单克隆检测方法

Ⅰ 单克隆抗体中两次筛选分别是什么方法

第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，用连续注射抗原，下面具体介绍一下：

1、在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞；

2、通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。

拓展资料：

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。

参考资料：单克隆抗体网络：网页链接

Ⅱ 如何用单克隆抗体进行疾病诊断

为研制一种特异性强、灵敏度高、操作简便快速的甲胎蛋白（AFP）单克隆抗体酶联免疫诊断试剂盒，用于定量检测血清中的AFP。方法 将自行研制的AFP单克隆抗体（AFP-McAb）标记辣根过氧化物酶，AFP多抗（AFP-PcAb）包被微孔反应板，研制成AFP单克隆抗体酶联免疫诊断试剂盒。血清中的AFP与包被于微孔板上的AFP多抗结合，再与AFP酶标抗体结合，在TMB底物液作用下形成肉眼可见的蓝色。结果 该诊断试剂盒对305份临床病人血清进行了检测，结果与放射免疫法相比总符合率为98．6％；对215份临床病人血清进行检测，结果与化学发光法相比总符合率为99

Ⅲ 单克隆抗体技术怎样鉴别植物病毒

运用细胞融合技术，将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞杂交，产生杂交瘤细胞。其增殖能力很强，可在体外连续培养产生抗体。选择其中能产生某单一抗体的细胞株，所产抗体称“单克隆抗体”。单克隆抗体灵敏度和专一性比多克隆抗体高，而且可以稳定地再繁殖，无需再用免疫动物，因此被广泛应用于植物病毒等病原的检测和鉴定。目前已有多种园艺花卉植物病毒的单克隆抗体应用于病毒的鉴定和检测。

Ⅳ 单克隆抗体的纯化技术操作步骤

从培养液或腹腔积液获得的单克隆抗体，不需要纯化即可应用于日常诊断或定性研究。如果用于免疫标记测定，须分离和纯化。可用半饱和、饱和硫酸铵进行沉淀，进行初步浓缩和纯化；可用亲和层析法进一步纯化。

一、腹水型单抗的纯化

在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。

1、二氧化硅吸附法

新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min 15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。

2、过滤离心法

用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。

3、混合法

即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。

二、单抗的粗提

1、硫酸铵沉淀法

（1）饱和硫酸铵溶液的配制

500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调PH至7.8。

（2）盐析

吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。

（3）脱盐

常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存备用）。将盐析样品装入透析袋中，对50-100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析（4℃）12-24小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂（碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20% NaOH 50ml）检测，直至透析外液无黄色物形成为止。

（4）蛋白质含量的测定

（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀释倍数；或（Pr）=OD280×稀释倍数/1.3

（5）分装冻存备用

2、辛酸-硫酸铵沉淀法

该法简单易行，适合于提纯IgG1和IgG2b，但对IgG3和IgA的回收率及纯化效果差。其主要步骤如下：取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸缓冲液，用1mol/L HCl调PH至4.8；按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤（125um），加入1/10体积的0.01mol/L PBS，用1mol/L NaOH调PH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45%饱和度，作用30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜，其间换水3次以上；取出10000g离心30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。

3、优球蛋白沉淀法

该法适用于IgG3和IgM型单抗的提取，所获制品的抗体活性几乎保持不变，对IgG3单抗的回收率高于90%，对IgM单抗的回收率为40-90%不等。其操作步骤如下：取一定量的预处理过的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的浓度分别达0.2mol/L和25mmol/L，随之可见纤维蛋白的产生；经滤纸过滤后，滤液对100倍体积的去离子水透析，4℃ 8-15小时（若是IgG3单抗，也可室温2小时），其间换水1-2次；取出后22000g离心30分钟，弃上清；将沉淀溶于PH8.0 1mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl溶液中，重复上述的透析与离心；将沉淀的优球蛋白浓度调至5-10mg/ml，分装冻存备用。

三、单抗纯化的方法

单抗纯化的方法有很多种，应根据具体单抗的特性和实验条件选择适宜的方法，常用的技术有DEAE离子交换层析柱、凝胶过滤法和亲和层析法三种。

1、离子交换层析：

分离蛋白质是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维素(CM纤维素) 和弱碱型的二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)。前者为阳离子交换剂，后者为阴离子交换剂。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来

2、凝胶过滤法：

一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时，大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小，小分子则在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。

缺点：从凝胶过滤的原理可知，蛋白质分子通过凝胶柱的速度(即洗脱体积的大小)并不直接取决于分子的质量，而是它的斯笃克半径，利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量时，标准蛋白质(已知分子量和斯笃克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体)，否则不能得到比较准确的分子量。分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质，则不能用此方法测定分子量。而且柱子成本比较高，整个实验过程耗时很长。

3、免疫亲和层析法：

是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低。

用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析法则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。

Ⅳ 单克隆金标法和人绒毛膜促性腺激素哪个测怀孕准确性高

这个说法是有问题的哦.
我本身就是做试纸的.
实际上医院使用的和你购买的就是同样原理的试纸,都是检测你的人绒毛膜促性腺激素(hcg),检测出浓度,即有线,一般就表示怀孕了.
而你所谓的单克隆金标法指的是一种检测方法,就是我们会把金颗粒标记到抗体上,来检测你的人绒毛膜促性腺激素.
你的问题可能有三个原因,一是医院的试纸有问题,失效了.二是你购买的的早孕试纸灵敏度过高,导致假阳性产生(常见!)特别是国内的一些小企业生产的试纸,抗体质量不好,或者技术不够,又或者你有服用什么药物产生干扰都会发生这种情况.
第三个原因,也就是你购买的试纸,或者是验孕棒是三根线的产品(国内少见).也就是一根控制线,一个对照线,一根检测线.不论你是否怀孕,一定会出现两根线:控制线和对照线.控制线用来表示产品运做正常,可以不去管它.对照线的作用仅仅是当你检测出第三根线,也就是怀孕了的情况下,可以和对照线的浓度进行比较,判断怀孕时间.可能越浓表示越久.是半定量的方法.
从经验来说,如果已经过了三天。理论上检测线有线的话应该很强了.
验血的话就是直接检测你血液中的激素含量,相当准确的.

Ⅵ 如何用elisa检测单克隆抗体和底物的请合理

方法一：用于检测未知抗原的双抗体夹心法：1.包被：用0.05MPH9,碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml,在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜.次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟.2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时.然后洗涤.（同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔）.3.加酶标抗体：于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml,37℃孵育0.1小时,洗涤.4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10～30分钟.5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml.6.结果判定：可于白色背景上,直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示.也可测OD值：在ELISA检测仪上,于450nm（若以ABTS显色,则410nm）处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性.方法二：用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml,每孔加0.1ml,4℃过夜.次日洗涤3次.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml,37℃孵育30～60分钟,洗涤,最后一遍用DDW洗涤.其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6.

Ⅶ 单克隆挑不出如何解决（单克隆，转染，细胞液，稀

你确定每孔1-2个细胞了吗？分完孔当然要在镜下确认每孔的细胞。

如果有细胞长不起来，有可能是折腾时间太久，细胞状态不好了。
细胞还贴壁吗？如果贴壁接换回液。

单克隆化没什么技巧。
单克隆荧光阳性细胞的挑选：荧光蛋白标记的细胞以荧光倒置显微镜和FACS检测荧光细胞百分比，必要时重复转染一次，有限稀释法获得荧光阳性单克隆：于96孔板中8孔为一组，每组除第一孔外其余7孔每孔加入含15%FBS的IMDM50uL（无刻度巴斯德滴管1滴），第1孔中加入100uL细胞密度为1000个/mL的含15%FBS的IMDM，即100个/孔，（以排枪）自第1孔中吸取50ul，以后每孔依次做2：1倍比稀释，丢弃最后1孔中吸出的50uL，常规培养数天~1周后于荧光显微镜下挑选eGFP＋单克隆并扩增。
这个方法可以确保一定有细胞生长，如果比例足够，96孔板中至少有12~24个孔是有1个到2个细胞的，一般会有阳性孔。这种方法起始细胞数可以比较灵活，适合懒人。不象上面提及的经典方法，算得人头晕。我也没有去对过文献，自己想的。

Ⅷ 求大神讲解一下单克隆筛选的原理，最好通俗一点哈

谢邀！
细胞单克隆筛选
细胞单克隆筛选是根据细胞所具有的特性将单个细胞从混合的细胞样品中分离出来的一种技术,是抗体制备细胞株优化、稳转细胞株构建、药物靶点筛选等应用中重要的一环,优质的单克隆细胞能够更好地为不同领域科学研究和药物研发提供支持。
通俗的讲:就是将混合细胞通过3D打印技术（更精准高效）/直接用96孔板分离，此时一部分目标细胞就与其他细胞分离开来，经过筛选，得到目标细胞进行培养就能得到同种细胞了

Ⅸ 单克隆抗体的性质鉴定的方法有哪些

答案A 点拨：单克隆抗体是蛋白质，不是细胞，所以①不正确；其制备过程中至少有两次筛选，一次是筛选出杂交瘤细胞，第二次是筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞，所以②正确；由于是单个杂交瘤细胞无性繁殖产生的高度单一的抗体，所以叫单克隆抗体...

Ⅹ 如何筛选动物单克隆抗体

单克隆抗体制备过程中,总共有两次筛选,第一次筛选出杂交瘤细胞,第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,两次筛选的原理和方法是不相同的.
第一次筛选的原理与方法：细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键.普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）.其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”）,即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,为DNA分子的合成提供原料.在此合成过程中,叶酸作为重要的辅酶参与这一过程,而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物,可以阻断DNA合成的“D途径”.另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”）,它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸,两种酶缺一不可.因此,在HAT培养液中,未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断,虽“S途径”正常,但因缺乏在体外培养液中增殖的能力,一般10d左右会死亡.对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言,由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞,因此自身没有“S途径”,且“D途径”又被氨基喋呤阻断,所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡.惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞,既具有效应B细胞的“S途径”,又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HAT培养液中选择性存活下来,并不断增殖.
第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中,由于采用连续注射抗原的方法,且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞,因此,从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的,经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异,所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞.通常采用有限稀释克隆细胞的方法,将杂交瘤细胞多倍稀释,接种在多孔的细胞培养板上,使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时,才能保证有些孔中是单个细胞）,再由这些单细胞克隆生长,最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养.