苏氨酸含量不同检测方法

Ⅰ 苏氨酸的L-苏氨酸的生产及检测方法

苏氨酸的生产方法主要有发酵法蛋白质水解法和化学合成法3种，微生物发酵法生产苏氨酸，因其工艺简单，成本低廉等优点已成为目前主流方法。发酵中间过程中苏氨酸含量的测定方法有多种，主要有氨基酸分析仪法、茚三酮法、纸层析法、甲醛滴定法等 。

Ⅱ 蛋白质及氨基酸的测定有哪些方法求大神帮助

楼主你好： 测定蛋白质最基本的方法是定氮法，即先测定样品中的总氮量，再由总氮量计算出样品中蛋白质的含量。蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法，它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一，在国内外应用普遍。此外，双缩脉法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速，故多用于生产单位质量控制分析。 蛋白质及氨基酸的测定 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。人体内的酸碱平衡、水平衡的维持；遗传信息的传递；物质的代谢及转运都与蛋白质有关。人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养指标。 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定的空间结构。不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同。蛋白质可以被酶、酸或碱水解，最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食品供给，故被称为必需氨基酸，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病，或通过补充而增强了新陈代谢作用。所以食品及其原料中蛋白质和氨基酸的分离、鉴定和定量具有极其重要的意义。 蛋白质的测定 测定蛋白质最基本的方法是定氮法，即先测定样品中的总氮量，再由总氮量计算出样品中蛋白质的含量。蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法，它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一，在国内外应用普遍。此外，双缩脉法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速，故多用于生产单位质量控制分析。 微量凯氏定氮法 本法适用于各类食品中蛋白质的测定。 1．原理 食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸胺。然后碱化蒸馏使氨游离，用过量硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。反应过程分为三个阶段，用反应式表示如下。 ①消化 2NH2(CH2)2COOH 4-13H2S04一(NH。)2S04+6C02+12S0=+16H20 (NH4)2S04+2Na()H一2NH3十+2H20+。Na2S04 2NH3+4H3803—，(NH4)2 B207+5H20 ③滴定 (NH4)2 B2 07+2HCl+5H20—NH4C1+4H3803 2．仪器 ①消化炉。 ②凯氏定氮蒸馏装置。 3．试剂 所用试剂均用不含氨的蒸馏水配制。试剂均为分析纯。 ①CuS04。 ②K2SO。 ③浓H2SO。 ④2％H。BO。溶液。 ⑤混合指示剂：1份O．1％甲基红乙醇溶液与5份O．1％溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份O．1％甲基红乙醇溶液与1份0．1％次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。 ⑥饱和氢氧化钠：500 g氢氧化钠加入500 mL水中，搅拌溶解，冷却后放置数日，澄清后使用。 ⑦0．01 toolI．一’或0．05 toolL叫HCl标准溶液(需用无水碳酸钠标定后使用)。 4．操作步骤 ①样品消化：精密称取O．2～2．0 g固体样品或2～5 g半固体样品或吸取液体样品5～20mI。，放人500 mI。干燥凯氏烧瓶中，加人O．2 g硫酸铜、3 g硫酸钾及20 mL浓HzSOa，于凯氏瓶口放一小漏斗，并将其以45。角斜支于有小孔的石棉网上。（更多详细咨询请参考国家标准物质网 www.rmhot.com ）用电炉以小火加热，待内容物全部碳化，泡沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至液体变蓝绿色透明后再继续加热微沸30 min。冷却，小心加入20 mL水，再放冷至室温，移人100 mL容量瓶中，并用少量水洗烧瓶洗液并人容量瓶，在加水至刻度，混匀备用。除不加样品外，取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸，按同一方法做试剂空白消化。 ②水蒸气发生瓶内装水至约2／3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 ③向接收瓶内加入10 mL 2％硼酸溶液及混合指示液l滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取lO mI。样品消化稀释液由小玻璃杯流人反应室，并以10 mL水洗涤小烧杯使之流人反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将3～10 mL饱和氢氧化钠溶液倒人小玻璃杯中，提起玻璃塞使其缓缓流入反应室，立即将玻璃塞盖紧，并加水于小玻璃杯中以防漏气。加紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸汽通人反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏2～5 min，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，然后用少量中性水冲洗冷疑管下端外部，再蒸馏1 min取下接收瓶，以0．01 molI．叫或O．05 molL1HCl标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时吸取10 mI_，试剂空白消化液按③操作。 5．计算 6。说明 ①干样用称量纸称重连纸一同消化，空白管同样放称量纸消化。 ②含糖量高和油脂高的样品消化时容易溢出，加热要缓慢。 ③氨是否蒸馏完全，可用pH试纸测试馏出液是否为碱性来判断。 ④实验前必须仔细检查蒸馏装置的各个连接处，保证不漏气。所用橡皮管、塞子须浸在氢氧化钠(10％)中，煮沸10 min，然后水洗、水煮，再用水洗。 ⑤小心加样，切勿使样品沾污凯氏烧瓶口部和颈部。

Ⅲ 测定蛋白质中氨基酸含量的主要步骤有哪些为什么一般分析报告显示17种氨基酸成分

一般来说人体必须的17种氨基酸，也较为重视

氨基酸的定性测定
一、氨基酸的一般显色反应
本节介绍三种显色反应：茚三酮法、吲哚醌法和邻苯二甲醛法。前二种是经典的常用显
色法，后一种是近年来发展起来的荧光显色法，具有灵敏度高的特点。
1. 茚三酮法
显色方法有下列数种：
①常用法：将点有样品的层析或电泳完毕的滤纸充分除尽溶剂，用 5g/L 茚三酮无水丙
酮溶液喷雾，充分吹干，置65℃烘箱中约30min（温度不宜过高，避免空气中氨，以免背
景泛红色），氨基酸斑点呈紫红色。
为了使各种氨基酸呈现不同颜色，可用下列方法：
②用 0.4g 茚三酮，10g 酚和90g 正丁醇的混合液显色。
③用 1g/L 茚三酮无水丙酮溶液显色完毕后，再用盐酸蒸汽熏1min。
④用 1g 茚三酮，600mL 无水乙醇，200mL 冰醋酸及80mL2,4,6-三甲基吡啶混合液80
℃染色5～10min。
为了使显色稳定，可用下列方法：
⑤配制含醋酸镉 2g 加蒸馏水200mL 及冰醋酸40mL 的贮存液。将上述贮存液加200mL
丙酮及2g 茚三酮，即为显色液。点有样品的滤纸上浸有此显色液后，放置于盛有一小杯浓
硫酸的密闭玻璃容器中，25℃，18h，或较高温度下适当缩短时间。背景色浅，氨基酸斑点
也比较稳定。
⑥用含 2g/LCoCl2(或CuSO4)的4g/L 茚三酮异丙酮溶液显色时，氨基酸斑点呈红色，也
可在茚三酮显色后喷以含钴、镉或铜等无机离子的异丙醇溶液，斑点自蓝紫色变成红色。
2．吲哚醌法
（1）原理
各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辩认氨基酸。氨对吲哚醌显色没
有妨碍，但其灵敏度较茚三酮法稍差，显色不稳定，颜色只有在绝对干燥的环境中才能保存。
（2）试剂
①显色剂：1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸中（若冰醋酸用量减少则灵敏度
稍差）。
②底色褪色剂：在 100mL 200g/L 碳酸钠溶液中加入60g 硅酸钠（Na2SiO3•9H2O）在水
浴（60～70℃）中加热搅拌直至完全溶解，待溶液比较清澈为止。在溶解过程中，有时硅酸
钠会结成凝胶，此时只需继续搅拌即可溶解。配制时若硅酸钠用量多则褪色较快，但背景容
易变黄，硅酸钠用得少（40g），虽裉色较慢，但背景较为洁白。
显色步骤
层析或电泳后滤纸烘干后，仔细喷上或涂上显色剂，用电吹风迅速吹干，待醋酸气味不
太刺鼻时移置100℃烘箱烘5～15min，直至显色为止（温度不要太高，以免引起减色）注
意观察所显出的颜色，然后均匀地涂上底色褪色剂，纸的背景即由黄色变为绛红而后逐渐变
浅，待黄色背景几乎褪尽时，迅速用电吹风吹干，并随时观察颜色的变化。例如苏氨酸在褪
色前为浅红带褐色，褪色后则呈橙黄色或黄色：脯氨酸在褪色前为蓝色，吹干时很快褪成无
色。室温较低时，底色褪色很慢，此时可将褪色剂加温到30～40℃。温度过高也不宜，因
氨基酸斑点的褪色速度也同时加快，应该避免。
其他显色步骤：显色剂为 1g 吲哚醌，1.3g 醋酸锌溶解于70～80mL 热异丙醇中，冷却
后加1mL 吡啶。或者1g 吲哚醌，1.5g 醋酸锌溶解于95mL 热异丙醇中，加3mL 水，冷却
后加1mL 冰醋酸。点有样品的滤纸仔细喷以显色剂后，80～85℃放置10min，背景可用水
迅速浸洗去而不使氨基酸斑点退去
由于吲哚醌试剂配制方法不同，对同一种氨基酸所显颜色往往也有差异。
3．邻苯二甲醛法
邻苯二甲醛法是目前纸上层析、硅胶薄层层析荧光显色氨基酸最灵敏的方法之一，也可
用于氨基酸溶液定量，并推广应用于乙内酰苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白质的检出和定量。根
据文献报道，氨基酸纸上层析灵敏度达0.5μmoL，在硅胶薄层层析上为0.05～0.2μmoL。
这里介绍在纸上层析显现氨基酸方法。（荧光胺是另一种常用的荧光试剂，由于荧光胺来源
比较困难，这里未作介绍）
（1）原理
邻苯二甲醛在 2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适
的激发光和发射光波长分别为340nm 和455nm。
各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，
异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨
酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。
（2）试剂
邻苯二甲醛显色液：取0.1g 邻苯二甲醛，0.1mg 巯基乙醇，1mL 三乙胺，加丙酮+石油
醚（60℃～90℃）（1+1）的混合溶剂至100mL。放置0.5h 后使用。
显色步骤
将含有氨基酸样品的滤纸浸入邻苯二甲醛显色液中 1min，冷风吹干，在温度18℃以下，
湿度50%～90%之间显色0.5h，于紫外灯下观察荧光点。
说明
在滤纸上显现氨基酸时，邻苯二甲醛浓度以 0.1%为宜。显色时必须有一定的湿度，以
便氨基酸溶解，提高分子碰撞机率，并使极性基团解离，促进反应趋于完全。湿度太低，显
不出荧光。温度对显现的荧光延时有显着影响，温度高荧光延时短，温度低荧光延时长。
二、个别氨基酸的显色反应
利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸。可应用于纸层析和纸电
泳显色，也可单独应用。方法很多，仅将常用的方法介绍如下：
1．精氨酸的显色——坂口（Sakaguchi）反应
(1)第一种方法
试剂：①5g 尿素溶解于100mL0.1g/Lα-萘酚乙醇中。使用前，每100mL 加约5g KOH。
②0.7mL 溴水溶解于100mL 5%NaOH 中。
显色步骤：在点有样品的滤纸上喷试剂①后，在空气中吹几分种，再喷试剂②。精氨
酸或含精氨酸的多肽显红色。此试剂对含精氨酸的蛋白质也适用。
(2)第二种方法：
试剂：①1g/L 8-羟基喹啉的丙酮溶液。②0.02mL 溴水溶解于100mL 0.5mol/LnaOH 溶
液中。
显色步骤：将点有样品的滤纸烘干后，喷上试剂①，吹干后，再喷试剂②。精氨酸或
其他胍类物质显桔红色。
2．胱氨酸和半胱氨酸的显色
试剂：①1.5g 亚硝基铁氰化钠（Na2Fe(CN)5NO2•5H2O）溶于5mL 2mol/L H2SO 4 溶液
中，加95mL 甲醇。此时会有沉淀产生，可保存一个月以上。使用时在每100mL 上述溶液
中加10mL 28%氨水，过滤除去沉淀，清液仅能保持一天左右。②2g 氰化钠溶于5mL 水中，
然后加95mL 甲醇。此时有沉淀产生，使用时只需摇匀即可。
显色步骤：半胱氨酸的显色：在滤纸上喷以试剂①的清液，5min 后半胱氨酸显红色。
胱氨酸的显色：先将滤纸浸入试剂②，迅速取出，稍等片刻再喷试剂甲的清液，5min 后胱
氨酸显红色。也可以把试剂②配制的浓度增加一倍，在显色前混和，再喷到滤纸上。
3．甘氨酸的显色
试剂；0.1g 邻苯二甲醛溶于100mL 77%乙醇中。
显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂，甘氨酸显墨绿色，在汞灯（365nm）下显巧克力
棕色。吲哚醌显色后，再用此试剂仍有效。以甘氨酸为N 端的小肽也能显色，但其N 端被
保护后，以及其他氨基酸均不显色。
4．脯氨酸的显色
试剂：1g 吲哚醌和1.5g 醋酸锌，1mL 醋酸，5mL 蒸馏水混和，再加入95mL 异丙醇。
新鲜配制。
显色步骤：层析滤纸除尽溶剂，喷上以上试剂，80℃～85℃烘箱内放置30min，脯氨酸
显蓝色，再以30℃温水漂洗除去多余的试剂后，背景为白色或浅黄色。
也可剪下脯氨酸斑点，在试管中加入5mL 水饱和酚，在黑暗中洗脱15min，间歇振摇，
于610nm 测定其吸光度。从已知标准曲线即可求得样品内脯氨酸含量，测定范围5～20μg。
5．丝氨酸和羟赖氨酸的显色
试剂：①0.035mol/L 过碘酸钠（748mgNaIO4 溶于数毫升甲醇中，加2 滴6mol/L 盐酸，
再用甲醇稀释至100mL）。②15g 醋酸铵加0.3mL 冰醋酸，加1mL 乙酰丙酮，用甲醇稀释到
100mL。
显色步骤：点有样品的滤纸吹干，先喷试剂①，近干后再喷试剂②，室温放置 2h，紫
外灯下照射0.5h，丝氨酸和羟赖氨酸呈黄色斑点，在紫外线下都有荧光。
6．羟脯氨酸的显色
试剂：①1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸。②1g 对二甲胺苯甲醛溶于100mL
的丙酮浓盐酸（9＋1）混合液中。（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增深发黑，灵敏度降
低，故用时新鲜少量配制。
显色步骤：将待鉴定的溶液点于小方块纸上，干后先点上试剂①，热风吹干。这时纯
羟脯氨酸呈墨绿色，纯脯氨酸呈深蓝色（极灵敏），对其他氨基酸呈程度不同的紫红色（不
太灵敏）；然后再点上试剂②吹干，如溶液中含有羟脯氨酸即转变为玫瑰红色，而其他氨基
酸与吲哚醌所生成的颜色则褪去。
7．色氨酸的显色
(1)第一种方法
试剂：1g 对二甲氨基苯甲醛加90mL 丙酮，10mL 浓盐酸。新鲜配制。
显色步骤：点有样品的滤纸干燥后，喷上以上试剂，在室温下放置几分钟后，色氨酸
显蓝色或紫红色。茚三酮显色后，仍可使用本法。
(2)第二种方法：
试剂：10mL 35%甲醛加10mL25%盐酸，20mL 无水乙醇。
显色步骤：点有样品的滤纸喷上以上试剂后，100℃烘5min，色氨酸在长波长紫外光下
呈现荧光（黄-橙-带绿色）。
8．酪氨酸的显色
试剂：①0.1%α-亚硝基β-萘酚的95%乙醇溶液。②10%硝酸水溶液。
显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂①后，吹干，再喷试剂②，然后在100℃烘3min，
酪氨酸或含酪氨酸的多肽在浅灰绿色的背景上显红色，0.5h 后转变为桔红色，其后渐退去。
灵敏度1～2μg 酪氨酸。茚三酮显色后，再用此试剂处理，仍能显色，茚三酮所显出的紫红
色斑点变成红色。
9．酪氨酸和组氨酸的显色——pauly 反应
试剂：①4.5g 对氨基苯磺酸与45mL 12mol/L 盐酸共热溶解，以蒸馏水稀释至500mL。
用时取出30mL，在0℃与等体积的5%亚硝酸钠水溶液相混合。（室温放置太长会失效）
②10%碳酸钠水溶液。
显色步骤：点有样品的滤纸上喷试剂①，片刻后再喷试剂②。组氨酸及含组氨酸的多
肽显桔红色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽显浅红色。
第六节 氨基酸定量测定
一、氨基酸的一般定量测定
（一）甲醛滴定法
1．原理
氨基酸具有酸性的-COOH 基和碱性的-NH2 基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内
盐。当加入甲醛溶液时，-NH2 基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用标准强碱
溶液来滴定-COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式（有三种不同的推论）如
下：
2．方法特点及应用
此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此
法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此
作为控制发酵生产的指标之一。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪
氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反
应，往往使结果偏高。
3．操作方法
吸取含氨基酸约 20mg 的样品溶液于100mL 容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0mL
置于200mL 烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至
酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液mL 数，供计算总酸含量。
加入10.0mL 甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消
耗氢氧化钠标准溶液毫升数。
同时取 80mL 蒸馏水置于另一200mL 洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至pH8．2，
（此时不计碱消耗量），再加入10.0mL 中性甲醛溶液，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定
至pH9.2，作为试剂空白试验。
4．结果计算
氨基酸态氮质量分数（%）=
式中：V1——样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（pH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液
的体积，mL；
V2——空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL；
c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；
m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g；
0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmoL。
5．说明
①本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。②浑浊和色深样液可不经处
理而直接测定。
(二)茚三酮比色法
1．原理
氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），
可用吸光光度法测定。
该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为 570nm，故据此
可以测定样品中氨基酸含量。
2．操作方法
(1)标准曲线绘制
准确吸取 200μg /mL 的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相当于
0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加
水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH 为8.04）各
1mL，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min
后，在570nm 波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克
数为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)样品测定
吸取澄清的样品溶液 1～4mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A 值，
用测得的A 值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。
3．结果计算
氨基酸含量（mg/100g）=
式中：c——从标准曲线上查得的氨基酸的质量数，μg；
m——测定的样品溶液相当于样品的质量，g。
4．说明及注意事项
①通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品 5～10g 或吸取样液样品5～10mL，
置于烧杯中，加入50mL 蒸馏水和5g 左右活性炭，加热煮沸，过滤，用30～40mL 热水洗
涤活性炭，收集滤液于100mL 容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。
②茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行
纯化，具体操作可参阅黄伟坤等编着《食品检验与分析》。
(三)非水溶液滴定法
1．原理
氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。根据酸
碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱；弱碱在酸性溶剂中碱
性显得更强，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强，因此本来在水溶液中不能滴定的弱碱或弱
酸，如果选择适当的溶剂使其强度增加，则可以顺利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中
呈现中性，而在冰醋酸中就能接受质子显示出碱性，因此可以用高氯酸等强酸进行滴定。
本法适合于氨基酸成品的含量测定。允许测定的范围是几十毫克的氨基酸
2．测定
(1)直接法（适用于能溶解于冰醋酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品50mg 左右，溶解
于20mL 冰醋酸中，加2 滴甲基紫指示剂，用0.100mol/L 高氯酸标准液滴定（用10mL 体积
的微量滴定管），终点为紫色刚消失，呈现蓝色。空白管为不含氨基酸的冰醋酸液，滴定至
同样终点颜色。
(2)回滴法（适用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样
品30～40mg 左右，溶解于5mL0.1mol/L 高氯酸标准溶液中，加2 滴甲基紫指示剂，剩余的
酸以醋酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不褪的紫色为终点。
3．说明
(1)能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法测定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、组
氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。不易溶解于冰
醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法测定的有：赖氨酸、丝氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。
(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以将样品溶解于2mL 甲酸中，再
加20mL 冰醋酸，直接用标准的高氯酸溶液滴定。
(四)邻苯二甲醛法(OPT 法)
1．原理
邻苯二甲醛在 2-巯基乙醇存在下，于碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适
的激发光和发射光波长分别为340 和455nm。可能产物为：
各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，
异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨
酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸，和半胱氨酸。
本法可用于测定游离氨基酸的含量。灵敏度较茚三酮法约高 100 倍以上，可测到0.1～
1×10－4mol 氨基酸。如用于血清中α-氨基氮的测定，每次血清用量只需5～10μL。与另一
种荧光试剂（萤光胺）一样，空白无荧光，只有与氨基酸结合才产生荧光。缺点是与脯氨酸
不产生荧光，邻苯二甲醛与半胱氨酸荧光值太低。荧光胺已有用于氨基酸自动分析定量分析，
但由于试剂昂贵及个别氨基酸反应不满意，目前还未普遍应用。
(五)三硝基苯磺酸法
三硝基苯磺酸（TNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。TNBS 在偏碱性的条件下
与氨基酸反应，先形成中间络合物，如下式所示：
中间络合物在光谱上有二个吸收值相近的高峰，分别位于355nm 和420nm 附近。然
而溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420nm 处的吸收值
显着下降，而350nm 附近的吸收峰则移至340nm 处。
利用 TNBS 与氨基酸反应的这一特性，可在420nm 处（偏碱性溶液中）或在340nm
（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。下表列出各种氨基酸与TNBS 反应后在不同条
件下测定的吸光度。在340nm 处，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 处的吸光度
因氨基酸种类而异；在加入适量SO3
2－时，吸收值升高。
本法允许的测定范围是 0.05～0.4μmol 氨基酸。
表 10-3 各种氨基酸与TNBS 反应后在不同条件下测定的吸光度
氨基酸种类 碱性溶液① 酸性溶液加 SO3
①取不同含量氨基酸液1mL，加4%NaHCO3 1mL，0.1%TNBS 1mL，于40℃反应2h，用水补充至4mL，
在420nm 处测定。制作氨基酸浓度—吸光度坐标图，从曲线中求得各氨基酸于1μmol 时的吸光度。
②条件同上，但在与TNBS 反应时加0.01mol/L Na2SO3 1mL，最后总体积也是4mL，同样在420nm 处
测定。
③条件同①，但与 TNBS 反应后加1mol/L HCl 1mL 酸化，在340nm 处测定。
(六)乙酰丙酮和甲醛荧光法
1．原理
氨基酸与乙酰丙酮和甲醛反应，生成 N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙酰基1,4-二氢吡啶，
产生黄-绿色荧光，可用荧光分析法检测。主要反应如下：
乙酰丙酮 甲醛 氨基酸 荧光物质
2．试剂
混合试剂：取1mol/L 乙酸钠溶液10mL，加入乙酰丙酮溶液0.4mL 和30%甲醛溶液1mL，
用水稀释至30mL。
3．测定
取氨基酸液 1mL，加入混合试剂1mL，用棉花塞满试管口，避光于100℃下加热10min，
冷却，加水2mL，然后测定荧光值。
表 10-4 各种氨基酸的发射波长和检测范围
化合物（激发波长405nm） 发射波长（nm） 检测范围（mg/L）
甘氨酸 485 2～10
苯丙氨酸 490 8～40
丝氨酸 485 5～25
半胱氨酸（盐酸盐） 500 20～100
谷氨酸 485 20～100
与标准相比较求出样品中的氨基酸含量。
二、个别氨基酸的定量测定
（一）赖氨酸的测定
1．原理
用铜离子阻碍游离氨基酸的α-氨基,使赖氨酸的ε-氨基可以自由地与1-氟-2,4 二硝基
苯(FDNB)反应,生成ε-DNP-赖氨酸。经酸化和用二乙基醚提取,在波长390nm 处有吸收峰,
从而求出样品中游离赖氨酸的含量.
2．试剂
(1)氯化铜液：称28.0g 无水氯化铜，用水稀释至1000mL。
(2)磷酸三钠溶液：称68.5g 无水磷酸钠,用水稀释至1000mL。
(3)硼酸盐缓冲液（pH9.1～9.2）：称54.64g 带有10 结晶水的四硼酸钠，用水稀释至
1000mL 。
(4)磷酸铜悬浮液：搅拌情况下，把氯化铜液200mL，缓慢倒入400 mL 的磷酸三钠溶液
中，把悬浮液以2000r/min 速度离心5min ，用硼酸盐缓冲液再悬浮沉淀物，洗涤离心3 次，
把最后的沉淀物悬浮在硼酸盐缓冲液中，并用缓冲液稀释至1L。
(5)1-氟-2，4 二硝基苯(FDNB)溶液：吸取FDNB10mL 用甲醇稀释至100mL。
(6)赖氨酸-HCl 标准溶液：称取一定量赖氨酸-HCl，用水配成200mg/L 的工作标准液。
(7)100g/L 丙氨酸溶液。
3．测定
(1)称取通过40 目筛的均匀试样1.00g，置于100mL 烧瓶中。另吸取赖氨酸-HCl 标准工
作液5mL（相当1mg 赖氨酸-HCl），连同试剂空白同时进行试验。
(2)向各烧瓶中加入25mL 磷酸铜悬浮液，然后再加10%丙氨酸1.0mL,振摇15min。吸
取10%FDNB 溶液0.5mL.置于各处理烧瓶中,将烧瓶置沸水中加热15min。
(3)取出烧瓶,立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,并不断摇动使之酸化和分散均匀。
(4)烧瓶中的溶液冷却至室温,用水稀释至100mL.取约40mL 悬浮液进行离心。
(5)用25mL 二乙基醚提取上清液3 次，除去醚。并将溶液收集于有刻度试管中,于65℃
水浴中加热15min，以除去残留的醚。并记录溶液的毫升数。
(6)吸取上述各处理液10mL，分别与95%乙醇溶液10mL 混合，用滤纸过滤。
(7)用试剂空白液凋零，测定样液A390nm，与赖氨酸-HCl 标准液对照，求出样品中赖氨
酸-HCl 的含量。
本法在 0～40mg/L 赖氨酸溶液范围内呈良好线性关系。
4．说明
(1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加总氨基酸的浓度，有助于赖氨酸-HCl 浓度
具有良好的线性关系。
(2)用醚提取酸性溶液，可将所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，并把FDWB
的产物破坏，否则这些产物在390nm 处存在干扰。
（二）色氨酸的测定
1.原理
样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生
成哈尔满化合物（norharman），具有特征荧光值，可以进行定量测定。
2．试剂
(1)0.3mmol/L 三氯化铁-三氯乙酸溶液：称取三氯化铁(FeCl3•6H2O)41mg，加入10%三
氯乙酸溶液溶解并定溶至500mL。
(2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%～38%)5.5mL，加水至100mL。
(3)色氨酸标准溶液：称取10mg 色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解并定容至100mL,
置棕色瓶中备用,使用时用水稀释成1mg/L 的标准溶液.
3．测定
称取样品粉末 100～200mg 于离心管中，加入4mL 乙醚,摇匀后过夜，以3000r/min 速
度离心。将乙醚提取液移入试管内,并用乙醚洗涤残渣3 次，收集乙醚液于试管中，于40℃
水浴除去醚。残留物中加入6.25mol/L N aOH 4mL，火焰封口，于110℃水解16～24h。水
解液用4mol/L HCl 溶液调节至pH6～8 后,用水定容至50mL,过滤备用。
吸取滤液 0.2mL，加入2%甲醛0.2mL 和0.3mmol/L 三氯化铁-三氯乙酸混合液2mL，
摇匀后于100℃水浴中加热1h，取出，冷却后用水定容至10mL。在激发波长为365nm，发
射波长449nm 条件下，测定样品的荧光强度，与色氨酸标样作对照，求出样品中色氨酸含
量。
本法在 0～10mg/L 色氨酸溶液范围内呈良好线性关系。

Ⅳ 氨基酸的检测方法有哪些

1. 分光光度法氨基酸检测：主要是利用氨基酸与衍生剂发生化学反应，产生蓝紫色化合物，该化合物在某一波长处有最大吸收峰，根据吸收值大小得到氨基酸含量。常用的衍生剂为茚三酮。
2. 毛细管电泳法氨基酸检测：根据分离原理的不同，可分为毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等电电泳、毛细管等速电泳以及胶束电动力学毛细管电泳。其中，毛细管区带电泳和胶束电动力学毛细管电泳可用于氨基酸检测。
3. 近红外光谱法氨基酸检测：利用有机化合物的含氢基团在特定波长区域跃迁，产生光谱的变化，结合统计学方法间接地实现氨基酸的定量检测。
4. 气相色谱法氨基酸检测：将氨基酸衍生化处理变为容易气化的物质，根据气态样品中各组分在流动相和固定相中的分配系数的不同，实现对氨基酸的定量分析。
5. 高效液相色谱法氨基酸检测：是最常用的一种氨基酸检测方法。由于大多数氨基酸本身没有紫外吸收和荧光反应，因此需要对样品进行衍生化处理将其转化为有紫外吸收和发射荧光的物质，衍生可分为柱前衍生和柱后衍生。

Ⅳ 苏氨酸的测定

方法名称： 苏氨酸原料药—苏氨酸的测定—电位滴定法
应用范围： 本方法采用滴定法测定苏氨酸原料药中苏氨酸的含量。
本方法适用于苏氨酸原料药。
方法原理： 供试品加无水甲酸和冰醋酸溶解后，照电位滴定法用高氯酸滴定液滴定，并将滴定的结果用空白试验校正，根据滴定液使用量，计算苏氨酸的含量。
试剂： 1.冰醋酸
2.无水甲酸
3. 高氯酸滴定液（0.1mol/L）
4.基准邻苯二甲酸氢钾
仪器设备：
试样制备： 1.高氯酸滴定液（0.1mol/L）
配制：取无水冰醋酸（按含水量计算，每1g水加醋酐5.22mL）750mL，加入高氯酸（70~72%）8.5mL，摇匀，放冷，加无水冰醋酸适量使成1000mL，摇匀，放置24小时。若所测供试品易乙酰化，则须用水分测定法测定本液的含水量，再用水和醋酐调节至本液的含水量为0.01%~0.2%。
标定：取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.16g，精密称定，加无水冰醋酸20mL使溶解，加结晶紫指示液1滴，用本液缓缓滴定至蓝色，并将滴定结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。
操作步骤： 精密称取供试品约0.1g，加无水甲酸3mL与冰醋酸50mL使溶解，照电位滴定法用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于11.91mg的C4H9NO3。
注：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一。“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。
参考文献： 中华人民共和国药典，国家药典委员会编，化学工业出版社，2005年版，二部，p.237。

Ⅵ 我要测定大米中赖氨酸和苏氨酸的含量，求完整国标方法。谢谢了。

大米氨基酸含量:单位（mg/100g大米）
异亮氨酸 278
亮氨酸 549
赖氨酸 239
蛋氨酸 181
胱氨酸 166
苯丙氨酸357
酪氨酸 307
苏氨酸 241
色氨酸 128
缬氨酸 394
精氨酸 581
组氨酸 141
丙氨酸 388
天冬氨酸 587
谷氨酸 1219
甘氨酸 303
脯氨酸 272
丝氨酸 338
大米的蛋白质含量可以按8g蛋白质/100g大米来算，也就是说上面的数字除以8就是你要的数据。

Ⅶ 饲料中赖氨酸含量是怎么鉴定的

苏氨酸是由W．C．Rose 1935年从纤维蛋白水解产物中分离和鉴定出来的，现已证明是最后被发现的必需氨基酸，它是畜禽的第二或第三限制性氨基酸，它在动物体内具有极其重要的生理作用。如促进生长、提高免疫机能等；平衡日粮氨基酸，使氨基酸比例更接近于理想蛋白质，从而降低畜禽对饲料中蛋白含量的要求。缺乏苏氨酸，可导致动物采食量降低、生长受阻、饲料利用率下降、免疫机能抑制等症状。近年来，赖氨酸、蛋氨酸合成品在饲料中得到了广泛应用，苏氨酸逐渐成为影响动物生产性能的限制性因素，对苏氨酸的进一步研究，有助于有效地指导畜禽生产。 1、苏氨酸的理化性质 苏氨酸的化学名称为α-氨基-β-羟丁酸，因其结构类似于苏糖，故命名为苏氨酸，是最后发现的必需氨基酸。其分子式为C4H9NO3，结构式为CH3-CH(OH)-CH(NH2)-COOH，相对分子质量为119.18。从结构式可以看出，苏氨酸分子中具有2个不对称碳原子，有4种异构体，其中D-苏氨酸不能被动物吸收利用。天然存在的 L-苏氨酸为无色或微黄色晶体，无臭、微甜，可溶于水，20 ℃时溶解度为9 g/100 mL，难溶于有机溶剂，熔点为253～257℃；D-苏氨酸为斜方晶，是无色或白色结晶粉末，溶于水，不溶于有机溶剂，易被碱破坏，熔点229 ℃～230 ℃。 苏氨酸是唯一不经过脱氨基和转氨基作用而是通过苏氨酸脱水酶和苏氨酸脱氢酶以及苏氨酸醛缩酶催化转变为其他物质。苏氨酸除了可以平衡体内的氨基酸之外，还可以作为一碳单位来源，参与嘌呤和嘧啶的生物合成以及S-腺苷甲硫氨酸的生物合成、并可作为各种化合物甲基化的供体。2、苏氨酸在养猪生产中的作用 2.1 平衡氨基酸，促进体内蛋白的合成，降低日粮蛋白水平 苏氨酸的一个重要作用是平衡氨基酸，促进蛋白质合成。日粮中不同的氨基酸水平及比例会影响动物体内氮的利用。添加苏氨酸可平衡整体氨基酸水平，使苏氨酸与赖氨酸保持适当的比例对生产性能的影响尤为明显，冯杰、许梓荣(2003)研究表明，赖氨酸和苏氨酸的比值为0.72时效果最好

Ⅷ 酸碱滴定法和电位滴定法测氨基酸含量

小恶一下 呵呵！
方 法 电 极 系 统水溶液中和法 玻璃-饱和甘汞

滴定前可加入指示剂，观察终点前至终点后的颜色变化，以选定该品种终点。

电位滴定法与永停滴定法是容量分析中用以确定终点或选择核对指示剂变色域的方法。选用适当的电极系统可以作氧化还原法、中和法（水溶液或非水溶液）、沉淀法、重氮化法或水分测定法等的终点指示。

电位滴定法选用2支不同的电极。1支为指示电极，其电极电势随溶液中被分析成分的离子浓度的变化而变化； 另1支为参比电极，其电极电势固定不变。在到达滴定终点时，因被分析成分的离子浓度急剧变化而引起指示电极的电势突减或突增，此转折点称为突跃点。

滴定法 (1)电位滴定法 将盛有供试品溶液的烧杯置电磁搅拌器上，浸入电极，搅拌，并自滴定管中分次滴加滴定液；开始时可每次加入较多的量，搅拌，记录电位；至将近终点前，则应每次加入少量，搅拌，记录电位；至突跃点已过，仍应继续滴加几次滴定液，并记录电位。

滴定终点的确定 用坐标纸以电位(E)为纵座标，以滴定液体积(V)为横坐标，绘制E－V曲线，以此曲线的陡然上升或下降部分的中心为滴定终点。或以△E/△V(即相邻两次的电位差和加入滴定液的体积差之比)为纵坐标，以滴定液体积(V)为横座标，绘制（△E/△V）-V曲线，与△E/△V的极大值对应的体积即为滴定终点。也可采用二阶导数确定终点。根据求得的△E/△V值，计算相邻数值间的差值，即△2E/△V2，绘制(△2E/△V2)-V曲线，曲线过零时的体积即为滴定终点。 如系供指示剂变色域的选择核对，滴定前加入指示剂，观察终点前至终点后的颜色变化，以选定该品种终点时的指示剂颜色

Ⅸ 如何用液相色谱仪测氨基酸

反相高效液相色谱法测定烟叶中的游离氨基酸
氨基酸是烟草中的一类重要化学物质，在烟草调制、醇化或发酵、加工直至燃烧过程中，游离氨基酸与还原糖之间可发生酶催化及非酶催化的棕色化反应，生成多种具有蒸煮、烤香、爆米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶类等杂环化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸还可自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。氨基酸含量与烟草制品的吃味有着密切的关系，氨基酸在燃烧裂解过程中一般形成具有刺激性的含氮化合物，对烟气香吃味产生不良影响，个别氨基酸还产生HCN等危害健康的烟气成分。一般说来，氨基酸含量太高，烟气辛辣、味苦、刺激性强烈；含量太低时烟气则平淡无味缺少丰满度。因此对氨基酸的分析是一项很有意义的工作，二十世纪60年代以来，国内外在这方面做了大量的工作[1-5]。
植物游离氨基酸样品的制备，国内外采用的提取剂和纯化方法各不相同。据文献报道[6-7]，盐酸、不同浓度的乙醇溶液均可以用来提取植物组织中的游离氨基酸；提取液纯化则有用阳离子交换树脂、5%磺基水杨酸、活性炭或乙醚等方法。本实验对不同的提取方式和不同的纯化方法进行了对比研究，确定提取烟叶中游离氨基酸的较佳提取剂和纯化方法。提取、纯化后的样品，采用OPA、FMOC联合柱前衍生反相高效液相色谱法对烟叶中的游离氨基酸进行了测定。该方法使带氨基和亚氨基基团的氨基酸能够被同时测定，且得到较好的定性定量结果。
1 实验
1.1 仪器
Agilent公司HP1100型高效液相色谱仪(带可变波长紫外检测器和自动进样器)，PE公司Lambda Bio40 紫外-可见分光光度计。
1.2 试剂
正缬氨酸（Norvaline，内标），OPA ，FMOC，均为色谱纯，Agilent公司提供；硼酸缓冲溶液，Agilent公司提供；
醋酸钠(NaAc)，分析纯，中国医药（集团）上海化学试剂公司；三乙胺（TEA），四氢呋喃（THF），乙腈（CH3CN），甲醇(MeOH)，均为色谱纯，Fisher公司试剂；
氨基酸标样包括：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），均为生化试剂，中国医药（集团）上海化学试剂公司；
苯乙烯阳离子交换树脂（732型），天津树脂厂。
1.3 样品处理
将烟叶在烘箱中恒温40℃烘干至恒重，粉碎，过80目筛，筛下物为实验用烟样粉末，置于广口瓶中备用。准确称取烟样粉末1.000g于干燥的洁净试管中，用一定浓度的乙醇溶液室温超声波提取半小时，过滤，相同浓度的乙醇溶液洗涤，再提取一次，合并后的滤液用阳离子交换柱洗脱，然后用95ml 4mol/L氨水淋洗阳离子交换柱，淋洗液恒温浓缩至干，最后用3ml 0.1mol/L稀盐酸溶液溶解浓缩物，将此溶液离心分离20min，0.45μm微孔滤膜过滤，加入浓度为5nmol/μ1的内标10μ1，定容至50ml，HP1100液相色谱仪进行氨基酸分析。
样品自动柱前衍生化：Agilent公司G1313A自动进样器进样。程序为：吸取5μl硼酸缓冲液，再吸取1μ1 OPA试剂，洗针一次，吸取样品2μl，原位混合6次。吸取1μl FMOC试剂，洗针一次，原位混合3次，进样。
1.4 色谱条件
色谱柱：Hypersil AA-ODS C18 2.1×200mm
流动相A：1.36±0.025g醋酸钠，加入500ml纯水溶解，加90μl三乙胺，用1%醋酸调pH=7.20±0.05，再加入1.5ml四氢呋喃，混合均匀。
流动相B：1.36±0.025g醋酸钠，加入100ml纯水溶解，用1%醋酸调pH=7.20±0.05，将此溶液加至200ml乙腈和200ml甲醇的混合物中，并混合均匀。
流速：0.45ml/min
柱温：40℃
紫外检测波长: 0～16min， 338nm； 16～25min，262nm
淋洗梯度：见表1
表1 流动相的淋洗梯度表
Table 1 The gradient time table of mobile phase
序列 时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 流速（ml/min）
1 0.00 100.0 0.0 0.450
2 15.50 40.0 60.0 0.450
3 18.00 0.0 100.0 0.450
4 21.00 0.0 100.0 0.800
5 23.90 0.0 100.0 0.800
6 24.00 0.0 100.0 0.450
7 25.00 100.0 0.0 0.450
1.5 氮基酸的定性
用标样色谱图、文献参照和标样加入的方法，通过对照保留时间进行定性，对氨基酸的出峰顺序加以确认。
1.6 内标法定量
准确移取浓度为10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合标样100μl于带内衬管的样品瓶中，再加入250pmol/μ1内标溶液100μl，充分混合，液相色谱分析，仪器自动计算各氨基酸的标准曲线。
2 结果与讨论
2.1 萃取溶剂的比较
氨基酸可溶解于水、乙醇、甲醇、稀酸等，因此它们均可作为烟叶中游离氨基酸的萃取溶剂，传统的方法是用乙醇和0.1mol/L的盐酸。实验发现，乙醇和0.1mol/L的盐酸萃取方法比较，提取出的烟叶中的游离氨基酸的总量变化不大，但用盐酸提取的样品分析时RSD%较大，平均8.51%，其中超过10%的有4个，甘氨酸的RSD%最大为20%；而用乙醇提取的样品分析时RSD%相对较小，平均5.12%，超过10%的只有1个。而且盐酸提取液过滤速度慢，需要30-40min，而乙醇提取液过滤只需10min左右；因此，本实验选择乙醇作为烟叶中游离氨基酸的萃取溶剂。
2.2 乙醇浓度的选择
选择五种不同浓度的乙醇溶液进行了烟样中游离氨基酸的提取，测定不同条件下提取液中游离氨基酸的总量，结果如图1。图中显示，在乙醇溶液浓度为80%时，烟样中总游离氨基酸的提取量最大。而且不同浓度下游离氨基酸的RSD%没有明显的变化，因此，选择80%的乙醇溶液来进行烟样中游离氨基酸的提取。

2.3 不同纯化方法的确定
在最佳乙醇溶液浓度下，分别用活性炭加入提取液吸附杂质、乙醚加入提取液萃取分离杂质、5%磺基水杨酸加入提取液沉淀去除杂质和阳离子交换树脂吸附杂质四种方法进行了纯化实验。结果发现，活性炭作为纯化剂时其色谱图中杂质峰较少，但同时氨基酸峰亦有多个消失，主要是因为活性炭对氨基酸也有较强的吸附，它在吸附杂质的同时也吸附了需要检测的氨基酸，故活性炭不适合作为纯化剂使用。乙醚和5%磺基水杨酸作为纯化剂时，杂质去除不完全，其色谱图均表现为杂质峰较多，湮没了大量氨基酸峰，且基线漂移严重，给定性定量工作带来困难。当用阳离子交换树脂进行纯化时，其色谱图中杂质峰较少，基线平稳，氨基酸峰分离较好，均可以进行定性和定量分析，故本实验选择了阳离子交换树脂作为纯化手段。
2.4 色谱分离
2.5 线性范围及标准曲线
分别取浓度为10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合标样加入等体积的250 pmol/μ1的内标溶液，进行HPLC分析，以氨基酸浓度为横坐标，氨基酸与内标的面积比为纵坐标，得到各个氨基酸的标准曲线，如表2所示。从表中可以看出，各氨基酸在10-1000 pmol/μ1的浓度范围内均有良好的线性，各氨基酸标准曲线的线性相关系数均大于0.99。
表2 氨基酸的标准曲线
Table 2 Standard curves of 17 amino acids
氨基酸 线性方程 相关系数
Asp Y=0.007037x+0.004689 0.9972
Glu Y=0.007520x+0.005375 0.9961
Ser Y=0.006903x+0.038212 0.9988
His Y=0.003719x+0.020168 0.9945
Gly Y=0.005851x+0.018235 0.9966
Thr Y=0.006932x+0.021072 0.9978
Ala Y=0.006275x+0.015314 0.9912
Arg Y=0.006088x+0.016113 0.9920
Tyr Y=0.006734x+0.015022 0.9993
Cys Y=0.006004x+0.009876 0.9985
Val Y=0.006432x+0.009932 0.9927
Met Y=0.006574x+0.010346 0.9905
Phe Y=0.005098x+0.019023 0.9962
Ile Y=0.005976x+0.016235 0.9953
Leu Y=0.006044x+0.015332 0.9964
Lys Y=0.006833x+0.010437 0.9969
Pro Y=0.022455x+0.009376 0.9922
2.6 重现性实验
取云南C2F99烟样做平行实验（n=5），进行烟叶中游离氨基酸含量的检测，结果发现： Asp和 Glu含量的RSD%分别为8.0%和8.6%，这可能是二者的分离度不高引起的；His的RSD%为9.0%，这可能与其含量较低，分离效果不好有关。其它氨基酸含量的RSD%均处在3%～7%。
2.7 回收率实验
用标样加入法进行回收率实验，结果见表3。 Thr的回收率仅为68.0%，原因可能与其含量较少有关；其它15种氨基酸的回收率在81.0%～110.5%，平均回收率为93.9%，说明该方法的回收率结果令人满意。
表3 分析方法的回收率
Table 3 Recovery percents of the analytical method
氨基酸 加入量（mg/g烟样） 样品含量（mg/g烟样） 测定值（mg/g烟样） 差值（mg/g烟样） 回收率%
Asp 0.200 0.320 0.499 0.179 89.5
Glu 0.200 0.309 0.484 0.175 87.5
Asn 0.200 0.986 1.208 0.222 110.0
Ser 0.200 0.172 0.334 0.162 81.0
Gln 0.200 0.186 0.368 0.182 91.0
His 0.200 0.106 0.297 0.191 95.5
Gly 0.200 0.064 0.279 0.215 107.5
Thr 0.200 0.052 0.188 0.136 68.0
Ala 0.200 0.642 0.835 0.193 96.5
Arg 0.200 0.266 0.463 0.197 98.5
Val 0.200 0.090 0.259 0.169 84.5
Phe 0.200 0.218 0.406 0.188 94.0
Ile 0.200 0.026 0.191 0.165 82.5
Leu 0.200 0.028 0.199 0.171 85.5
Pro 0.200 1.432 1.653 0.221 110.5
Tyr 0.200 0.062 0.245 0.183 91.5
2.8 样品分析
利用该方法对不同等级的烟叶中游离氨基酸的含量进行了分析，结果见表4。从表中可以看出，在所分析的样品中，烤烟烟叶中含量最高的氨基酸是Pro，白肋烟烟叶中含量最高的氨基酸是Asp和Asn；白肋烟烟叶中氨基酸的含量高于烤烟烟叶；相同等级的烤烟烟叶，云南烟叶中的氨基酸含量高于其它产区。
表4 不同等级烟叶中游离氨基酸的含量（mg/g烟样）
Table 4 Amounts of free amino acids in different
grade tobacco leaves（mg/g tobacco leaves）
氨基酸 云南烤烟C1F 云南烤烟C2F 云南烤烟C1L 云南烤烟B1F 云南烤烟B2F 福建烤烟B1F 福建烤烟C1F 四川烤烟C1F 四川烤烟B1F 贵州烤烟C1F 贵州烤烟B1F 贵州烤烟C1L 鄂西白肋中一 鄂西白肋中二
Asp 0.24 0.31 0.60 0.40 0.38 0.37 0.26 0.37 0.26 0.26 0.32 0.35 1.73 1.59
Glu 0.36 0.32 0.21 0.17 0.16 0.11 0.15 0.20 0.30 0.32 0.29 0.25 0.54 0.61
Asn 0.91 0.34 1.50 0.95 0.38 0.18 0.25 0.35 0.32 0.44 0.55 0.48 7.70 7.62
Ser 0.16 0.10 0.18 0.16 0.10 0.12 0.24 0.21 0.19 0.20 0.19 0.15 0.62 0.58
Gln 0.19 0.05 0.22 0.17 0.04 0.06 0.10 0.11 0.10 0.11 0.15 0.10 0.18 0.20
His 0.11 0.02 0.14 0.10 0.06 0.06 0.11 0.09 0.07 0.09 0.08 0.09 0.20 0.22
Gly 0.10 0.09 0.19 0.17 0.07 0.08 0.12 0.15 0.12 0.15 0.13 0.12 0.16 0.19
Thr 0.05 0.05 0.08 0.06 0.05 0.04 0.08 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.19 0.16
Ala 0.65 0.55 0.84 0.69 0.54 0.51 0.65 0.59 0.55 0.48 0.53 0.70 0.57 0.55
Arg 0.29 0.21 0.32 0.28 0.18 0.26 0.32 0.28 0.25 0.33 0.29 0.33 0.48 0.42
Tyr 0.06 0.07 0.06 0.07 0.06 0.05 0.07 0.05 0.06 0.06 0.07 0.06 0.10 0.15
Val 0.10 0.10 0.12 0.11 0.10 0.14 0.15 0.13 0.12 0.15 0.14 0.13 0.21 0.25
Met 0.07 0.07 0.09 0.08 0.06 0.06 0.08 0.08 0.08 0.07 0.09 0.08 0.12 0.13
Phe 0.26 0.12 0.28 0.23 0.10 0.21 0.25 0.21 0.25 0.28 0.30 0.33 0.44 0.59
Pro 1.14 0.83 2.13 1.51 0.69 0.66 1.03 1.23 1.11 1.32 1.18 1.09 0.25 0.35
总量 4.69 3.23 6.96 5.15 2.97 2.91 3.86 4.14 3.86 4.33 4.37 4.31 13.49 13.61
3 结论
本烟叶中游离氨基酸的分析方法采用80%的乙醇作为萃取溶剂，阳离子交换树脂对提取液进行纯化，能够最大程度地提取烟叶中的游离氨基酸并较好地去除了影响氨基酸测定的杂质，使色谱图中杂质峰较少；OPA、FMOC联和柱前衍生使带氨基和亚氨基基团的氨基酸同时得到测定；良好的梯度洗脱使各个氨基酸峰得到较好的分离，并使定量结果更加可靠。