qpcr检测方法

Ⅰ 纯生信文章如何用qpcr来验证

纯生信文章用qpcr需要寻找网络中的关键模块来验证。利用Diffcorr包对关键模块中的基因进行差异相关性分析，选择差异相关性较大的基因进行生存分析，并利用RT-qPCR对进行验证，从而确定肺腺癌中的关键基因。

qpcr的概括

QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称定量即时PCR、即时定量PCR，是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应循环后产物总量的方法。

qPCR分析亦适于更具挑战性的应用，如多重侦测与高通量分析。qPCR有许多优点。其结果可以较快取得且稳定，因为是采用非常敏感的化学萤光，而且不需要在PCR反应后的侦测步骤。此外，因为反应后不需打开管子而减少了操作污染。

Ⅱ 请问什么叫QPCR

QPCR 问：什么是QPCR？答：QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。问：QPCR、DNA检测、PCR之间的关系？答：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction简称PCR）原理凭借敏感、特异、快速的特点荣获93年诺贝尔化学奖。因其在病原体检测方面的独特优势，因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，成为分子生物学诊断的主流，至今仍处于学术和应用前沿：第一代产品：基因扩增热循环仪（DNA Thermal Cycler）+电泳仪+紫外分析仪+定性试剂，构成PCR定性检测。第二代产品：基因扩增热循环仪+荧光仪+终点定量试剂，构成PCR-DNA终点法定量检测（End-point quantitative PCR detection），又分为终点酶免定量（ End-point ELISA-PCR）和终点荧光定量（End-point Fluor-PCR）两种。第三代产品：实时定量QPCR仪＋实时荧光定量试剂，构成QPCR-DAN/RNA实时荧光定量检测。问：相比以前的方法，QPCR有哪些特点？答：QPCR至少有以下特点：所用仪器少，只用一台仪器。检测时间短，只须45分钟～1小时10分钟（试剂各异），而定性PCR须3～4小时，酶免终点定量须6～8小时，荧光终点定量须2～3小时。操作极其简单：前处理后，样本插入仪器一小时后到电脑上来出报告即可，无须开盖，移样本（以前方法），避免污染。结果精确：定性PCR只能定性，很粗略，终点定量PCR由于只能在40个热循环结束后检测荧光，被测荧光达到饱和导致定量不够精确，属于半定量状态。而实时荧光QPCR是在扩增的每时每刻连续检测各样本的荧光值的变化，如图一所示： 图一 西安天隆TL988实际曲线1检测动态范围：10～10000000000 DNA copies/ml检测精度：0.1RLU辨别率：5000和10,000个模板拷贝样本的辨别率99.7％。问：QPCR的技术先进性、价格及应用现状？答：实时荧光QPCR是当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术，被美国FDA承认并推崇，被美国FDA批准并取得临床应用执照的QPCR试剂品种有：HBV乙肝病毒DNA，HCV丙肝病毒RNA，HIV艾滋病病毒RNA，Chlamydi trachomatis（CT），性传播疾病，沙眼衣原体，Neiserria gonorrhea(NG)，性传播疾病，淋病双球菌，Cytomegalovirus（CMV），性传播疾病，巨细胞病毒，Mybobacterium tuberculosis（Mtb），呼吸道疾病，结核分支杆菌等。实时荧光PCR仪研发技术难度大，门槛高，发达国家也只有有限几家知名公司生产，且售价昂贵：如美国ABI/7700-120万元，美国ABI/5700-50万元，瑞士Roche/Lightcycler-70万元，美国Stratagene公司2005年新品MX3005P-80万元 可见，在病人看来，哪家医院应用了QPCR技术便是先进诊断技术的象征，在发达国家也是如此。 国产仪器情况：国产仪器生产单位不超过五家，其中包括：日本独资杭州博日实时荧光QPCR仪（33孔）西安天隆科技有限公司TL988实时荧光QPCR仪（48孔） 以上产品均取得国家SFDA认证，报价均在45万以上。 国产试剂情况：多家公司生产实时荧光QPCR试剂盒，价格与终点法试剂相当，且品种齐全，价格便宜，购买方便：乙肝HBV-DNA，丙肝HCV-RNA，艾滋AIDSHIV-RNA，性病系列：淋病双球菌NG、沙眼衣原体CT、解脲支原体UU、疱疹病毒HSV、人体乳头瘤HPV，优生优育系列：巨细胞病毒CMV、弓形虫COX等。 编辑词条 开放分类：病毒、DNA、PCR、分子生物、实时荧光定量PCR仪 参考资料： 1. http://hi..com/pcr%D2%C7 2. http://www.medtl.com 贡献者：zhang120jing、弦之月NONO

Ⅲ qpcr原理及应用是什么

一、原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

1、 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2、 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3、 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链；

重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

二、应用

1、基因表达分析：例如结核分岔杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种生长相当缓慢的细菌，传统培养及鉴定一般需要花数周时间。

2015年时Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己发展的real time PCR检测mpt64，直接检测病人痰液中的结核分岔杆菌，分析715个检体657个病人，其检测灵敏度（sensitivity）及特异性（specificity）分别为90.3%及98.6%。

整个实验流程可以在5个小时内完成，此方法可以用于没有套装试剂（kit）可以使用的实验室。

2、检验生物芯片的结果；

3、siRNA与miRNA诊断；

4、基因型鉴定；

5、饮食分析；

6、兽医微生物检测。

特点

1、荧光实时定量PCR的基本原理有两个要点：首先是对PCR反应中的每一个循环的反应产物进行实时检测并记录下来；

其次，用于检测PCR产物实时检测的荧光染料标记在一段可以与单链PCR产物(模板)特异性杂交的探针上，并且处于淬灭状态，只有当探针与模板特异性结合以后才有可能释放出荧光信号。

2、每一轮循环中PCR的产出量都以荧光信号的形式被PCR仪的光学检测系统记录下来，在某一循环中荧光信号的强度达到预先设定的阈值时，此时的循环数称为CT(Threshold Cycle)，Ct值与起始的模板量成反比，起始的核酸量越多，达到阈值的循环数就越少，换句话说CT值会越小。

如果要确定量的话，需要做出标准曲线，以Ct值为纵坐标，起始模板数为横坐标作图。在新的MIQE规范中Ct这个惯用的名词被重新定义为Cq值(quantification cycle)。

Ⅳ 简述RT-qPCR的原理,简要说明其操作步骤及在临床科研中的应用

摘要 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用0ligo (dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR 使测的灵敏性提高了几个数量级，使- - 些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

Ⅳ pcr荧光探针法是什么

实时定量聚合酶链反应 (Quantitative Real-time PCR，qPCR) 是一种分子生物学技术，用于放大和同时检测或量化靶向 DNA 分子。程序遵循 PCR 的一般原则。

在 PCR 反应过程中，随着循环次数的增加，PCR 产物的积累导致荧光信号的增强。因此，通过监测荧光强度，在"实时"中检测到 PCR 反应的进展。科学研究中较为常用的是 SYBR Green qPCR 和T aqMan 探针 qPCR。

荧光PCR是一种用于生物学领域的分析仪器，于2003年1月3日启用。

高灵敏度：可检测单拷贝基因；动力学范围广：可检测10E0——10E8 拷贝；高重复性：CV<0.3%；高分辨率：轻松区分1000拷贝以下2倍浓度差异；高速：60分钟完成40个PCR循环；罗氏lightCycler 采用Therma－BaseTM 热循环专利技术和先进的光学检测系统，彻底消除边缘效应，保持稳定优异的检测结果1个检测通道轻松实现多重或多色PCR。

Ⅵ 高度保守的两个基因，如何做qPCR

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引 物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体 系配置过程中，有下面几点需要注意：
1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！
4. 所有成分加完后，离心去除气泡。
5. 每个样品至少3个平行孔。
参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量 反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者 Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。
通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特 异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。
3. 仪器设置
所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne为例，详细看一下反应设置：
A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。
B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA为模板进行。
C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。
D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。
E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备
F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分钟）。循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。

Ⅶ qPCR和qRT-PCR各有什么优缺点我该选择那个

QRT PCR一般指以RNA为模板，先逆转成cDNA，再进行qPCR。

更容易突变，因此种类更多，更难研制有效疫苗，难以预防。RNA病毒的抵抗力普遍比DNA病毒弱，治愈也更容易。但也有例外，例如双链RNA病毒的抵抗力就很强，逆转录病毒的治愈就极其困难。

植物病毒，除少数例外（如花椰菜花叶病毒Caulif- lower mosaic virus），几乎都是RNA病毒。RNA病毒有自我复制和逆转录两种复制方式，病毒RNA的复制过程中，其错误修复机制的酶的活性很低，几乎是没有的，所以其变异很快。

而疫苗是要根据病毒的固定基因或蛋白进行开发制作的，所以RNA病毒的疫苗较难开发。与DNA病毒相比，RNA病毒更加容易导致疾病，对宿主更加致命。