核酸分析方法視頻

① 干貨分享 | 快速了解什麼是實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR是一種高效的核酸檢測和定量分析方法。以下是關於實時熒光定量PCR的詳細解析：

1. 技術背景：

   • 自上世紀80年代PCR技術誕生以來，它一直在生命科學領域中發揮重要作用。
   • 傳統PCR的定性和半定量特性限制了其應用范圍，因此實時熒光定量PCR應運而生。

2. 核心原理：

   • 熒游標記技術：利用SYBR Green I染料或TaqMan探針實時監測PCR擴增過程中DNA的濃度變化。
     • SYBR Green I染料結合於DNA雙鏈，隨著DNA濃度的增加，熒光強度逐漸增強。
     • TaqMan探針則利用熒光淬滅與分離機制，確保檢測的高特異性。
   • 關鍵術語：如CT值、惰性參比染料和溶解曲線，這些術語在數據解讀中起到重要作用。

3. 實驗步驟：

   • 准備試劑和耗材：包括模板、引物、qPCR mix等。
   • 配製反應體系：在冰上進行，確保引物濃度適當，反應體系體積選擇恰當。
   • 上機實驗：避免氣泡，設置好樣本信息和程序後進行實驗。
   • 數據分析：導出數據，應用公式如△CT、△△CT和RQ來分析實驗結果。

實時熒光定量PCR以其高效、准確和特異性的特點，成為現代核酸檢測和定量分析的黃金標准。

② 核酸分析技術有哪些

總的來說包括了核酸的分離、提純，核酸的擴增，檢測，定性與定量分析等。下面以DNA為例說一下相關的概念。

1、DNA的分離提純就那些試劑，那些步驟，網上一大堆視頻的，自己去找吧。

2、擴增一般指的是PCR，需提供引物（引物具有特異性，比如說乙肝病毒基因的引物只能擴增乙肝病毒基因）、酶、底物等，三個流程一個循環：變性、復性、延長。

3、檢測一般有紫外分光光度法，電泳分析，雜交分析。

（1）紫外分光光度法：此法的原理涉及到一些光學的知識，可以查詢相關書籍以能更好的理解，可以做定量分析，分為單組份分析和多組分分析。

單組份分析有：

1）標准曲線法：用不通濃度的標准溶液，同一條件下測定吸光度A，以吸光度A為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標准曲線，根據測得的待測樣品吸光度，從標准曲線中便可知溶液濃度。

2）標准對照法：標准溶液濃度a，吸光度A，待測樣品吸光度B，則根據朗-比定律有待測樣品濃度為：B*a/A。

3）吸光系數法：吸光系數K，測得待測樣品吸光度A，溶液的厚度d，根據朗-比定律，則待測樣品的濃度為：A/(K*d)。

多組分分析沒研究過了，自己查查相關資料吧。

（2）電泳分析是根據DNA的分子量和結構不同而在電場中的移動速度不同的原理，電泳的時候需要加MARKER或者已知的基因的片段進行測量。說說MARKER的概念吧，MARKER是由一些列一定梯度的基因片段組成的基因混合物，梯度一般有100bp，200bp，500bp等，MARKER電泳過後便形成很多條距離相等的條帶，每兩條條帶之間的距離為前面提到的梯度值，MARKER用來做標准參考，具有標尺的作用

③ HIV核酸檢測HIV核酸檢測方法及程序

HIV核酸檢測方法及程序

一、HIV核酸定性檢測

1.1 方法和試劑

1.1.1 方法：HIV核酸定性檢測採用商品化試劑盒或實驗室自建方法，商品化試劑需嚴格遵循說明書操作。實驗室自建方法如下：

(1) 使用逆轉錄PCR（RT-PCR）方法檢測血漿或血清樣品，建議第一輪PCR擴增使用RT-PCR一步法。血細胞或組織樣品則使用PCR方法，一般採用擴增兩輪的套式PCR方法。

(2) 設立陽性、陰性及空白對照，陽性對照含目的基因，陰性對照不含目的基因，與待測樣品處理程序一致。陰性對照數量應根據實驗樣品數量設置，並分散放置。

1.1.2 試劑：PCR引物用於擴增HIV gag、pol、env、LTR等區域。進行RNA逆轉錄時可使用下游特異性引物或隨機引物。引物設計可參考文獻或自行設計，應廣泛覆蓋常見HIV流行毒株。抗污染試劑用於實驗室自建檢測方法。

1.2 擴增目的基因片段

1.2.1 樣品採集和處理：收集樣品並妥善處理，避免RNA降解。DNA保存於-20℃，RNA和需長期保存的DNA於-80℃。

1.2.2 核酸提取：使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離或自動化儀器提取，注意保護RNA不被降解。

1.2.3 逆轉錄合成cDNA：使用商品化試劑，按說明書操作，確保RNA酶抑制劑、dTta等成分充分。

1.2.4 PCR擴增反應：使用商品化試劑，按說明書操作，確保dNTPs、DNA聚合酶、緩沖液和超純水的量足。

1.3 擴增產物分析及結果報告

1.3.1 擴增產物分析：使用瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標准比較，判斷擴增片段是否在預期范圍內。其他方法如限制性內切酶酶切分析、特異性探針雜交分析及DNA序列分析。

1.3.2 結果判定和報告：實驗成立需同時滿足陽性對照、陰性對照和雙份平行樣品一致的條件。HIV核酸檢測陽性需重復采樣復測，復測陽性判定為陽性，陰性則為不確定結果，需進一步檢測。

二、HIV核酸定量檢測

2.1 方法：主要基於靶核酸擴增RT-PCR和信號放大擴增方法。國內常用方法如NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1、Amplicor Cobas等，其檢測線性范圍和國際單位關系各不相同。

2.2 試劑：使用注冊批準的商品化試劑，嚴格遵循說明書操作。試劑包含RT-PCR擴增、信號放大擴增、基於核酸序列擴增（NASBA）等。

2.2.1 靶核酸擴增試劑和性能：NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1、Amplicor HIV-1 Monitor v1.5等試劑，使用不同的設備和方法，如實時熒光探針分析法、微顆粒酶免疫分析法等，檢測線性范圍和國際單位關系有所不同。

2.2.2 信號放大擴增試劑和性能：Versant HIV-1 RNA 3.0.bDNA試劑盒，利用分枝狀DNA多級信號放大原理，無需RNA純化和PCR擴增步驟。

2.2.3 實時熒光定量PCR技術：實時熒光定量PCR技術在PCR反應體系中加入熒光基團，監測PCR進程，通過標准曲線定量分析樣品。

三、集合核酸定性檢測

3.1 樣品集合程序：根據樣品量計算集合數量，依次集合並檢測，同時制備陰性及陽性集合外部質控品用於RT-PCR檢測。

3.2 集合樣品的檢測和分解路線：使用商品化試劑，嚴格按照說明書進行檢測，集合樣品數量根據試劑方案調整。

四、嬰幼兒HIV感染核酸檢測

4.1 適用范圍：未滿18個月的HIV感染產婦所生嬰幼兒。

4.2 檢測程序及結果報告：在嬰兒出生後6周採集第一份血樣本檢測，若陽性盡快採集第二份血樣本，若兩份均陽性診斷HIV感染。若第一份陰性，滿3個月再次檢測。滿3個月再次檢測陰性，視為未感染，滿12個月後開始HIV抗體檢測。

五、結論

以上概述了HIV核酸檢測的定性及定量方法、集合檢測以及嬰幼兒HIV感染的早期診斷流程，確保了HIV感染的早期發現和及時治療。