研究dna时用的什么散射方法

Ⅰ 什么叫DNA衍射图谱

经过学习得知皮毛，与大家分享。
用X射线照射DNA分子，观察射线在照相底片上产生的点子（衍射花样），计算点子的分散角度等（每一点子的分散角度代表DNA分子的一个原子的位置或若干原子团的位置）推测分子排列。
最关键的第51号图谱是下图，1952年5月拍摄。

照片中心X射线反射（使X射线底片变黑）的图象是交叉的，说明它是螺旋形的，顶部和底部最浓黑的部分，说明嘌呤碱和嘧啶碱垂直于螺旋轴，每隔3.4埃规律出现一对。

对A型DNA、B型DNA拍了好多张X射线衍射图谱，这两张是截面的，也有丝状（链形态的），可以得到34埃的数据。富兰克林还发现在翻转180度之后看起来还是一样，沃森与克里克在得到这一信息后，意识到两条链是反向的。
在得到51号图时，还得到的了一些数据。
1953年2月24日富兰克林经过计算分析得出双股螺旋的结论，而沃森与克里克则是尝试以双螺旋模型与这些数据信息吻合。当时自然杂志同时发表了三篇论文，另二篇是威尔金斯的和富兰克林与蓝道夫的。

解读DNA晶体X射线衍射图谱，要用到很复杂的数学计算。

X射线衍射原理： 1912年劳埃等人根据理论预见，并用实验证实了X射线与晶体相遇时能发生衍射现象，证明了X射线具有电磁波的性质，成为X射线衍射学的第一个里程碑。当一束单色X射线入射到晶体时，由于晶体是由原子规则排列成的晶胞组成，这些规则排列的原子间距离与入射X射线波长有相同数量级，故由不同原子散射的X射线相互干涉，在某些特殊方向上产生强X射线衍射，衍射线在空间分布的方位和强度，与晶体结构密切相关。这就是X射线衍射的基本原理 。

Ⅱ DNA与蛋白质相互作用的研究方法有哪些

研究蛋白质与DNA相互作用的主要方法
一、引言
在许多的细胞生命活动中,例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题.
重组DNA技术的发展,人们已分离到了许多重要的基因.现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性.为此需要：
a、鉴定分析参与基因表达调控的DNA元件；
b、分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子；
这些问题的研究都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用.
研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括：
a、凝胶阻滞实验； b、DNase 1 足迹实验；
c、甲基化干扰实验； d、体内足迹实验； f、拉下实验.
二、凝胶阻滞实验
1、概念：
凝胶阻滞实验（Gel retardation assay）,要叫做DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay）或条带阻滞实验（Band retardation assay）是在八十年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术.
2、原理：
在凝胶电泳中,由于电场的作用,裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比.如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质,那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞,于是朝正极移动的距离也就相应的缩短,因而在凝胶中出现滞后的条带,这就是凝胶阻滞实验的基本原理.
3、过程:
1)\x09首先制备细胞蛋白质提取物（理论上其中含有某种特殊的转录因子）
2)\x09用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子的结合位点）
3)\x09这种被标记的探针DNA同细胞蛋白质提取物一起进行温育,于是产生DNA-蛋白质复合物
4)\x09在控制使DNA-蛋白质保持结合状态的条件下,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
5)\x09最后进行放射自显影,分析电泳结果
4、实验结果的分析：
a、如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部,这就表明在细胞提取物中不存在可以同探针DNA相互结合的转录因子蛋白质；
b、如果在凝胶的顶部出现放射性标记的条带,这就表明细胞提取物存在可与探针DNA结合的转录因子蛋白质.
5、DNA竞争实验：
DNA竞争实验（DNA competitive assay）的具体做法如下：
在DNA-蛋白质结合的反应体系中加入了超量的非标记的竞争DNA（competitor DNA）,如果它同探针DNA结合的是同一种转录因子蛋白质,那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的,这样绝大部分转录因子蛋白质都会被竞争结合掉,而使探针DNA仍然处于自由的非结合状态,可以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带；
如果反应体系中加入的竞争DNA并不能同探针DNA竞争结合同一种转录因子,结果在电泳凝胶中的放射自显影图片上就会出现阻滞的条带.
6、应用：
a、凝胶阻滞实验可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中,是否存在能同某一特定的DNA（含有转录因子结合位点）结合的转录因子蛋白质；
b、DNA竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位；
c、通过竞争DNA中转录因子结合位点的碱基突变可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的影响；
d、也可以利用DNA同特定转录因子的结合作用通过亲和层析来分离特定的转录因子.
三、足迹实验
1、定义:
足迹实验（foot-printing assay）,是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的DNA序列的位置及其核苷酸序列结构的专门实验方法.
2、原理：
当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI 酶的切割作用,而不会产生出相应的切割分子,结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区,俗称为“足迹”.
3过程：
将待检测的双链DNA分子在体外用32P作5‘末端标记,并用适当的限制性内切酶切出其中的一个末端,于是便得到了一条单链末端标记的双链DNA
在体外同细胞蛋白质提取物（细胞核提取物也可以）混合,形成DNA-蛋白质复合体
在反应混合物中加入少量的DNase I,并控制用量使之达到平均每条DNA链,只发生一次磷酸二酯键的断裂：
a、如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特定蛋白质,使DNase I消化之后,便会产生出距离放射性标记末端1个核苷酸,2个核苷酸,3个核苷酸------等等一系列前后长度均相差一个核苷酸的不间断的连续的DNA片段梯度群体；
b、如果DNA分子同蛋白质提取物中的某种转录因子结合,被结合部位的DNA就可以得到保护免受DNase I酶的降解作用；
除去蛋白,加样在20%序列胶上进行电泳分离,实验分两组:
a、实验组：DNA+蛋白质混合物
b、对照组：只有DNA,未与蛋白质提取物进行温育
最后进行放射性自显影,分析实验结果.
4、结果判断:
实验组凝胶电泳显示的序列,出现空白的区域表明是转录因子蛋白质结合部；与对照组序列比较,便可以得出蛋白质结合部位的DNA区段相应的核苷酸序列.
5、其他的足迹实验方法：
除了DNase1足迹试验之外,目前还发展出了若干种其他类型的足迹实验,例如：
a、\x09自由羟基足迹实验；b、菲咯啉铜足迹实验；c、DMS(硫酸二甲酯)足迹实验
DMS(硫酸二甲酯)足迹实验的原理
DMS能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化,而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割.如果DNA分子中某一区段同转录因子结合,就可以避免发生G残基的甲基化而免受六氢吡啶的切割作用.
四、甲基化干扰实验
1、概念：
甲基化干扰实验（Methylation interference assay）是根据DMS（硫酸二甲酯）能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤（G）残基甲基化,而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法.
应用这种技术可以检测靶DNA中G残基的优先甲基化,对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应,从而更加详细的揭示出DNA与蛋白质相互作用的模式.
2、实验步骤：
用DMS处理靶DNA使之局部甲基化（平均每条DNA只发生一个G碱基甲基化作用）
同细胞蛋白质提取物一起进行温育,促进使DNA与蛋白质的结合
进行凝胶电泳形成两种靶DNA条带：
a、\x09其一没有同蛋白质结合的DNA正常电泳条带
b、其二同特异蛋白质结合而呈现滞后的DNA电泳条带
将这两种DNA电泳条带分别从凝胶中切出,并用六氢吡啶进行切割,结果为：
a、甲基化的G残基被切割:因为转录因子蛋白质只能够同未发生甲基化的正常的结合位点结合,所以在转录因子DNA结合位点序列中的G残基如果被DMS甲基化之后,转录因子就无法同其结合位点（顺式元件）发生结合作用,从而使得结合位点中的G残基同样也要被六氢吡啶切割；
b、不具有甲基化G残基的靶DNA 序列则不会被切割
将结合蛋白质的DNA条带和不结合蛋白质的DNA条带,经六氢吡啶切割作用之后,再进行凝胶电泳
作放射自显影,读片并分析结果
3、结果判断：
a、同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列,经六氢吡啶切割之后,电泳分离呈现两条带,有一个空白区
b、不同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列,经六氢吡啶切割后,电泳分离呈现三条带,没有空白区域的出现.
4、应用：
a、甲基化干扰实验可以用来研究转录因子与DNA结合位点中的G残基之间的联系；
b、是足迹实验的一种有效的补充手段,可以鉴定足迹实验中DNA与蛋白质相互作用的精确位置
5、缺点：
DMS只能使DNA序列中的G和A残基甲基化,而不能使T和C残基甲基化.
五、体内足迹实验
上面讨论的三种研究转录因子与DNA相互作用的方法,有一个共同的不足之处在于它们是在体外进行的实验,因此人们就会考虑这些实验结果是否能够反映细胞内发生的真实生命过程,即细胞内发生的真实的DNA与蛋白质的相互作用情况.
为了解答这个问题,科学家就设计出了一种体内足迹试验（in vivo foot-printing assay）,该方法可以看做是体外DMS足迹实验的一个变种.
1、原理：
体内足迹试验的原理原则上同体外DMS足迹实验无本质差别,即
a、DMS能够使G残基甲基化；
b、六氢吡啶能特异的切割甲基化的G残基；
c、同特异转录因子蛋白质结合的识别序列中的G残基由于受到蛋白质的保护而不会被DMS甲基化,于是不会被六氢吡啶切割；
d、同对照的裸露的DNA形成的序列梯作比较,就会发现活细胞DNA形成的序列梯中缺少G残基没有被切割的相应条带.
2、过程：
用有限数量的化学试剂DMS处理完整的游离细胞,使渗透到胞内的DMS浓度恰好导致天然染色体DNA的G残基发生甲基化
对这些经过DMS处理的细胞提取DNA,并在体外加入六氢吡啶作消化反应
PCR扩增后作凝胶电泳分析,因为在体外实验中用的是克隆的DNA片段其数量足够,而在体内足迹实验中用的是从染色体DNA中分离获得的任何一种特异的DNA,其数量是微不足道的,所以需要经PCR扩增以获得足够数量的特异DNA
放射自显影,读片并记录读片的结果
3、结果判断：
a、能够同转录因子蛋白质结合的DNA区段其中G残基受到保护因而不会被DMS甲基化避免了六氢吡啶的切割作用；
b、体外裸露的DNA分子上,G残基被DMS甲基化而被六氢吡啶切割.
六、拉下实验（Pull-down assay）
拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验（binding assay in vitro）,是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法.其基本原理是将某种小肽（例如生物素、6-His标签以及谷胱甘肽转移酶等）的编码基因与诱饵蛋白的编码基因重组,表达为融合蛋白.分离纯化融合蛋白并与磁珠结合,使之固相化之后,再与表达目的蛋白的细胞提取物混合保温适当时间,例如在4℃下保温过夜,使目标蛋白同已经固定在磁珠表面的融合蛋白中的诱饵蛋白充分的结合.离心收集与固定化的融合蛋白（即与磁珠相互结合的融合蛋白）中的诱饵蛋白相结合的目的蛋白,经过煮沸处理使目的蛋白与诱饵蛋白相脱离从而从固相支持物（例如磁珠）上脱离下来,收集样品,再与目标蛋白的抗体作Western blotting分析,以检测出与诱饵蛋白的目标的目标蛋白.
染色质免疫共沉淀技术（ChIP） 真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在.因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径.染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法.它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息.CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系.而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用.由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用. 染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）是基于体内分析发展起来的方法,也称结合位点分析法,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法.这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰.ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系.近年来,这种技术得到不断的发展和完善.采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具. 它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来.IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法.目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的.实验最需要注意点就是抗体的性质.抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应.建议仔细检查抗体的说明书.特别是多抗的特异性是问题.其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质.多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解.为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合.另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白.即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果.再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验.每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例.抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清.缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释. ChIP的一般流程： 甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析. 在PCR分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR.但是现在随着荧光定量PCR的普及,大家也越来越倾向于Q-PCR了.此外还有一些由ChIP衍生出来的方法.例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合,具体方法和ChIP差不多,只是实验过程中要注意防止RNase,最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基础上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品）.
GST沉淀实验（GST-pull down实验）（细胞外蛋白质相互作用）5-11
上面提到,用酵母双杂交方法筛选到的蛋白需要作进一步的鉴定.鉴定方法之一就是 GST
沉淀实验.GST 沉淀实验主要是用来证明蛋白质胞外的相互作用.蛋白质在胞外的相互作用排除了酵母细胞内复杂体系的干扰,比较直接地检验蛋白质分子之间存在的物理的相互作用.同酵母双杂交实验一样,运用此法也可以证明相互作用的蛋白分子中是否有参与调节作用的结构域或 motif.GST\x09沉淀实验原理就是,把你要研究的蛋白基因亚克隆到带有GST（谷胱甘肽转移酶）基因的原核表达载体中,并在细菌中表达 GST 融合蛋白（GST-X）.把 GST 融合蛋白挂到带有 GST 地物的 Sepharose beads 上,然后把另一种蛋（Y）白加入其中.由于蛋白质之间的结合作用,形成了这样的复合物：GST-X----Y.这一复合物与固体支持物（Sepharose beads）又
结合在一起,可以被沉淀下来.此法又有在不同情况下的具体应用,以下一一作介绍.
（1）\x09GST 融合蛋白与重组蛋白的相互作用
GST 融合蛋白是在原核表达的,所以没有经过过多的象真核细胞内具有的蛋白修饰作用.
所以另一种用来检验相互作用的蛋白也可以用原核表达出来,也就是所谓的重组蛋白.当 GST融合蛋白把重组蛋白沉淀下来,然后用重组蛋白的抗体作 Western blotting 检测.
（2） GST 融合蛋白与体外 TNT 系统合成的多肽或蛋白的相互作用
用来检验与GST融合蛋白相互作用的蛋白或多肽也可以用TNT体外蛋白合成体系进行合
成,并且还可以在要合成的蛋白或多肽N端或C端加上便于检测的标签.GST融合蛋白沉淀下来的蛋白或多肽可以用该蛋白或多肽的抗体或标签抗体进行Western blotting检测.如果蛋白之间结合力非常弱,用Western blotting检测方法难以检测到,你可以在TNT体外合成时给蛋白进行同位素（S32）标记.这样沉淀下来的蛋白进行放射自显影,检测灵敏度将极大提高.
（3） GST 融合蛋白与细胞内源性蛋白质的相互作用
GST融合蛋白还可以把细胞提取物中有相互作用的内源性蛋白质沉淀下来.如果内源性蛋
白含量低或结合力弱,可以采用脉冲法使细胞在某一段时间内合成的所有蛋白质都标记上放射性同位素（S32）,然后提取细胞总蛋白与GST融合蛋白温育.GST融合蛋白沉淀下的带有放射性标记的蛋白跑电泳,进行放射自显影.
（4） GST 融合蛋白与细胞内瞬时表达的蛋白质的相互作用
当内源性蛋白质含量低,并且有可能影响蛋白质的相互作用,也可以把该蛋白的基因转染
到靶细胞内进行过表达,然后检验蛋白质相互作用.
（5） GST 融合蛋白与待测蛋白的相互作用有可能与待测蛋白的磷酸化状态有关在进行 GST 沉淀实验时,有时也会遇到比较复杂的情况,具体情况具体分析,分别对待.比如,两个蛋白质之间发生相互作用时有可能与蛋白磷酸化状态有关.或者蛋白首先被磷酸化后方能产生相互作用,或者磷酸化的蛋白必需脱磷酸化后才能产生相互作用.如果你确实在你
的实验中发现了其中一种情况,这将是一个非常有意义的结果.
3,\x09免疫共沉淀（co-immunoprecipitation ）（细胞内蛋白质相互作用）9-16
免疫共沉淀技术用来证明蛋白质在胞内是否有相互作用.一般来说,两种蛋白在细胞内发
生相互作用时会形成两种蛋白的复合物,这样就可以先用一种蛋白的抗体把免疫复合物沉淀下来,然后用另一种蛋白的抗体进行 Western blotting 检测,看两种蛋白之间是否确实形成免疫复合物,并能与 protein A/G agarose 一起沉淀下来.免疫共沉淀原理简单,但技术极为复杂.因为细胞内蛋白种类繁多,制约因素多.如果两种蛋白之间可以发生相互作用,并不是这两种蛋白所有分子都参与结合作用,也可能只有极少部分蛋白分子结合在一起（足以满足细胞功能需要）.在提取细胞蛋白时,如果条件不当就会破坏两种相互作用蛋白形成的复合物的稳定性,使得免疫共沉淀实验失败.如果两种蛋白在细胞内的结合力确实非常弱,那么免疫共沉淀也难以成功.如果知道发生相互作用的两个蛋白都是胞核蛋白,那么可以通过提取核蛋白,再进行免疫共沉淀实验,这样会大大减低背景的干扰.关于两种蛋白质之间胞内的相互作用,有时确实无法用免疫共沉淀实验证明.
（1） 细胞内过表达蛋白的免疫共沉淀
证明蛋白质胞内相互作用时,可以选择一个高效瞬时过表达系统（至于这一系统是否有内
源性靶蛋白无关紧要）.一般采取 COS 细胞作为真核表达株.把两种蛋白基因共转染到 COS 细胞内进行表达.由于人为进行大量表达,所以在胞内两种蛋白形成相互作用的复合物的量也相应增多.如果你手头没有这两种蛋白的抗体,可以把这两种蛋白的一端分别加上标签以融合蛋白形式表达,然后用商业化的抗标签抗体进行免疫共沉淀和 Western blotting 检测.
（2） 细胞内源性蛋白的免疫共沉淀
把两种蛋白共转染到 COS 细胞内进行过表达,进行免疫共沉淀实验,相对容易成功,但是
这一结果毕竟具有人工性,不能代表生理条件下真实的蛋白质相互作用.要想克服这一弱点,
可以做内源性的免疫共沉淀实验.这一技术要求极高,难度极大,但也最有说服力.因为细胞内内源性蛋白含量低,结合在一起形成复合物的量更低,难以检测.首先要证明所选择的细胞系是否具有这两种内源性的蛋白.另外,用于免疫沉淀和 Western blotting 检测的抗体要好.细胞裂解、收集以及免疫沉淀时时条件要温和,以保持蛋白复合物的天然结构.
（3） 组织内蛋白的免疫共沉淀
在体外可以大量培养细胞,然后制备细胞提取物,做内源性免疫共沉淀.由此可以推广到做
组织内免疫共沉淀.取动物组织（脑、肝、脾等）,切碎,匀浆,提取组织蛋白,进行免疫共沉淀实验.这一结果代表活体中蛋白质相互作用.
4,\x09蛋白质细胞内定位实验17-22
另一种经常用来检验蛋白质相互作用的方法是蛋白质细胞内定位技术.此法较为直观,可
以看到两种有相互作用的蛋白质在细胞内的分布（膜上、胞浆、胞核或其它细胞器等等）以及共定位的部位（在膜上共定位、在胞浆中某一部位或核内共定位等等）.有时相互作用的蛋白由于细胞内某种功能的需要结合在一起时,使得两种蛋白的分布发生变化.比如,某种蛋白也许在核内,当它与另一种具有穿梭功能的蛋白结合时,有可能被转运到胞浆中.这种情况的共定位则较为典型.在进行蛋白质共定位
（1） 利用有色荧光蛋白标记技术进行蛋白定位研究
此法也可称为活细胞定位.把两种具有相互作用的蛋白分别克隆到带有两种不同颜色荧光
蛋白（绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白）的载体中,共转染到功能细胞中（一般选用 COS7 细胞）表达带有荧光的融合蛋白.这样,相互作用的两种蛋白就被标上不同的荧光,可以在细胞内用荧光显微镜直接观测.在进行精确细胞定位或共定位时,必须用共聚焦荧光显微镜观测.因为共聚焦荧光显微镜（相当于医院给病人诊断的 CT）观测的是细胞内一个切面上的颜色.如果在一个切面上在同一区域看到两种颜色,就提示这两种蛋白在该区域内有相互作用.普通荧光显微镜看到的是一个立体图象,无法确定蛋白质共定位现象.在进行定位或共定位同时,也可以对细胞核进行染色.这样,在细胞中就有三种颜色.细胞核的显色帮助你确定共定位发生的位置.上面介绍的活细胞定位,其优点是表达的荧光蛋白荧光强,没有背景,观测方便.但缺点
是相互作用的蛋白由于标上荧光蛋白,实际上是两个融合蛋白.融合蛋白的定位结果或共定位结果是否与天然蛋白分布一致,有待于进一步确定.而利用免疫荧光标记技术可以避免这一缺点.
（2） 利用双色或多色染色的免疫荧光技术进行蛋白定位研究
免疫荧光的原理是,首先把细胞进行固定,然后用待检测靶蛋白的抗体（一抗）与细胞内
靶蛋白进行免疫反应,再用荧光素（如 FITC 和 TRITC 等）标记的二抗与一抗进行反应.这样就在细胞内形成免疫复合物（靶蛋白----一抗---二抗）,结果靶蛋白被标上颜色,然后可用共聚焦荧光显微镜观测定位与共定位结果.
免疫荧光技术最大优点就是可用来检测细胞内源性蛋白的定位及相互作用.当然也可以对
靶细胞进行转染表达目的蛋白,然后标记目的蛋白进行观测.免疫荧光技术的缺点是荧光相对较弱并且背景较高,结果受到干扰,所以这项技术不好掌握.为了结果的可靠性,要求严格设计阳性对照与阴性对照.
（3） 细胞内蛋白动态定位
有时细胞在正常状态下,有相互作用的蛋白在胞内可能暂时分开,没有共定位现象发生.
但是在某一个特定情况下,如细胞受到外界刺激时,细胞本身会产生应急反应,这时暂时分离的蛋白有可能发生相互作用,并产生共定位现象.所以在进行共定位研究时,可根据具体情况具体分析,必要时观测细胞内蛋白动态定位结果.

Ⅲ DNA实验室常用的DNA提取方法有哪些

提取DNA主要有SDS和CTAB法，其实提取效果的好坏主要看提取的对象是什么样的材料，在提取之前一定要好好分析材料的特性，然后在设计实验步骤。
一）CTAB法
CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7
mol/L
NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3
mol/L
NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。
（二）SDS法
利用高浓度的SDS，在较高温度（55—65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀（最常用的是加入5M的KAc于冰上保温，在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
以下是在提取热带水果DNA时设计的两种不同方法步骤，对比起来CTAB法好，在禾本科植物效果差不多！
1、
CTAB法
1）
在所需量的CTAB抽提液中加入2－巯基乙醇，使终浓度达2％（v/v）。将此溶液预热至65℃。
对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的2－ME/CTAB抽提液。
2）
用液氮（－196℃）或干冰（－78℃）冷却粉碎器/匀浆器，将0.5
g植物组织粉碎成细粉，然后将组织转移到2.0
ml离心管。
3）
加入800
µl预热的2－Me/CTAB，混合使之充分湿润，于65℃温育20
min，不时颠倒混匀。
4）
待冷至室温后，加入800
µl氯仿/异戊醇（24：1），颠倒混匀至溶液呈乳浊状----但不要振荡。25℃，10000
rpm离心10
min。
5）
上清（~700
µl）转移至另一干净的离心管中，加入5
µl
RNaseA贮液，37℃温育30
min。
6）
加入700
µl氯仿/异戊醇，颠倒混匀，25℃，10000
rpm离心10
min。
7）
上清（~600
µl）转移至另一干净的1.5
ml离心管中，加入600
µl异丙醇，颠倒混匀，室温或-20℃放置20
min。
8）
25℃，12000
rpm，离心10
min，收集沉淀。
9）
去上清，加1
ml70%乙醇洗涤沉淀两次。（25℃，12000
rpm，离心10
min）
10）凉干DNA，溶于50
µl
ddH2O，4℃保存备用。
2、
SDS法
①
将0.3
g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2
ml离心管中。
②
加入1.2
ml预热至65℃的提取缓冲液（其中加入3
μl
β—巯基乙醇，增加DNA的稳定性），置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。。
③
加入0.45
ml
5M的醋酸钾，混匀，冰浴20分钟，在10000
rpm离心20
min。需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，上清液转入另一离心管中。
④
加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000
rpm离心15
min。
⑤
转移上清液到另一新离心管中，加5
μl
RNaseA贮液，37℃温育30
min。
⑥
加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000
rpm离心15
min。
⑦
转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30分钟沉淀核酸。
⑧
25℃，12000
rpm，离心10
min，收集沉淀。
⑨
弃上清，70％乙醇洗两次。
⑩
凉干DNA，溶于50
µl
ddH2O，4℃保存备用。

Ⅳ DNA衍射图谱的衍射

衍射的结果是产生明暗相间的衍射花纹，代表着衍射方向（角度）和强度。根据衍射花纹可以反过来推测光源和光珊的情况。 为了使光能产生明显的偏向，必须使“光栅间隔”具有与光的波长相同的数量级。用于可见光谱的光栅每毫米要刻有约500到500条线 。 1913年，劳厄想到，如果晶体中的原子排列是有规则的，那么晶体可以当作是X射线的三维衍射光栅。X射线波长的数量级是10-8cm ,这与固体中的原子间距大致相同。果然试验取得了成功，这就是最早的X射线衍射。 显然，在X射线一定的情况下，根据衍射的花样可以分析晶体的性质。但为此必须事先建立X射线衍射的方向和强度与晶体结构之间的对应关系X射线纤维衍射技术 生物大分子中的螺旋分子,如角蛋白、胶原及遗传物质 DNA（脱氧核糖核酸）等大多难以结晶（寡聚核苷酸例外），但能聚集成为纤维。平行排列这些纤维也能使 X射线发生衍射。这些螺旋分子的外形相似于弹簧，有可测量的螺距和半径。每圈螺旋包含数目相同的单元。因此它们的长轴方向具有周期结构的性质。它们的衍射花样呈X形,且在水平方向衍射点按层线排列。由X形的斜度及层线的间距可以计算螺距和半径。由中心至垂直最远衍射弧的距离可以计算单元间沿螺轴方向的距离。由于这些大分子的径向侧链处于无序状态,它们对X射线仅产生背景散射。因此纤维衍射技术无法测定大分子中原子的空间位置。但是如果结合考虑这些大分子的化学组份及立体化学等性质，也可由衍射花样推断该分子的结构模型。DNA分子的右手双螺旋模型(图3)的建立是个典型的例子。这是由美国生物学家J.D.沃森和英国物理学家F.H.C.克里克于1953年提出来的。当时已知 DNA分子由多聚脱氧核苷酸链组成，并已知它是一种遗传物质。他们由纤维衍射的强度和花样（图4）推断该分子为双螺旋结构，并算出它的螺距为34埃，每圈螺旋包含10个由氢键连接的嘌呤－嘧啶碱基对，螺旋半径为10埃。这个模型很好地解释了 DNA分子作为遗传物质的自我复制机制。

Ⅳ 研究DNA结构与功能的方法有哪些

生命科学与化学有着密不可分的联系，我甚至认为生命科学就是用化学来解释生命。然而，仅仅知道一种物质的化学成分是远远不够的，结构才是其功能的基础。我们知道，构成元素相同的物质，由于结构不同，可能在功能上就相去甚远：左、右旋光物质的不同生理作用就是一个很好的例子。但是，我们不能孤立地来阐述生命科学与结构化学的关系，也就是说不能把生命科学看成一块，再把结构化学看成另一块，然后再说明他们间千丝万缕的联系；我认为，结构化学与生命科学是揉合在一起的，很多结构化学家在生命科学领域就有不凡的建树。鲍林就是以化学向生物学渗透的先驱者，他不仅进行了大分子研究，还对镰刀形细胞贫血分子病和大脑化学进行了大量的研究。然而我认为，最能体现结构化学与生命科学揉合一体的历史故事，就是鲍林与沃森和克里克关于DNA结构之争。在这个过程中，我们无法定义他们到底是化学家还是生物学家。而且，结构化学的知识不仅为他们建立模型提供了理论支持，而且在帮助他们判别真理与谬误、为他们的结论提供事实支持等方面起到了至关重要的作用。从这个故事中我们不仅可以看出，解决DNA结构这个世界性的生命科学课题，是许多化学家、物理学家、晶体学家、生化学家共同努力的结果，而且能受到许多在科学研究上的启发。在多学科交叉渗透的今天，我们更不能仅仅只重视专业课的学习，必须同时汲取其他学科的知识，为将来的研究打下基础。

在一九二四年以前，没有一个人真正懂得DNA的重要性。但就在那一年，科学家罗伯特·福尔根发现了一种方法能将DNA染成淡紫色。在这种方法的帮助下，科学家们发现DNA仅存在于细胞核中。到了一九三一年，科学家乔基姆·哈默林用实验证明了植物长成什么样子完全取决于细胞核。随后的一切实验事实都表明，发出遗传信息的正是细胞核里的DNA。

于是，在美洲和欧、亚、非三洲各试验室里的人们都开始研究这个问题。在美国，着名的化学家莱纳斯·鲍林开始了对DNA的研究。在剑桥大学的卡文迪斯实验室里，英国人弗朗西斯·克里克和美国人詹姆斯·沃森也着手进行对奇异的DNA结构的探索。这是一场用结构化学来解释生命科学的竞赛，也是“一个远方传奇大力士被两个无名小卒砍倒的故事”。虽然我们已经知道了这场竞赛的结果，但我认为，这一探索的过程更让人留下深刻的印象。我将双方的研究进行了一些对比，确实从中学到了一些东西，希望和大家一起探讨。

一、双方的开端：

当时的鲍林已经是化学界的“权威”，他致力于蛋白质的研究。1951年夏天，鲍林开始深入研究有关DNA的材料，并常常找人讨论。他认为，与蛋白质相比，弄清DNA的结构不会很难，“这算不上一个最为紧迫的问题”。DNA在重量上是染色体的一种重要成分，但蛋白质也一样。大多数学者认为，蛋白质部分最有可能包含着遗传的信息。相对而言，DNA似乎就比较简单了，它很可能只是一种结构性的成分，只是用来帮助染色体折叠和打开的。鲍林就这样认为。在1952年初，几乎所有重要的遗传学学者都持这一种观点。我们可以看看后来鲍林自己的话：“我以前就知道DNA是一种遗传物质的论点，然而我没有接受这一论点。你们知道，那时我正热衷于蛋白质的研究，我认为蛋白质最有可能是遗传物质，不可能是核酸 当然，核酸也有作用。在我着述的有关核酸的文字材料中，我总会提到核蛋白的概念。当时，我考虑得更多的是蛋白质，而不是核酸。”虽然如此，鲍林还是着手研究DNA的结构。此时，他需要清晰的DNA X光照片，他曾先后写信给相片持有者物理学家威尔金斯（英国）及其上司，但均遭拒绝。1951年11月，《美国化学学会学报》上刊登了一篇论述DNA结构的文章。鲍林据其深厚的结构化学基础，一下子就看出这篇文章的结果是错的；同时，此事刺激了他开始思考DNA是如何构筑起来的问题。鲍林设想，如果碱基朝外，那么螺旋的内核就应当是由磷酸堆积起来的。磷酸聚集在中间，碱基朝外，这与X射线的资料是“吻合”的。在鲍林的头脑中，DNA结构的问题就已经转化为如何将磷酸堆积在一起的问题了。我们现在知道，鲍林的这一开端是错的，并最终使他败给了沃森和克里克。另外还必须一提的是，鲍林对DNA研究总是被各种事务打断，使他曾多次中断自己的思路。是否是因为鲍林没能看到威尔金斯的相片而导致他的失败呢？暂且不回答这个问题，我们先来看看沃森和克里克是如何开始的。
在战争期间，克里克原来是从事武器方面研究的。后来他决定研究生物。于是他到剑桥大学学习分子学。至于沃森，他本来就一直在研究DNA。他到剑桥大学是为了对此作进一步的研究。他们都是热心探索的人。“沃·克组合”相对于鲍林的地位可以说是“一个在天，一个在地”，他们并没有引起人们多大的重视，也没有引起鲍林的注意。他们就凭着一股劲和对目标的执着追求开始了他们的研究。还必须提到的是另外两位对他们的成功起着至关重要的作用的人：一位是上文提到的物理学家威尔金斯，另一位是青年女晶体学家罗莎琳德·富兰克林。他们拍出了非常漂亮的DNA X光照片，不仅启发了沃森和克里克，而且为他们的发现提供了佐证。
鲍林颇为自信，感到自己有能力解开DNA之谜。唯一的问题是，会不会有人抢先取得胜果，但是，他不会把这一点真正放在心上。他认为威尔金斯和富兰克林两人(更不用说沃森和克里克了)，没有谁有足够的化学基础对鲍林产生严重的威胁。

二、对对手的不同看法：

鲍林是自负的，他不相信有人能够在他之前发现DNA的结构，特别是他认为没有人有他那样深厚的化学功底。他“知道”， 沃森是一个好学生，但因成绩还不够突出，因而他到加州理工学院当研究生的申请未被批准。克里克已经三十五六岁了，还在读研究生，年龄是大了一些。况且，卡迪文斯实验室的科学家们至今尚未在任何竞赛中打败过鲍林。甚至有人认为，沃森和克里克看上去就像是一对“杂耍演员”。
而沃森和克里克则不同。对于年方19的沃森来说，鲍林是一位值得仿效的榜样。在卢瓦蒙会议上，沃森就是围聚在鲍林身边的人之一，他十分用心地听了鲍林的讲话。克里克开始并不是鲍林的崇拜者，他是鲍林的竞争对手，因为鲍林曾用阿尔法螺旋表明他们的一篇关于蛋白质结构的论文漏洞百出，让克里克承受了由此而来的屈辱。从此，克里克借鉴了鲍林的研究方法。说实话，他们对鲍林这位怪杰都极为佩服。更重要的是，他们两人都互相倾慕，他们可谓是天生一对。相对于鲍林来说，沃森和克里克谦逊多了。

三、研究方法及进程：

鲍林首先想到DNA的结构可能是螺旋型，因为其他构型与他所看到和掌握的照片资料不相符合。但他认为，DNA是由三条链互相缠绕在一起，磷酸处于中央的位置。之后，他的工作重点就聚焦于找出磷酸分子在中央合理的排列方法。虽然他知道自己提出的构型不能完美地符合实验测算得出的数据和X光衍射照片，但他认为这些都只是细枝末节的东西，就像他发现蛋白质阿尔法螺旋一样 开始的时候也有难以解释的数据，他大胆地将之忽略，而其后的事实证明了他这种策略是明智的。另外，鲍林有些急于求成，他希望能够尽快地发表相关文章，抢在其他科学家之前，宣布自己再次成功地解决了又一世界性的难题。于是，他很快地发表了他“发现”的DNA结构。
鲍林将自己的论文也寄给了沃森和克里克。他们两人虚惊了一场，因为他们发现，鲍林设想的这种构型是他们最初设想的结果，当时他们将这一结果给晶体学家富兰克林看的时候，被她以充足的论据否认，因为水容量问题与这种构型严重不符。也正是因为这次错误，他们两人被认为不适合研究DNA构型问题，被拆散到不同的课题组，从事别的研究。但沃森和克里克并没有就此放弃，他们仍然私下坚持不懈地进行研究和探索。他们在研究方法上一直就有共识：与其推导出复杂的数学模型，直接而又明确地解释X光的衍射结果，还不如借助化学常识构筑结构的一个模型。正如沃森所说，他们决定“仿效鲍林，并在他本人发起的这场竞赛中将他击败”。富兰克林的批评已经促使他们将磷酸放到了分子的外侧；又受到奥地利生物化学家切加夫的启示，得知内侧各对碱基之间存在着一一对应的关系。他们开始设想，在螺旋中，嘌呤和嘧啶以某种方式挨次排列在分子中心下部。之后，他们看到了富兰克林最新的DNA照片，不仅使他们确认了DNA是一种螺旋，而且他们得到了几个主要参数。由此，他们开始着手制造模型，通过不懈的努力，最终获得了成功。

可以看出，不论是成功者还是失败者，他们都用了一种结构化学中重要的研究方法 建模。同时，沃森和克里克不仅受到了多学科领域的科学家的启示和帮助，而且他们自己都承认，他们的研究方法来源于伟大的化学家 鲍林。由此可见，生命科学是集多学科，特别是化学的大成所在，他与化学，乃至物理、数学的揉合可见一斑。

为什么鲍林会失败？

鲍林有着深厚的化学知识作为自己研究的基础。照常理而言，成功的应该是他，但他为什么输给了沃森和克里克呢？鲍林输在浮躁和自负上。他急于求成，因为DNA是当时最大的课题，他要去抢占这一高地。他没有把研究的准备工作做好就想碰碰自己的运气了。同时，他顺利解决阿尔法螺旋给他套上了成功的光环，他的确是世界上解决巨分子结构的最佳人选，但他也从此染上了自负的恶习，他以为自己不再需要做别人需要做的那些研究的准备工作了。他过于相信自己的直觉和运气，结果输掉了这场大比拼。

沃森和克里克为什么会成功？

其实这个问题的答案从前面的叙述中都可以看出，但我觉得最重要的一点是不懈的思索与踏实的努力。克里克不就是在因头疼而不得不休息，却又忍不住开始计算时找到了有关DNA结构的答案吗？他们虽然被拆散到两个不同的研究小组，但仍然踏实地合作与工作，正是这样，幸运之神才降临在他们的头上。另外还有一点，就是他们没有放过看似微不足道的东西。奥地利生物化学家切加夫将碱基一一对应的关系同样告诉了鲍林，但却没有得到鲍林的重视，而沃森和克里克并没有放过这一点，而最终获得启发，找到了DNA的正确结构。

结构化学与生命科学的揉合已无需多说，我相信这种相互融合在将来会愈演愈烈。最后我想总结的是有关鲍林的研究方法，毕竟沃森与克里克的成功也来源于此，相信它对所有的科研者都会有所帮助：

http://www.paper800.com/N66/DD172F26/
参考资料：

Ⅵ DNA衍射图谱的介绍

衍射又称为绕射，光线照射到物体边沿后通过散射继续在空间发射的现象。如果采用单色平行光，则衍射后将产生干涉结果。相干波在空间某处相遇后，因位相不同，相互之间产生干涉作用，引起相互加强或减弱的物理现象。 衍射的条件，一是相干波（点光源发出的波），二是光栅。

Ⅶ 沃森和克里克研究DNA分子结构时，运用了什么方法

答案是：
演绎法
归纳法

Ⅷ DNA测序可以采用哪些手段，并阐述各自的原理

这位是搞分子生物学的吗?
DNA测序的方法有很多种. 目前最常见的是双脱氧终止法了. 在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶. 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸(称为ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然后进行聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列了. 也许这样说你不一定明白. 举一个例子, 假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:
在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT.
所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段:
GA, GATCCGA,
同理在第二个反应中产生的都是以C结尾的片段:
GATC, GATCC,
在第三个反应中产生的都是以G结尾的片段:
G, GATCCG
在第四个反应中产生的都是以T结尾的片段:
GAT, GATCCGAT,
电泳时按分子量大小排列, A反应的片段长度为2, 7; C反应的为4, 5; G反应的为1, 6; T反应的为3, 8, 四个反应的产物分别电泳, 结果为

8 7 6 5 4 3 2 1

A | |
C | |
G | |
T | |

我们可以从右向左读, 为GATCCGAT, 至此, 测序完成(上面这个图在网络知道中显示不正常, 因为网络知道的网页用的是比例字体, 你如果想看它, 拷贝到记事本中, 用等宽的字体来看).

Ⅸ 沃森和克里克研究DNA分子结构时、运用了什么方法

演绎 归纳法