肿瘤耐药基因的研究方法

A. 新发现一个基因，如耐药基因，应如何进行研究

一般有以下步骤：
1。基因的表达调控
2。基因表达的蛋白功能
3。knockout, or overexpress再看细胞的反应。

B. 基因治疗肿瘤的原理是什么

肿瘤基因治疗的原理和技术 肿瘤基因治疗的原理，将目的基因用基因转移技术导入靶细胞，使其表达此基因此获得特定的功能，继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用，从而达到治疗之目的。基因治疗涉及目的基因、载体及受体细胞三方面。有效的基因治疗依赖于外源基因高效而稳定的表达。 基因治疗的靶细胞分为生殖细胞和体细胞两类，由于伦理和技术的问题，目前仅限于体细胞。 目前常用的基因转移技术，可以归纳为以下两种： 一种方法是回体转移或称“二步基因治疗”，即将受体细胞取出在体外培养并转移入外源基因，经过适当的选择系统，把重组的受体细胞回输病人体内，让外源基因表达以改善病人症状。这种方法是目前基因治疗普遍采用的方法，又称体外法（exvivo）。 另一种称为“直接法基因治疗”，是指不需要细胞移植而直接将外源DNA注射至机体内，DNA可以单纯注射，也可以与辅助物如脂质体一起注射，使其在体内转录、表达而发挥治疗作用，故又称为活体直接转移（invivo）。体内活体直接转移的基因治疗方式操作简单、直接、经济、容易推广，疗效也比较确切，缺点是存在疗效短，免疫排斥和安全性等问题，目前尚不成熟。体外法比较安全、经典、效果容易控制，缺点是步骤多、技术复杂、难度大、不容易推广。 基因转移的方法有化学法，生物法，物理法三大类。 化学法包括：磷酸钙沉淀法，葡聚糖法，脂质体融合法，受体介导法。 生物法包括：逆转录病毒载体系统，慢病毒载体系统，腺病毒载体系统，痘苗病毒载体系统，单纯疱疹病毒载体系统。因为生物法基因转移的效率明显高于前两类方法，是目前研究最多也是应用最广的方法。利用病毒载体介导基因转移，以其高转染率和良好的靶向性而成为肿瘤基因治疗中应用最广泛的方法，其中包括逆转录病毒、腺相关病毒（AAV）、痘苗病毒（VV）、单纯疱疹病毒（HSV）和腺病毒（AV）等载体。

C. 基因治疗的应用

你自己在里面摘抄吧 基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定序列。将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，目前基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。基因治疗的靶细胞主要分为两大类：体细胞和生殖细胞，目前开展的基因治疗只限于体细胞。基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病、类风湿等）。 基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。基因治疗与常规治疗方法不同：一般意义上疾病的治疗针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因治疗针对的是疾病的根源--异常的基因本身。基因治疗有二种形式：一是体细胞基因治疗，正在广泛使用；二是生殖细胞基因治疗，因能引起遗传改变而受到限制。 一、基因治疗的概念 狭义的概念 指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的 广义的概念 指把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法。 二、基因治疗的总体策略 基因治疗策略 1．基因治疗按基因操作方式分为两类，一类为基因修正（gene correction）和基因置换（gene replacement），即将缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，不涉及基因组的其他任何改变。通过同源重组（homologous recombination）即基因打靶（gene targetting）技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复。另一类为基因增强（gene augmentation）和基因失活（gene inactivation），是不去除异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因等的功能；或特异封闭某些基因的翻译或转录，以达到抑制某些异常基因表达。 按靶细胞类型又可分为生殖细胞（germ-line cell）基因治疗和体细胞（somatic cell）基因治疗。广义的生殖细胞基因治疗以精子，卵子和早期胚胎细胞作为治疗对象。由于当前基因治疗技术还不成熟，以及涉及一系列伦理学问题，生殖细胞基因治疗仍属禁区。在现有的条件下，基因治疗仅限于体细胞。 2．基因治疗药物的给药途径 基因治疗有两种途径：即ex vivo及 in vivo方式。①ex vivo 途径：这是指将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞（或异种细胞），经体外细胞扩增后，输回人体。ex vivo基因转移途径比较经典、安全，而且效果较易控制，但是步骤多、技术复杂、难度大，不容易推广；②in vivo 途径：这是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA。in vivo基因转移途径操作简便，容易推广，但目前尚未成熟，存在疗效持续时间短，免疫排斥及安全性等一系列问题。 (一)基因矫正 纠正致病基因中的异常碱基，而正常部分予以保留。 (二)基因置换 指用正常基因通过同源重组技术，原位替换致病基因，使细胞内的DNA 完全恢复正常状态。 (三)基因增补 把正常基因导入体细胞，通过基因的非定点整合使其表达，以补偿缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增强，但致病基因本身并未除去 (四)基因失活 将特定的反义核酸(反义RNA、反义DNA)和核酶导入细胞，在转录和翻译水平阻断某些基因的异常表达，而实现治疗的目的。 (五)“自杀基因”的应用 在某些病毒或细菌中的某基因可产生一种酶，它可将原无细胞毒或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞本身杀死，此种基因称为“自杀基因” (六)免疫基因治疗 免疫基因治疗是把产生抗病毒或肿瘤免疫力的对应与抗原决定族基因导入机体细胞，以达到治疗目的。如细胞因子(cytokine)基因的导入和表达等。 (七)耐药基因治疗 耐药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受化疗药物的能力，把产生抗药物毒性的基因导入人体细胞，以使机体耐受更大剂量的化疗。如向骨髓干细胞导入多药抗性基因中的mdr-1 三、基因治疗的基本程序 (一)治疗性基因的获得 (二)基因载体的选择 (三)靶细胞的选择 (四)基因转移方法 (五)转导细胞的选择鉴定 (六)回输体内 四、基因治疗的现状与展望 肿瘤的基因治疗 艾滋病的基因治疗 遗传病的基因治疗 基因治疗研究一般要符合下列要求 ①为已明确了的单基因缺陷疾病； ②仅限于体细胞； ③靶细胞的亲缘性和可操作性等； ④有明显疗效和无或低危害性等； ⑤表达水平稳定时程长； ⑥必须有动物实验基础。 遗传病的基因治疗(gene therapy)是指应用基因工程技术将正常基因引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治遗传病。纠正的途径既可以是原位修复有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以替代缺陷基因来发挥作用。 基因治疗的靶细胞可以分为两大类，即体细胞和生殖细胞。生殖细胞的基因治疗是将正常基因直接引入生殖细胞，以纠正缺陷基因。这样，不仅可使遗传疾病在当代得到治疗，而且还能将新基因传给患者后代，使遗传病得到根治。但生殖细胞的基因治疗涉及问题较多，技术也较复杂，因此，目前更多地是采用体细胞基因治疗。体细胞应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有分裂能力的细胞，这样才能使被转入的基因能有效地、长期地发挥“治疗”作用。因此干细胞、前体细胞都是理想的转基因治疗靶细胞。以目前的观点看，骨髓细胞是唯一满足以上标准的靶细胞，而骨髓的抽取，体外培养、再植入等所涉及的技术都已成熟；另一方面，骨髓细胞还构成了许多组织细胞(如单核巨噬细胞)的前体。因此，不仅一些涉及血液系统的疾病如ADA缺乏症、珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞贫血、CGD等以骨髓细胞作为靶细胞，而且一些非血液系统疾病如苯丙酮尿症、溶酶体储积病等也都以此作为靶细胞。除了骨髓以外，肝细胞、神经细胞、内皮细胞、肌细胞也可作为靶细胞来研究或实施转基因治疗。 基因治疗的基本步骤 1．目的基因的转移 在基因治疗中迄今所应用的目的基因转移方法可分为两大类：病毒方法和非病毒方法。基因转移的病毒方法中，RNA和DNA病毒都可用为基因转移的载体。常用的有反转录病毒载体和腺病毒载体。转移的基本过程是将目的基因重组到病毒基因组中，然后把重组病毒感染宿主细胞，以使目的基因能整合到宿主基因组内。非病毒方法有磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、显微注射法等。 2．目的基因的表达 目的基因的表达是基因治疗的关键之一。为此，可运用连锁基因扩增等方法适当提高外源基因在细胞中的拷贝数。在重组病毒上连接启动子或增强子等基因表达的控制信号，使整合在宿主基因组中的新基因高效表达，产生所需的某种蛋白质。 3．安全措施 为避免基因治疗的风险，在应用于临床之前，必须保证转移-表达系统绝对安全，使新基因在宿主细胞表达后不危害细胞和人体自身，不引起癌基因的激活和抗癌基因的失活等，尤其是在将反转录载体用于基因转移时，必须在应用到人体前预先在人骨髓细胞、小鼠体内和灵长类动物体内进行类似的研究，以确保治疗的安全性。

D. 肿瘤基因治疗的主要途径有哪些

基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定序列。将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，目前基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。基因治疗的靶细胞主要分为两大类：体细胞和生殖细胞，目前开展的基因治疗只限于体细胞。基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病、类风湿等）。 基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。基因治疗与常规治疗方法不同：一般意义上疾病的治疗针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因治疗针对的是疾病的根源--异常的基因本身。基因治疗有二种形式：一是体细胞基因治疗，正在广泛使用；二是生殖细胞基因治疗，因能引起遗传改变而受到限制。 1．基因治疗按基因操作方式分为两类，一类为基因修正（gene correction）和基因置换（gene replacement），即将缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，不涉及基因组的其他任何改变。通过同源重组（homologous recombination）即基因打靶（gene targetting）技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复。另一类为基因增强（gene augmentation）和基因失活（gene inactivation），是不去除异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因等的功能；或特异封闭某些基因的翻译或转录，以达到抑制某些异常基因表达。 按靶细胞类型又可分为生殖细胞（germ-line cell）基因治疗和体细胞（somatic cell）基因治疗。广义的生殖细胞基因治疗以精子，卵子和早期胚胎细胞作为治疗对象。由于当前基因治疗技术还不成熟，以及涉及一系列伦理学问题，生殖细胞基因治疗仍属禁区。在现有的条件下，基因治疗仅限于体细胞

E. 如何做耐药基因研究

首先要清楚自己要做什么耐药基因，是对哪种抗生素的耐药。明确后，要注意从宏观和微观入手。
在宏观上，要知道细菌对哪些抗生素耐药，即该种细菌的耐药特征，这也是所谓的药敏试验。
在清楚宏观结果的前提下，我们再去研究它具体含有哪些耐药基因。因为细菌的耐药性的出现，大部分源于基因的改变，如基因突变或者获得了外来耐药基因元件等。你可以针对具体的抗生素，查找相关文献，探知目前对该种抗生素的耐药基因的研究进展，确定引起该种抗生素耐药的有关具体基因。然后设计该基因引物,通过PCR技术扩增确定。
但是大部分细菌的耐药都不是单一原因的。具体研究就得看你的研究目的了。
大概说了这么点，希望对你有帮助！

F. 如何诱导建立耐药肿瘤细胞株

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是造成化疗失败的主要原因，体内外研究发现肿瘤耐药的分子机制很复杂，包括靶基因突变、靶基因扩增、DNA损伤修复能力差异、药物进入肿瘤细胞内浓度减少等。本文主要从肿瘤细胞内在的分子异常如原癌基因表达异常、DNA损伤修复基因表达异常及多药耐药有关基因表达异常等几个方面综述了肿瘤耐药的一些分子机制进展。 1原癌基因表达异常 许多原癌基因参与调节细胞的增殖与凋亡，这些基因的改变导致分子调节缺陷使细胞恶变，并对生理刺激作出凋亡的反应能力降低，而诱导肿瘤细胞凋亡是化疗药物作用的重要机制。因此抑制癌细胞凋亡的原癌基因表达异常参与了肿瘤细胞的抗药性，这主要包括P53 、Rb、Bcl 2三种原癌基因。 1.1P53 原癌基因野生型P53 (wtP53 )基因是一种抗癌基因，其产物是核内转录因子，作用是参与基因稳定。当细胞受损时wtP53 蛋白表达增高，诱导与DNA修复有关的基因GADD45表达，增加细胞DNA修复能力，同时通过诱导凋亡促进受损细胞死亡。近年认为P53 蛋白也能活化P21 waf 1基因表达，从而抑制细胞周期蛋白激酶复合物如Cyclin D/cdk4、Cyclin D/cdk6及Cyclin E/cdk2的活性，并增加Rb蛋白的去磷酸化，从而抑制损伤细胞由G 1进入S期，活化的P53 蛋白水平增高能降低细胞发生凋亡反应的阈值，当受损细胞不能修复DNA时则进入凋亡［1］。P53 基因突变消除了许多依赖P53的反应，增加了染色体不稳定性，从而使肿瘤细胞在有DNA损伤的情况下进入细胞周期，抗药性的肿瘤细胞被筛选出来，并且产生有利于基因扩增的条件，使嘌呤、嘧啶生物合成特异性的酶基因扩增，产生对抗代谢类药物如氨甲蝶呤的耐药性。另一方面，P53 基因突变的肿瘤细胞株对凋亡的敏感性下降从而产生耐受化疗药物的特性，研究发现P53 突变的肿瘤细胞导入外源野生型P53 基因后增强化疗药物5-Fu的细胞杀伤作用，这些结果表明wtP53 突变参与了肿瘤细胞对化疗药物的抗性［2］。 1.2Rb原癌基因 Rb基因产物是一种核内蛋白，起反式作用因子的作用。Rb蛋白能与一种细胞生长调节因子E2F形成复合物，抑制E2F诱导S期基因如DNA聚合酶、胸腺嘧啶合成酶、二氢叶酸还原酶等基因的表达，从而抑制细胞的增殖。细胞周期蛋白Cyclin D家族通过使Rb蛋白磷酸化，抑制其与E2F形成复合物，增加自由E2F因子释放，参与了Rb蛋白网络控制细胞由G1期向S期转变的过程。因此，当Rb基因突变或Cyclin D 1蛋白表达增高，则使E2F因子活性增强从而使E2F诱导的S期基因表达增高，使肿瘤细胞对化疗药物氨甲蝶呤敏感性下降［3］。 1.3Bcl2原癌基因家族Bcl2基因是在人滤泡淋巴瘤细胞14、18号染色体异位时发现的，但Bcl2蛋白本身并无促进细胞周期进行和使细胞分裂的作用。研究发现Bcl2作为一种抗凋亡基因能专一性抑制许多刺激导致的细胞凋亡，作用机理可能与抑制野生型P53蛋白活性、抑制C myc诱导的凋亡、与bax蛋白形成异聚体抑制其活性有关。在人前列腺癌、结肠癌等肿瘤中发现有Bcl2蛋白过表达，并发现过表达Bcl2的腺癌对化疗药物阿糖胞苷等有抗药性［4］，Bcl2基因家族中的Bcl XL也能与Bax蛋白形成复合物，抑制其诱导凋亡的活性。在白血病高度耐药株P388 中发现，Bcl XL水平显着增高，并与肿瘤细胞耐药性相关［5］。2DNA损伤修复能力异常许多化疗药物如氮芥、顺铂等通过损伤DNA如使DNA链间交联达到杀伤肿瘤目的，当肿瘤细胞修复DNA损伤的能力增强，则使肿瘤对化疗药物产生抗性。近来发现另一类化疗药物，能选择性抑制拓扑酶使DNA链断裂，不同的抑制物能与拓扑酶以共价复合物形式稳定在DNA不同位点，通常是DNA核基质附着区和c myc基因活化转录区，使DNA链断裂导致细胞死亡。当肿瘤细胞拓扑酶发生改变如拓扑酶Ⅱ转录水平和活性降低或者肿瘤细胞拓扑酶Ⅰ突变，使肿瘤细胞对化疗药物拓扑酶抑制物产生耐药性［6］ 。另一方面，研究发现O 甲基鸟嘌呤 DNA甲基转移酶MGMT能清除O 6 乙基鸟嘌呤并与N1O6 乙醇鸟嘌呤反应形成一种不可逆的复合物，从而抑制了N 3C N 1G链间交合物的形成，缺少MGMT的肿瘤细胞株对化疗物苄氯亚硝基脲CENUs高度敏感，而转染人MGMT进入缺乏此酶的细胞株后发现链间交联形成减少并对CENUs产生抗性。在脑肿瘤中，低水平MGMT的表达与卡氮芥碱基治疗效果转好有关［7，8］ 。体外发现DNA错配修复与识别错配位点的蛋白hMSH2(人Muts同源物2)、GTBP(G T结合蛋白二异聚体)和结合此异二聚体的hMLH1蛋白(人Mutl同源物)有关。hMSH2或hMLH 1缺失导致肿瘤的发生及对顺铂产生低水平耐受［9］ 。另外损伤识别蛋白DPR s与铂抗性有关，DPRs是一类含迁移基因HMG的蛋白，选择性地与顺铂 GG和 AG链间双聚物结合后，丧失其转录因子的正常功能，从而影响特异基因的转录使肿瘤细胞产生铂抗性。酵母菌编码HMG蛋白的IXR1基因活性缺失，可对顺铂产生两倍抗性［10］ 。紫外线损伤识别蛋白UVDRP与紫外线诱导的6，4 光合物高度特异性结合，这种DPR蛋白在顺铂耐性肿瘤细胞株中表达活性增加［11］。近年来有文献报道DNA聚合酶α、β在苯丙氨酸、氮芥和铂耐性细胞株中表达大大增高。体内用顺铂治疗后，肿瘤细胞的DNA聚合酶α、β和DNA连接酶活性大大增加［12］，使肿瘤细胞在有DNA链损伤的情况下仍能进行复制，在细胞G2期清除链间交联、DNA链间双聚体，并抑制P53诱导的凋亡，从而产生铂耐性。在对铂化疗无反应的恶性卵巢癌患者的肿瘤组织中发现与核酸有关的切除修复基因P33 和P31 基因表达远高于铂化疗有效的患者。在白血病患者的研究中发现P33 过表达与其对氮芥的耐药性有关［13］ 。因此DNA修复有关的酶活性增高是肿瘤对化疗药物产生抗性一个重要原因，筛选与DNA修复有关的选择性抑制剂能增加化疗效果。 3多药耐药有关基因表达异常 肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉抗药性的造成肿瘤化疗失败的一个重要原因。研究发现这种耐药方式即在人肿瘤中和培养的肿瘤细胞株中出现多药耐药的产生机制与多种因素如多药耐药基因、谷胱甘肽转移酶、蛋白激酶C等有关。多药耐药基因MDR定位于第7号染色体，这个基因蛋白编码区由27个外显子组成，其编码的170KD的P糖蛋白，属于腺苷三磷酸结合蛋白超家族成员。P 糖蛋白在耐药细胞膜上过度表达，可将细胞内的化疗药物泵出胞外，细胞内化疗药物达不到有效杀伤剂量而致耐药性产生。非经典型多药耐药如人HL60抗阿霉素等抗性细胞株，其内质网膜上表达一种110KD蛋白，因从肺癌细胞中分离到该蛋白基因故命名为肺抗性蛋白LRP 56，cDNA序列同源性分析中发现这种蛋白属于胞质穹窿蛋白，这种胞内穹窿蛋白是一种与核胞浆运输有关的细胞器。因此，LRP 56的作用途径可能是：一方面通过降低药物的核质分布比率以降低药物的有效浓度，另一方面通过囊泡转运和胞吐机制将胞质内药物排出细胞外，降低药物的绝对浓度。许多人肿瘤细胞株和实体瘤中均有LRP 56蛋白表达，在人结肠直肠癌中LRP 56有高表达［14］ ，血液系统肿瘤及实体瘤的LRP 56表达水平也与化疗敏感性有关。此外，在P糖蛋白表达阴性的胀瘤细胞株中发现多药耐药相关蛋白MRP，MRP编码mRNA7.8～8.2 kb,定位于染色体16 p13.1,MRP产物为190KD的膜结合糖蛋白，克隆及转化实验发现MRP基因能使肿瘤细胞对多种药物产生抗性［15］。体内外的实验证实，谷胱甘肽转移酶GST能催化谷胱甘肽与药物形成复合物而解毒，肿瘤细胞的GST活性增高从而产生耐药性。研究发现GST家族中GST π水平在人肿瘤组织如胃癌、结肠癌、肺癌表达增高，许多肿瘤细胞株对化疗药物苯丙氨酸芥、环磷酰胺的抗药性与GST π表达水平的增高。利用反义技术阻断肿瘤细胞GST π表达，可明显增强其对各种化疗药物的敏感性［16］ 。另一种药物代谢机制与亲核物质如氮硫等和葡萄糖醛酸结合有关，这是由葡萄糖醛酸转移酶UDPGTS这一类大家族催化。在鼠白血病细胞株P338 就发现UDPGTS水平增高并灭活有代谢毒性的daunorubicinol，并对其产生抗药性［17］。蛋白激酶C是一种Ca2+ /磷脂依赖的同功酶，由单一多肽链组成，包含钙依赖性的巯基蛋白酶分解的两个不同部位和含有ATP及底物蛋白结合区域的亲水性催化部位/活性中心。在体外建立的耐药细胞株与相应的敏感株相比，蛋白激酶C活性明显增高。研究表明蛋白激酶Cα对肿瘤多药耐的形成起重要作用，但各种肿瘤组织的蛋白激酶C存在异质性。蛋白激酶C可能通过磷酸化耐药基因编码的膜蛋白调节其转运功能或通过核内的基因转录参与肿瘤的多药耐药形成。因此，有必要对蛋白激酶C在多药耐药发生、发展中的作用做进一步研究［18］。综上所述，肿瘤细胞对化疗药物产生抗性的机制是复杂的。针对肿瘤细胞原癌基因表达异常，人们利用基因治疗的方法将正常的基因导入细胞增加其对化疗敏感性，而许多化合物如钙离子通道阻滞剂具有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用。因此临床化疗应联合不同作用机理的药物、不同的治疗方法才能达到良好的临床疗效。

G. 疾病基因治疗有哪四大策略’肿瘤的基因治疗主要有哪两种策赂

基因治疗是在基因水平上治疗疾病的方法。包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活、引入新基因等。 主要的2种策略：（1）基因修正：基因修正(gene correction)(gene correction)：是定点导入外源正定点导入外源正常基因，代替有缺陷的基因，对靶常基因，代替有缺陷的基因，对靶细胞基因组无任何改变。属于直接细胞基因组无任何改变。属于直接治疗。（2）基因添加：基因添加(gene augmentation)(gene augmentation)：是非定点导入外非定点导入外源正常基因，而没有去除或修复有源正常基因，而没有去除或修复有缺陷的基因。属于间接治疗。

H. 与肿瘤的发生于转移有关的基因

楼上都没回答问题啊。
相关的基因其实非常多，下面的文章可以回答你的问题。
但是你要告诉你的老师，肿瘤转移相关的基因并没有研究得很彻底，实际上对转移机制的认识也不明确。很多基因其实就是行使正常的功能，不过被肿瘤细胞利用罢了。
肿瘤转移相关基因及因子的研究进展

发表时间：2011-1-7 9:50:17 来源：创新医学网医学编辑部推荐

作者：符伟玉梁念慈 作者单位：广东医学院生化教研室，广东湛江 524023

【关键词】 转移相关基因;肿瘤;综述文献

肿瘤转移是恶性肿瘤治疗失败和患者死亡的主要原因。目前已知肿瘤的侵袭、转移包括从原发部位浸润性生长、穿透细胞外基质、进入血管、淋巴管或体腔中游走、与靶器官黏附后向间质侵袭以及增殖形成转移灶等几个阶段，这是一个多步骤、多阶段、多基因的复杂过程。近年来，肿瘤分子生物学的研究重点逐渐转入分离和克隆肿瘤转移基因(MG)与肿瘤转移抑制基因(MSG)，并对这些基因的调控因子和转移过程中的作用机制进行深入研究，期望在基因水平揭示肿瘤转移的本质，为改进肿瘤的诊断方法和治疗手段提供依据。在细胞基因组中，具有促进肿瘤细胞浸润或转移潜能的基因称为肿瘤转移基因，这类基因亦称为肿瘤转移促进基因(metastasisenhancing gene)。MSG能抑制肿瘤细胞的转移，但不影响原发肿瘤的生长。研究表明，肿瘤细胞的浸润和转移过程中，不仅有多种基因的参与，而且还有一些相关因子、酶类和蛋白质等的共同作用及其调节。本文就肿瘤转移相关基因及其作用机制的近期研究进展作一综述。

1 癌基因和抑癌基因与肿瘤转移的关系

癌基因的活化及过度表达和抑癌基因的失活，在肿瘤发生过程中发挥重要作用，已得到人们的共识。近年来，越来越多的证据支持在肿瘤转移过程中，同样也需要多种癌基因和抑癌基因的参与。在肿瘤转移过程中目前较为确认的癌基因和抑癌基因有cmet、Ras、Rho、myc、sis和突变型p53等。cmet癌基因编码肝细胞生长因子/弥散因子的受体，该因子是上皮细胞有效的分裂原，同时也促进细胞流动和侵袭。cmet癌基因的过度表达有利于肿瘤细胞在每一期演进过程中形成选择性的生长优势，而且扩增也为肿瘤细胞获得转移能力提供进一步的选择优势。cmet基因早已被证实与包括骨肉瘤在内的多种肿瘤的进展有关[1]。Ras基因家族是较早发现的与肿瘤转移有关的癌基因。Webb等[2]对Ras基因诱导转移的机制进行了研究，他们利用V12Hras效应域突变剂破坏其激活下游靶区域的活性，无法诱导小鼠成纤维细胞NIH3T3的肺转移。但有活化V12Hras基因表达的成纤维细胞，则可通过RafMAPK1/2旁路引起肺转移。说明Ras是通过作用于信号传导途径发挥诱导转移功能的。

Rho家族属于小分子G结合蛋白的Ras超家族，和Ras超家族的所有成员一样，Rho家族蛋白在非活性鸟苷酸(GDP)结合形式和活性鸟苷酸(GTP)结合形式之间循环。Rho家族蛋白与GDP结合形式游离于胞质中;与GTP结合形式则作用于细胞内的效应因子。截止目前，Rho家族已被证实的成员有：Rho(RhoA、RhoB、RhoC)，Rac(Rac1、Rac2、Rac3、RhoG)，Cdc42(Cdc42H、g25K、TC10)，Rnd (RhoE/Rnd3、Rnd1/Rho6、Rnd2/Rho7)，RhoD和TTF等[3]。Rho家族是细胞骨架肌动蛋白的重要调节子，通过调控肌动蛋白细胞骨架影响细胞迁移，从而影响恶性肿瘤的侵袭和转移。而且，近年来的研究结果证实了由Rho因子介导的细胞表面分子信号转导途径的失调对于肿瘤转移的重要性：Clark等[4]使用基因芯片技术证实对于黑色素瘤，RhoC的过表达可以促进肿瘤的转移能力，通过RhoC显性失活突变体抑制RhoC表达则明显逆转其体内侵袭转移。Glidea等[5]则在胆囊癌中发现，RhoGDI2基因产物的缺失与胆囊癌的转移高度相关。

越来越多的研究显示，抑癌基因的失活是肿瘤发生侵袭生长的主要原因，抑癌基因nm23和p53等在肿瘤侵袭转移中起重要作用。nm23基因定位于人17号染色体17q21.322，分为nm23H1和nm23H2两个亚型。nm23基因的低表达已经在多种高转移性肿瘤中被证实。研究显示，nm23与核苷酸二磷酸激酶(NDPK)高度同源、作用相似或一致，其表达异常可影响微管聚合，导致染色体畸变和非整倍体形成从而驱动肿瘤转移，也可通过影响细胞骨架构成或G蛋白介导的细胞信号转导通路参与肿瘤的发生[6]。Sun[7]等用放射线诱发p53突变，发现突变型p53可在转录水平激活编码内皮生长因子受体、基质金属蛋白酶(MMPs)和血栓素基因，但抑制多药耐药基因1及碱性成纤维细胞生长因子基因表达。说明p53可调节多种转移相关基因的表达。CD44是一种跨膜糖蛋白，人类CD44基因定位于11号染色体短臂，全长约50kb，同一基因的不同剪切片段编码不同的CD44异构体。研究表明肿瘤转移与CD44异常转录有关，Pengguet等[8]发现CD44分子过表达可引起膜-细胞骨架连接蛋白-ezrin的功能激活，从而可导致骨肉瘤细胞系转移能力的增强。

2 ezrin蛋白

ezrin是1981年由Bretscher在鸡的小肠上皮细胞刷状缘中首次被纯化的，为ERM家族中第一个被发现的成员，而ERM家族另外3个成员为：radixin、moesin和merlin。ezrin和其他ERM家族成员在细胞中有两种存在状态：一种是休眠状态，一种是激活状态。由于关键的C末端苏氨酸残基经Rho或PKC等途径磷酸化激活，再经膜上PIP2的招募作用，导致其在特定细胞区域的聚集。由于暴露的C末端尾部具有肌动蛋白细胞骨架结合位点，故通过ezrin的桥接作用，可将肌动蛋白细胞微丝与细胞膜相连，从而产生一系列细胞功能，如细胞形态的改变、细胞运动、黏附、有丝分裂、细胞极性等[9]。OrianRousseau等[10]的实验显示，CD44、ezrin、met等有可能通过ezrin与CD44结合的功能域相互作用，并通过MEK/ERK信号传导途径，诱导瘤细胞侵袭表型的发生。

2004年，Yu等[11]将Vil2基因(ezrin编码基因)转入低转移能力的细胞系，发现原不会转移的肿瘤细胞转移能力大大提高，说明ezrin的过表达可赋予肿瘤细胞高转移活性;在抑制了ezrin的表达后，原本具有高转移能力的细胞系转移能力大大下降。ezrin与肿瘤转移的密切相关性已为越来越多的研究者所认同，ezrin在促进肿瘤转移方面，存在着复杂的多种作用机制，探究ezrin过表达促进肿瘤转移机制方面的实验研究正在展开，是肿瘤转移机制研究新热点。

3 整合素

整合素(Integrins)是广泛存在于动植物细胞表面的一类细胞粘附分子，是由α和β两个亚单位形成的跨膜异二聚体。迄今已发现约18种α亚单位和8种β亚单位，它们按不同的组合构成20余种整合素。整合素是近年来肿瘤转移研究领域的一个热点，它作为细胞与周围基质相互作用的桥梁，参与肿瘤血管的生成，一直被认为和肿瘤转移高度相关[12]。降解细胞外基质ECM是肿瘤细胞侵袭、转移的重要步骤，MMPs是降解ECM的主要酶类。整合素能调节肿瘤细胞MMPs的表达和活性，BaronasLouell等[13]采用RTPCR及ELISA等方法检测了α2β1对黑色素瘤细胞基质金属蛋白酶(MMPs)的影响，结果发现α2β1可以不同情况的调节MMP1、MMP2、MMP3、MMP13和MMP14的表达和活性，而影响肿瘤细胞的转移。许多研究者先后采用αvβ3的拮抗剂SC268448、SM256和SD983等证实了整合素αvβ3在肿瘤血管生成的重要作用[14]。然而，同种整合素在不同类型细胞上的表达程度与迁移的关系不同，整合素对于肿瘤侵袭转移究竟是促进亦或是抑制，至今仍存有争议。

4 缺氧诱导因子1(HIF1)

缺氧诱导因子1(HIF1)是由Semenza等于1992年在缺氧诱导的肝细胞癌细胞株Hep3B细胞核提取物中发现的一种转录因子，并证实其在低氧条件下广泛存在于哺乳动物及人体内。HIF1是由120kd的α亚基和91～94kd的β亚基构成异二聚体，两亚单位均含有bHLHPAS结构域，其中bHLH结构属于真核生物转录因子超家族，而PAS为bHLH家族的子类所共有，bHLH区负责和DNA结合，PAS区则与另一亚基形成二聚体。HIF1α是HIF1活性调节的主要亚基，决定HIF1的活性且只受低氧因素调节。在常氧条件下，HIF1α由其结构中的氧依赖降解结构域(ODD)控制，并通过泛素蛋白酶体途径迅速降解，几乎检测不到HIF1α蛋白。但在缺氧和肿瘤细胞，HIF1α降解受阻，HIF1α在胞内积聚，并与缺氧反应基因的缺氧反应元件(HRE)上的HIF1结合位点(5'TACGTG3')结合，促进缺氧反应基因的转录，引起细胞对缺氧的一系列适应性反应。缺氧反应基因涉及肿瘤血管生成、细胞能量代谢、肿瘤转移、离子代谢和儿茶酚胺代谢等多个方面[15]。

研究表明，在缺氧组织中HIF1能够诱导在血管形成过程中起作用的VEGF等基因的表达，促进新生血管的形成，为瘤细胞侵袭和转移创造条件。VEGF基因具有缺氧调节位点(HRE)能被HIF1识别并结合。此外，缺氧还能够诱导一种RNA结合蛋白HUR的表达，而HUR能够结合VEGFmRNA3'末端非翻译区域(UTR)从而提高VEGF mRNA的稳定性。同时Ras基因的产物能够通过Raf/MEK/有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和PI3K/PDK1/AKT 途径活化HIF1α并提高其稳定性[16]。研究表明，在依赖生长因子的Ba/F3细胞株中，癌基因BCR/ABL能够促进HIF1的表达来诱导VEGF的表达。反之，Von HippelLindau(VHL)蛋白能够与泛素连接酶E3形成复合体促进HIF1的降解[17]。此外，抑癌基因p53也能通过结合HIF1α/P300和促进MDM2介导的HIF1α的泛素化和失活，最终导致VEGF表达量下降[18]。以上表明HIF1是研究VEGF表达调控的重点。Sun等[19]向肿瘤细胞内转染反义HIF1α质粒，发现可以下调VEGF的表达，减少肿瘤内MVD。此外，以HIF1α为治疗靶点的动物实验也证实，肿瘤中VEGF表达下调可以抑制肿瘤细胞的浸润和转移。因此，抑制HIF1α表达及转录活性有望成为一种治疗恶性肿瘤新的途径。

5 结语

以上简要介绍了几个近年来研究的热点基因，还有许多已知基因蛋白产物的新功能被不断发现。肿瘤转移是一个非常复杂的过程，对肿瘤转移的基因调控及其机制进行深入研究，可为利用新的基因治疗手段治疗恶性肿瘤开辟新的思路。目前对肿瘤转移的基因调控研究已做了许多工作，但仍有大量问题尚待解决。随着功能基因组和蛋白组计划的开展，人们对于肿瘤转移基因和转移抑制基因的表达调控、蛋白相互作用的认识必将跨入一个崭新的阶段

I. 如何解释耐药肿瘤细胞中 促进耐药基因反而表达低

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是造成化疗失败的主要原因，体内外研究发现肿瘤耐药的分子机制很复杂，包括靶基因突变、靶基因扩增、DNA损伤修复能力差异、药物进入肿瘤细胞内浓度减少等。本文主要从肿瘤细胞内在的分子异常如原癌基因表达异常