分析法是一個很靈敏的分析方法,如果因使用不潔凈的試管,便會影響試驗結果的准確性。例如,在用甲醇作溶劑來溶解樣品時,所用的小試管是用橡膠塞來做蓋子的,因此,在每次進樣時,都有一個保留時間固定的干擾峰存在,後經證實,此干擾峰是由甲醇浸泡橡膠塞而溶下的組分所產生,換用玻璃試管後,干擾峰消除。

2、塑料試管的溶解問題。

近年來,一次性塑料試管給試驗人員帶來了極大的方便,但是,在使用過程中一定要注意有機溶劑對試管的溶解現象,在利用此種試管提取樣品時,有些有機溶劑(如氯仿等)對管壁有溶解現象,這些被溶解下來的物質有時也能在檢測器上產生信號,從而干擾樣品的測定。這時,可用相同的實驗條件先行試驗一下,看看不含被抽提物時,提取液在檢測器上能否產生干擾信號,如確有干擾信號存在,就只能換用耐有機溶劑的玻璃試管了。

3、被測樣品在試管壁上的吸附問題。

這個問題也應引起注意,否則也會影響測試結果的准確性,在治療葯物監測(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中,有些被測葯物如阿米替林,丙咪嗪等易吸附在玻璃試管的管壁上,因此,操作中宜採用聚丙烯管,為防止提取中吸附現象的發生,可採用0.5%的已二胺已烷液做為提取劑,可有效地防止吸附。

二、操作進樣閥的問題

目前,在分析型高效液相色譜儀中常用的進樣閥是7725型進樣閥,其內部的六通閥結構使進樣操作非常方便,但是,如果使用不當,也會帶來問題。例如,在高效液相色譜法的試驗過程中,有時會有異常色譜峰的出現以及重現性不好的問題,這主要是由於操作方法不當所引起,要想解決此類問題,需從以下幾個方面入手。

1、進樣量的控制。

用進樣閥來進樣時,閥內的樣品環是定量的,(一般分析型進樣閥的樣品環體積為20ul),由於進樣時,注射到進樣閥內的樣品溶液在樣品環的管路中有徑向的速度梯度(即管軸處比管壁處的液流速度快)。因此,要想使樣品環中充滿樣品溶液,從而使用進樣閥來准確地定量,則必須使進樣量大於樣品環體積的2倍。如果用注射器來控制進樣量,則最大隻能注射樣品環體積1/2的量,這樣才能防止部分樣品由溢流管溢出從而導致定量分析的誤差。

2、進樣閥的清潔問題。

如果樣品環中有上次進樣時樣品的殘留,必然會污染下次注射進的樣品,為防止這種現象的發生,應按下列步驟操作:a.進樣閥有2個位置,INJECT和LOAD。首先在LOAD位置時,以注射器將流動相注入進樣閥內清洗幾次,每次用量大約40ul;b.然後將進樣閥板手扳至INJECT位置時,再以流動相清洗幾次,每次用量還是40ul;c.最後,再將樣品注射到進樣閥里。

按照上述的步驟操作,可以避免由進樣閥引起的污染,從而使干擾峰消除並提高分析結果的准確性。

3、進樣閥溢流管的堵塞。

有時,進樣閥的溢流管會發生堵塞現象,向進樣閥內注射樣品時,注射針推不動。此故障是由於溢流管的堵塞所致。堵塞的原因多半是由於溶解樣品的流動相用的是鹽溶液,而其中的鹽在溢流管的排空埠處結晶所致。此時,可用小燒杯盛少量蒸餾水對溢流管口稍加浸泡,埠處鹽的結晶就能被溶解掉,故障排除。如能在每次進樣完成之後,用蒸餾水反復沖洗至溢流管中的鹽分全部沖出,則可避免此故障的發生。

三、流動相(MOBLLE PHASE)的問題

甲醇和乙腈在高效液相色譜分析法中常常被用來配製流動相。高效液相色譜法中常用的試劑最好是高等級的專用試劑,如色譜純試劑。在要求不太嚴格時,優級純甚至分析純的試劑也能用。高效液相色譜分析法中常用的是紫外檢測器,因此,從降低基線噪音和提高分析靈敏度上來考慮,應該使用紫外吸收小且雜質含量少的色譜純試劑。

1、流動相的過濾。

配製好的流動相在使用前一定要先用0.5um孔徑的微孔濾膜來過濾。這是因為溶液中含有很多肉眼難以發現的微小顆粒,如果不把它們濾除掉,就會堵塞泵口、柱頭上的過濾器,這樣就堵塞了流動相的正常通道,使色譜柱的阻力增加,柱壓升高,柱效下降。碰到這種情況時,要換用經過濾的流動相,並將堵塞的濾器拆下來浸泡在20%的硝酸水溶液中以超聲波清洗機清洗20分鍾,以除去濾片上的堵塞物。

2、流動相的脫氣。

流動相在使用前必須脫氣,以盡可能的除去溶解在流動相中的氣體,否則,這些氣體會使柱填料的性能降低,還能夠對檢測器的信號產生很大的干擾。脫氣有多種方法,如超聲脫氣、真空脫氣、氮氣脫氣等。真空脫氣法和氮氣流脫氣法是目前最常用的脫氣法。水和甲醇混合後會產生大量的氣泡,如果不脫氣就使用,氣泡就會進入色譜柱和檢測器,並將影響分析工作的正常進行。

四、色譜柱的使用和保養

色譜柱是高效液相色譜儀最主要的部件,被測物質能否被很好的分離和測定,色譜柱的性能起著決定性的作用。因此,在日常工作中,應特別注意色譜柱的正確使用和維修保養,以延長色譜柱的使用壽命。

1、使用預柱和保護柱。

預柱(pre-column)安裝於泵和進樣器之間,它給色譜柱中的流動相提供了完全的平衡,並防止了對柱填料有破壞作用的組分或污染物進入色譜柱。保護柱(guard column)可以阻擋能夠牢固地吸附於色譜柱上的組分進入色譜柱,保護柱應與色譜柱的填料相同。預柱和保護柱可以經常更換,而不需要經常更換色譜柱,這就延長了色譜柱的使用壽命。

2、防止氣體進入色譜柱。

有些色譜柱(如凝膠柱)是不允許氣泡進入的,否則將會使柱效降低甚至形成微小的難以驅除的氣室。因此,為了防止氣泡進入色譜柱,一定要使用經過脫氣的流動相,並且要嚴格按照下列步驟來安裝色譜柱。a.拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲,觀察是否有溶劑滲出;b.如有溶劑滲出,即可將色譜柱接到管路上,以避免氣泡的進入;c.如無溶劑滲出時,表明色譜柱的此端已經進去空氣了,此時,可將色譜柱的出口端接到進樣閥上,以流動相來反方向沖洗色譜柱,以便將柱內的空氣排除。最好以0.2ml/min的小流量來沖色譜柱,如果溶劑的流速太快或者是壓力突然的上升都將會導致柱性能的降低;d.如果流出的溶劑里不含有氣泡,說明柱內的氣體已經被排出了,再將色譜柱以正確的方向接好,這樣氣泡就進不到色譜柱裡面了。

3、色譜柱的清洗。

為了不使被測物質和雜質停留在色譜柱中,在每次的樣品分析工作完成之後,都應及時地清洗色譜柱。首先要用對被測樣品洗脫能力強的溶劑來洗脫色譜柱,以分析工作中常用的反相色譜分析法為例,因其先流出的物質是極性大的物質,此時應用100%的甲醇或使用異丙純、四氫呋喃等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內的極性小的物質洗脫下來,洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可。如果流動相是緩沖溶液,則應先用蒸餾水來沖洗色譜柱,以沖掉柱內的鹽,然後再用合適的溶劑來沖洗。

凝膠濾過色譜法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動相,用完之後當然要用蒸餾水來沖洗。如果是連續操作,可以將緩沖溶液置於柱內過夜,但最好是維持小流速(<0.5ml/min)以防止緩沖鹽的析出,如果流動相中含有鹵化物,即使是停一夜,也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈,以防止它們對柱體的腐蝕。

4、色譜柱的存放。

如果色譜柱暫時不用,存放時要注意以下幾點:

a.幾天之內的短期放置,應先用溶劑沖洗好色譜柱(如凝膠柱則用蒸餾水來沖洗),再把色譜柱的兩頭用密封螺絲密封好即可。

b.如果色譜柱長期不用,僅用上述方法來處理就不行了,這時應使用色譜柱使用說明書中所指明的溶劑來充滿色譜柱,反相柱一般使用甲醇,正相柱則可用正已烷或庚烷,而凝膠柱則不能用水了,因柱內如果有微生物的生長則會使柱效降低,此時應用0.05%的NaNs水溶液(防腐劑)來沖洗色譜柱,再將色譜柱封嚴。色譜柱長期放置時,一定要將色譜柱的兩端封嚴,以防止由於溶劑揮發而造成的柱填料干縮現象,因這可導致柱效的嚴重降低。

c.色譜柱應貯存在室溫下,如果放置於0℃以下的環境里,柱內就會結冰,這也將導致柱效的降低。

高效液相色譜儀的構造高效液相色譜儀(HPLC)一般由高壓輸液系統、進樣系統、分離系統、記檢測系統、數據處理系統等幾部分組成。制備型儀器還需配有餾份收集系統。為了取得較好的分析結果,HPLC儀器對於准確度、精確度、靈敏度及結果重現性有較高的要求。

高效液相色譜儀的工作原理

儲液器中的流動相被高壓泵打入系統,樣品溶液經進樣器進入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相)內,由於樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數,在兩相中作相對運動時,經過反復多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動速度上產生較大的差別,被分離成單個組分依次從柱內流出,通過檢測器時,樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀,數據以圖譜形式列印出來。

(6)液相色譜最常用的分析方法擴展閱讀:

高效液相色譜儀的構造高效液相色譜儀(HPLC)一般由高壓輸液系統、進樣系統、分離系統、記檢測系統、數據處理系統等幾部分組成。制備型儀器還需配有餾份收集系統。為了取得較好的分析結果,HPLC儀器對於准確度、精確度、靈敏度及結果重現性有較高的要求。

A

BOUT

高壓輸液系統

高壓輸液系統包括:溶劑儲液瓶、溶劑脫氣裝置、高壓輸送泵以及梯度洗脫裝置。其中,高壓輸液泵是高效液相色譜儀的主要部件之一,輸送壓力達150—350×105Pa。輸液系統要為HPLC儀器提供流量恆定、准確、無脈沖的流動相,流量的精度和長期的重復性要好,同時還要提供精度好、准確度高、重現性好的多元溶劑梯度。因此,輸液泵的好壞直接影響著整個系統的質量和分析結果的可靠性。

進樣系統:進樣能在試樣引入色譜柱,有六個介面:1,4之間接定量環;2接高壓泵;3接色譜柱;5,6接廢液管。

色譜分離系統:色譜柱通常為不銹鋼柱,內裝各種填充劑。常用的填料為硅膠,可用於正相色譜;化學鍵合固定相,根據鍵合的基團不同,可用於反相或正相色譜。其中、最常用的是十八烷基鍵合硅膠,即ODS柱,可用於反相色譜或離子對色譜。

檢測系統:檢測系統用於連續檢測色譜柱流出的物質,進行定性定量分析。要求其靈敏度高、噪音小、基線穩定、響應值的線性范圍寬等。近年來各國都在研究開發新的檢測技術,進一步擴大了HPLC的應用。

根據檢測需要的不同檢測器可分為紫外檢測器(UVD)、示差折光檢測器(RID)、電化學檢測器(ECD)、紅外檢測器(IRD)、核磁共振檢測器(NMRD)、質譜檢測器(MSD)、蒸發光散射檢測器(ELSD)、小角度激光散射檢測器(LALLSPD)。

數據處理系統:高效液相色譜的分析結果除可用記錄儀繪制譜圖外,還可使用微處理機和色譜數據工作站來記錄和處理色譜分析的數據。



『柒』 高效液相色譜常用什麼色譜法

高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1.液固色譜法 使用固體吸附劑,被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附-解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁,粒度5~10μm。適用於分離分子量200~1000的組分,大多數用於非離子型化合物,離子型化合物易產生拖尾。常用於分離同分異構體。
2.液液色譜法 使用將特定的液態物質塗於擔體表面,或化學鍵合於擔體表面而形成的固定相,分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。
塗布式固定相應具有良好的惰性;流動相必須預先用固定相飽和,以減少固定相從擔體表面流失;溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化;另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由於塗布式固定相很難避免固定液流失,現在已很少採用。現在多採用的是化學鍵合固定相,如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 採用極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相);流動相為相對非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環已烷),常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物(如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等)。
反相色譜法 一般用非極性固定相(如C18、C8);流動相為水或緩沖液,常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用於分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛,據統計,它占整個HPLC應用的80%左右。
隨著柱填料的快速發展,反相色譜法的應用范圍逐漸擴大,現已應用於某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離,常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5(2~8),太高的pH值會使硅膠溶解,太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。

正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法 反相色譜法
固定相極性 高~中 中~低
流動相極性 低~中 中~高
組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出

從上表可看出,當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線(如氨基鍵合固定相)。
3.離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂,常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架,在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基(稱陽離子交換樹脂)或季氨基(陰離子交換樹脂)。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換,根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外,它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度,進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大,則離子強度高,不利於樣品的解離,導致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用於分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
4.離子對色譜法 又稱偶離子色譜法,是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物後,在非極性固定相中溶解度增大,從而使其分離效果改善。主要用於分析離子強度大的酸鹼物質。
分析鹼性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽,如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種鹼性樣品形成很強的離子對。
分析酸性物質常用四丁基季銨鹽,如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ODS柱(即C18),流動相為甲醇-水或乙腈-水,水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑,在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。
5.排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料,流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中,滯留時間長;大分子量的化合物不能進入孔中,直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用於分離高分子化合物,如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。

色譜法的基本原理
利用樣品混合物中各組分理、化性質的差異,各組分程度不同的分配到互不相溶的兩相中。當兩相相對運動時,各組分在兩相中反復多次重新分配,結果使混合物得到分離。
兩相中,固定不動的一相稱固定相;移動的一相稱流動相。
分類:
根據流動相分—以氣體作流動相—氣相色譜——固定相為液體 氣-液色譜
固定相為固體 氣-固色譜
—以液體作流動相—液相色譜——固定相為液體 液-液色譜
固定相為固體 液-固色譜
—當流動相是在接近它的臨界溫度和壓力下工作的液體時——超臨界色譜

根據固定相的附著方式
—固定相裝在圓柱管中—柱色譜
—固定相塗敷在玻璃或金屬板上—薄膜色譜(平板色譜)
—液體固定相塗在紙上—紙色譜(平板色譜)

根據分離機理
—分配色譜—樣品組分的分配系數不同
—吸附色譜— 樣品組分對固定相表面吸附力不同
—體積排阻色譜—利用固定相孔徑不同,把樣品組分按分子大小分開
—離子交換色譜—不同離子與固定相商相反電荷間的作用力大小不同

根據極性
—流動相極性>固定相極性-反相色譜
—流動相極性<固定相極性-正相色譜

氣相色譜只適合分析較易揮發、且化學性質穩定的有機化合物,而HPLC則適合於分析那些用氣相色譜難以分析的物質,如揮發性差、極性強、具有生物活性、熱穩定性差的物質。所以,HPLC的應用范圍已經遠遠超過氣相色譜。

一、吸附色譜(adsorption chromatography)
又叫液固色譜法:流動相是液體,固定相是固體。

分離原理:固定相是固體吸附劑,吸附劑是多孔性微粒物質表面有吸附中心。樣品組分與流動相競爭吸附中 心。各組分的吸附能力不同,使組分在固定相中產生保留時間不同和實現分離。

固定相: 固定相通常是強極性的硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚醯胺等固體吸附劑。活性硅膠最常用。

流動相: 弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物,如正構烷烴(己烷、戊烷、庚烷等)、二氯甲 烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。
應用: 對於極性,結構異構體分離和族分離仍是最有效的方法,如農葯異構體分離、石油中烷、烯、芳烴的 分離。 缺點是容易產生不對稱峰和拖尾現象。

二、分配色譜
原理: 固定液機械的吸附在惰性載體上,樣品分子依據他們在流動相和固定相間的溶解度不同,分別進入兩相分配而實現分離。
固定相:將一種極性或非極性固定液吸附在惰性固相載體上。如全多孔微粒硅膠吸附劑。
根據極性不同分類:正相分配色譜—固定相載體上塗布的是極性固定液;
流動相是非極性溶劑;
可分立極性較強的水溶性樣品;
弱極性組分先洗脫出來。

反相分配色譜—固定相載體上塗布的是非極性或弱極性固定液;
流動相是極性溶劑;
強極性組分先洗脫出來。
液-液分配色譜固定相中的固定液體往往容易溶解到流動相中去,所以重現性很差,且不能進行梯度洗脫,已經不大為人們所採用。

三、鍵合相色譜

考慮分配色譜法中固定液的缺點,因此將各種不同的有機關能團通過化學反應共價結合到固定相惰性載體上,固定相就不會溶解到流動相中去了。
鍵合固定相優點:○ 對極性有機溶劑有良好的化學穩定性
○使色譜柱的柱效高、壽命長
○實驗重現性好
○幾乎適於各種類相的有機化合物的分離,尤其是k』寬范圍的樣品
○可以梯度洗脫
根據極性不同分類:正相鍵合相色譜—固定相極性>流動相極性
固定相:二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。
適於分離脂榮、水溶性的極性、強極性化合物

反相鍵合相色譜—固定相極性<流動相極性
固定相:烷基、苯基等非極性有機分子。如最常用的ODS柱或C18柱就 是最典型的代表,其極性很小。
適於分離非機性、弱極性離子型樣品,
是當今液相色譜的最主要分離模式。
正相HPLC(normal phase HPLC):
是由極性固定相和非極性(或弱極性)流動相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等,代表性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。

反相HPLC(reversed phase HPLC):
由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系,與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱,Octa Decyltrichloro Silane),代表性的流動相是甲醇和乙腈。

四、體積排阻色譜(SEC,size exclusion chromatograghy)
(又稱凝膠色譜和分子篩色譜)
原理: 以多孔凝膠(如葡萄糖,瓊脂糖,硅膠,聚丙烯醯胺等)作固定相,依據樣品分子量大小達到分離目 的。大分子不進入凝膠孔洞,沿多孔凝膠膠粒間隙流出,先被洗脫;小分子進入大部分凝膠孔洞, 在柱中被強滯留,後被洗脫。

根據樣品性質分類:凝膠過濾(GFC)—用於分析水溶性樣品,如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核 苷酸、多糖。
凝膠滲透(GPC)—用於分析脂溶性樣品,如測定高聚物的分子量。

SEC主要依據分子量大小進行分離,因此與樣品、流動相間的相互作用無關。因此不採用改變流動相的組成來改善分離度。

五、離子交換色譜
(ion exchange chromatography, IEC)
分離原理:使用表面有離子交換基團的離子交換劑作為固定相。帶負電荷的交換基團(如磺酸基和羧酸基)可以用於陽離子的分離;帶正電荷的交換基團(如季胺鹽)可以用於陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同,在樹脂中的保留時間長短不同,從而被相互分離

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