大肠埃希菌复苏方法及检测

❶ 微生物检测为什么大肠埃希菌为控制菌

微生物限度
1. 包装材料的大肠埃希菌检查？
答：根据包装材料的不同，大肠埃希菌的检查方法大致有两种，一种是将浸提液合并后，取
一部分，接种胆盐乳糖培养基进行检查；另一种是将浸提液合并后，薄膜过滤，然后按规定
的方法检验。
2. 抗真菌药品的微生物限度检查法
答：这类产品的霉菌和酵母菌计数方法需要进行调整，可以根据产品剂型的不同，选择薄膜
过滤法或培养基稀释法等方法。
3. 为什么在日常样品检测中还需要做阳性对照（国外不需要）？
答：为了确保每一次检测对可能存在的微生物都是有效的。
4. 对于同一个品种，药典为什么不规定统一的检测方法？
答：本版药典进行过这样的尝试，也有某些品种已经收载了统一的检测方法，如注射用头孢
类抗生素的无菌检查。之所以没有大量收载，主要是由于检测方法还没有经过必要的复核。
将微生物检验的统一方法收载在品种的各论项下，始终是努力的方向。
5. 梭菌检查中需置厌氧条件下培养48小时，是否指在厌氧培养箱中？
答：需要在厌氧培养装置中进行培养，未必一定是厌氧培养箱。
6. 控制菌检查方法验证时，采用多种方法均未检出控制菌，如何处理？
答：在确保所使用的各种方法都没有错误的情况下，如果仍无法使试验菌生长，则应该采用
薄膜过滤法进行检查。理由是该方法能够最大程度地去除产品的抑菌作用。
7. 常规的监督抽样检品（包括原料）在进行微生物限度检查时，是否一定要进行活螨检查
并在原始记录与报告书中体现？
答：需要进行检查。可以在原始记录中体现，报告书上可以不出现，除非当发现有活螨检出。
8. 药包材微生物限度检查规定了合格质量水平，通常产量下取样8个，要求8个瓶子均符
合规定，如何进行？
答：每个瓶子分别进行实验。
9. 大肠埃希菌具体操作规程？
答：参见中国药品检验标准操作规程。
10. 动物组织及动物类原药材的提取物入药，是否需要检沙门菌？
答：需要进行沙门菌检查。
11. 关于中国药典菌落计数结果的判断还存在疑义，望能举例说明。
答：不清楚所指的存在疑义是指哪方面。2011年版对结果报告进行了较大篇幅的修订，目
前的规定应该比05版更为清晰、明确。
12. 需做沙门菌检验样品量的确定？
答：10g（ml）用于样品计数检验和其他控制菌检查，10g（ml）用于沙门菌检查，10g（ml）
用于沙门菌检查的阳性对照。需要进行沙门菌检查的样品，检验用量应为30g（ml）。
13. 日常的实验室装备能否达到梭菌无氧的培养要求？
答：完全可以。可以采用厌氧培养盒（罐）。
14. 如果一个产品有两个规格，是否可以取其中之一做阳性对照？
答：每个规格均需进行阳性对照。
15. 细菌数为100g/g的，样品稀释级只做1:10,1:100的倍数就可以了吗？
答：可以。
16. 培养时间3天，5天，可理解为72小时，120小时吗？
答：可以。这样更为严谨。
17. 中国药品检验标准操作规范“已做验证试验的供试品，在检查时刻不必再做阳性对照”
如何理解？
答：该标准操作规范中在无菌检查法中规定“供试品无菌检查应进行阳性对照试验”，表明
不论是否进行了方法验证，在产品的每一次检验过程中，还必须进行阳性对照。
在控制菌检查的大肠埃希菌项下，指出“已做验证试验的供试品，在该供试品检查时不必再
作阳性对照”。该规定仅适用方法验证与供试品检查同时开展的情况。2005年版药典和2011
年版药典在控制菌检查中均对阳性对照试验有明确规定，“进行供试品控制菌检查时，应做
阳性对照试验。”产品检验中应以药典规定为准。
18. 无菌检查和微生物限度检查中，产品中规定的溶解液是否可以换成其他的溶液？
答：可以。
19. 制剂通则中，没有微生物检查项目的，是否可不进行微生物项目检测？
答：可以。主要是二部制剂通则中口服片剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂。
20. 在细菌、霉菌和酵母菌计数中，适用性检查细菌是培养48小时，霉菌和酵母菌是培养
72小时，供试品检查中细菌是培养3天，霉菌和酵母菌是培养5天，那方法验证中应
参照哪个时间进行培养。
答：应按照供试品检验时的条件，即细菌3天，霉菌和酵母菌5天。
21. 测定纯化水微生物限度时，每张滤膜过滤量是多少合适？需要先稀释吗？过滤完后需不
需要冲洗？假如我取10ml纯化水通过双杯体封闭式薄膜过滤器过滤，每张滤膜上的计
数是以5ml为单位还是10ml为单位？
答：过滤量应以培养后出现的微生物数不超过100cfu/膜为标准。一般可不稀释。不需要冲
洗。每张滤膜的过滤量为5ml。
22. 2011药典中关于纯化水的微生物限度是：细菌、霉菌及酵母菌总数每1ml不得过100
个。这句话的意思是细菌总数每1ml不得过100个，霉菌及酵母菌总数不得过100个，
还是细菌+霉菌+酵母菌总数每1ml不得过100个。如果是三者总数的话，那细菌总数

❷ 怎样使用三用紫外仪器检查大肠埃希菌

大肠埃希氏菌平板法检测，大肠埃希氏菌在VRBA-MUG上生长的菌落在紫外下，通常采用360—366nm，可见有蓝色荧光。

❸ 病原微生物中细菌常见检测方法有哪些

1、快速测试片技术法

快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法。

细菌总数检测纸片的研制始于 20 世纪 80 年代，其主要优点是简便、实用、经济、操作性强。近年来以滤纸和美国某公司的 Petrifilm 为载体的测试片已开始被广泛应用。

2、生物电化学方法

生物电化学方法是指通过电极测定微生物产生或消耗的电荷，从而提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电化学性质如电流、电位、电阻和电导等会发生变化，所以可以通过检测分析这些电化学参量的变化来实现对微生物的快速测定。

常见的有：阻抗分析法、电位分析法、电流分析法等。生物电化学方法具有测量快速、直观、操作简单、测量设备成本低和信号的可控性等特点。

3、微菌落技术

微菌落是指细菌生长繁殖早期在固相载体上所形成的只能借助于显微镜观察的微小菌落。微菌落技术具有快速、经济、实用的特点，其研究始于 20 世纪50年代，定量测定技术从 20 世纪 70 年代开始，国外已有报道将该法应用于水、食品中细菌总数的快速检测。

4、气相色谱法

气相色谱应用到微生物的检测中，主要是依据不同微生物的化学组成或其产生的代谢产物各异，利用上述色谱检测可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

5、高效液相色谱法

利用高效液相色谱检测可分析各种体液中的细菌代谢产物、病原微生物等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

❹ 生活饮用水中大肠埃希氏菌检验探讨

          水样中的细菌包括很多“属”和很多“种", 我国《生活饮用水卫生标准》2006版[ 1] 的卫生学评价标准是以菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠埃希氏菌4项作为微生物指标。

        总大肠菌群可来自人类和温血动物的肠道及自然环境, 包含有埃希氏菌属、柠檬酸菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属等一大群在37℃经24小时培养能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。他们在伊红美蓝平板生长特征是：（1）深紫黑色、具有金属光泽；（2）紫黑色、不带或略带金属光泽；（3）淡紫红色菌落。

        耐热大肠菌群，又称粪大肠菌群，主要包括埃希氏菌属和耐热克雷伯菌属[6],是利用提高温度的方法将大自然的大肠菌群和粪便中的大肠菌群区分开的，它是一群能在44.5 ℃下生长的大肠菌群，只有来源于动物和人类粪便的大肠菌群能生长，而来自大自然的大肠菌群不能耐热生长[8-9]。

        大肠埃希氏菌(Escherichiacoli),以前常称大肠杆菌, 广泛存在于人类和温血动物的肠道中, 是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群, 维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌.虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌, 但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时, 可引起肠外感染。某些血清型可产生毒素, 为致病性大肠埃希氏菌, 可引起人类腹泻。所以生活饮用水中大肠埃希氏菌成为肠道疾病的重要致病菌之一。[2]

他们从属范围逻辑关系如下

      《生活饮用水卫生标准》2006版标准, 增加了生活饮用水中大肠埃希氏菌的检验。

        为了提高实验室检测能力，近日，本实验室开展了生活饮用水中大肠埃希氏菌检测的质控活动，质控活动达到如下目标：

一、使用工作中分离的耐热大肠菌群、标准菌株产气肠杆菌、标准菌株大肠埃希氏菌三种菌进行试验，观察不同大肠菌群在EC-MUG培养基荧光实况，取得阳性标本荧光视觉效果。

二、使用的试管进行酸浸泡、蒸馏水处理和水龙水直接清洗处理，寻找大肠埃希菌荧光效果影响因素。

三、使用北京陆桥EC-MUG培养基试剂及青岛海博EC-MUG培养基试剂进行比较试验，评价实验室常规使用的试剂是否优良。

1材料与仪器

1.1 EC-MUG培养基, 购自北京陆桥有限责任公司、青岛海博

1.2伊红美兰培养基, 购自北京陆桥有限责任公司。

1.3营养肉汤，购自北京陆桥有限责任公司。

1.4培养箱, 36℃ ±1℃;44.5±0.5℃;波长366nm紫外灯

2方法与结果

2.1方法原理

        大肠埃希氏菌能特异性产生产生β -葡萄糖醛酸酶(β -glucuronidase), 此酶能分解培养基上的EC-MUG荧光底物释放出荧光产物, 使培养基在366 nm紫外光下产生特征性荧光, 以此技术来检测大肠埃希氏菌。

2.2操作步骤与结果

        上图是产气肠杆菌与大肠埃希氏菌在EC-MUG培养基经44.5℃培养后，在日光灯背景下，产气肠杆菌液体清亮，说明产气肠杆菌在44.5℃中不能生长繁殖；大肠埃希氏菌液体混浊，说明大肠埃希氏菌在44.5℃中能生长繁殖。

        对上述经培养过的EC-MUG培养基，在日光灯观察背景下，使用366nm紫外线灯进行观察。产气肠杆菌依然清亮，无蓝光；不同稀释度的大肠埃希氏菌菌液有明显的蓝光，蓝光间无明显差别。因此，在观察大肠埃希氏菌发酵效果时，可以在普通光线下，使用366nm紫外线灯进行观察，结果显着。

        上图为在暗室下对前述经培养过的EC-MUG培养基观察实验效果。大肠埃希氏菌发酵后产生荧光，并且不同稀释度的菌液，目视无显着差别；与产气肠杆菌效果阴性效果有非常明显的差别。产气肠杆菌培养管有微弱荧光，可能存在EC-MUG培养基自身有荧光事实！

        该图是灭菌蒸馏水与EC-MUG培养基效果比对。1、2试管是泡酸清洗的试管，5、6为未泡酸清洗的试管。

        在暗室下观察，产气肠杆菌在EC-MUG培养管相对于蒸馏水，用手机拍照有明显荧光，实际观察中，这种荧光相对弱些，但依然是有荧光产生。所以，普通试管及蒸馏水可能产生的荧光可以忽略不计，但试剂本身产生有一定量的荧光是实验事实。

        因此，为了减少个人观察经验不足，建议，在实验过程中，应该带标进行比对观察，这样头脑中才有荧光阴阳直观效果。

        上图中的耐热大肠菌群，是日常工作中检出的工作株，实验室证实他们在伊红美兰平板上能产生铁锈色样金属光泽的大肠菌群，属于耐热大肠菌群。目前该菌在EC-MUG培养基经44.5℃培养后中也能混浊生长。

        在日光灯背景下用三用紫外灯366nm紫外线波观察，各个试管有微许蓝光，实际目视观察没有很强。手机拍照显示都有微量荧光效果，产气肠杆菌颜色似乎还更深点。可以判断全部10管试验管均为大肠埃希氏菌阴性。

        上图为暗室下对产气肠杆菌和工作株的耐热大肠菌群在EC-MUG荧光效果图。手机拍照显示有较强荧光，实际目视效果较弱，如没有阳性对照比较，易误以为大肠埃希氏菌阳性结果。但在暗室下观察，该耐热大肠菌群、产气肠杆菌没有差别，也可以判断为结果阴性。

        通过产气肠杆菌与实验室耐热大肠菌群在EC-MUG高温培养后的荧光效果比较。产气肠杆菌在高温中不能生长，液体清亮，也不能分解荧光底物。本实验室工作株耐热大肠菌群能在高温中生长，所以液体混浊，但本次工作菌株不分解分解培养基上的MUG荧光底物释放出荧光产物，通过与产气肠杆菌（商品标准菌株）比较，判定为荧光阴性，因此可能本实验室该耐热大肠菌群工作株是耐热克雷伯菌属。（耐热大肠菌群，又称粪大肠菌群，它由埃希氏菌属和耐热克雷伯菌属组成。非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语。）

      以下图片为两种不同试剂用相同处理的试管进行EC-MUG培养观察效果：

        暗室下观察荧光效果图，北京陆桥产品阴阳对照明显。

        日光灯下，用紫外线灯观察荧光效果图，北京陆桥产品阴阳对照明显。

        暗室下观察荧光效果图，青岛海博产品阴阳对照明显。

       

        日光灯下，用紫外线灯观察荧光效果图，青岛海博产品阴阳对照明显。

    上图为正常光线下的实验培养结果照片。

        通过北京陆桥、青岛海博两种试剂的比较，两种试剂在不同方式处置的试管内培养大肠埃希氏菌，稀释倍数不同，产生的荧光效果是一样的。

3.讨论

3.1、有关文献及实验结果中，试管本身会产生微量荧光[3]。本次实验使用的试管分两部分，一部分是用酸浸泡试管七天以上，然后进行蒸馏水清洗；另一部分是直接用水龙头水直接清洗，两类试管均165℃2小时以上高温灭菌。两类试管分别均分装有蒸馏水对照、产气肠杆菌（标准菌株）、耐热大肠菌群（工作菌株）、大肠埃希氏菌株（标准菌株）。同一菌株在不同方法处置的试管，实验效果无差别，说明一般试管可能产生的荧光对实验没有影响。

3.2、EC-MUG培养基试剂本身经培养后会溢出一定的荧光物质，如果没有阳性对照作比较，可能会误以为是真阳性，造成假阳性结果。因此，初级实验者或日常工作中，应带标准菌株同步实验并观察实验结果。

3.3、两家试剂厂家生产的EC-MUG培养基，阳性结果产生荧光效果均显着，实际操作中，日常生活饮用水中的大肠埃希氏菌试验结果与阴性对照相差无异时，可以按未检出大肠埃希氏菌结果进行报告。

3.4、GB/T5750.12－2006检测大肠埃希氏菌有多管发酵法、滤膜法，大肠埃希氏菌酶底法。推荐的第一法为多管发酵法，是在检测总大肠菌发酵乳糖蛋白胨基础上，有选择地进行EC-MUG培养，从批量工作中，减少了工作量及工作经费。在日常生活饮用水监测中，第一法相对第二法过滤法更简便易行；相对第三法酶底法来讲，更经济实惠。因此，第一法多管发酵法，在常规检测工作中仍是值得推广的方法。

3.5、不同稀释度的大肠埃希氏菌液在EC-MUG培养液中，产生荧光效果无显着区别。因此，总大肠菌发酵后，在下步实验操作中，移液管要一管一用，不同发酵管不能出现交叉污染，防止阳性值偏高。

参考文献

[ 1] GB5749-2006，生活饮用水标卫生标准 [S]。北京：中国标准出版社，2007

[2] , zzzzzz。水中,mmm mmm mmmJ]. 河南预防医学杂志2009年20(3):185-216.

[8] GGkkk.生活饮[J].预防医学论坛, 2008，14(12)：1163-1164.

[9]hhhhhhhhh等.南方地区农查[J]. 公共卫生与预防医学,2014，25(4):11-13.

[gggg[J]。环境科技，2010，23（1）：67－70

[3]

❺ 包装材料如何检测大肠大肠埃希菌

根据包装材料的不同，大肠埃希菌的检查方法大致有两种，
一种是将浸提液合并后，取一部分，接种胆盐乳糖培养基进行检查；
另一种是将浸提液合并后，薄膜过滤，然后按规定的方法检验。

❻ 检测培养大肠埃希菌

毒性大肠埃希杆菌感染需要做的检查是大便培养、大肠埃希杆菌肠毒素检测。
该病主要表现为水样便，伴有腹部痉挛、恶心、呕吐、寒战、头痛、肌痛等。重者似霍乱，呈中重度脱水、酸中毒甚至死亡，可以并发脱水、水电解质紊乱、酸中毒等。饮食上建议合理搭配，清淡、易消化饮食。本病有自限性倾向，轻者可自愈。
平时要注意饮水及饮食卫生，均衡营养，补充富含有蛋白质、维生素的饮食，同时注意补充一些肠道益生菌。

❼ 在一口服药中疑有大肠埃希菌,应如何检测

可以先做IMViC实验（即吲哚；甲基红；VP；枸橼酸盐实验）实验结果是++——（即阳性、阳性、阴性、阴性）则可确定有肠道杆菌；再在伊红美蓝平板上检测有黑色金属光泽菌落则有大肠埃希菌或在S—S琼脂平板上检测培养基呈红色则有大肠埃希菌