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免疫檢測方法有哪些

發布時間:2022-09-03 17:50:55

⑴ 細胞免疫功能檢測常用有哪幾種方法

細胞免疫(CMⅠ)是由多種細胞相互作用的結果。免疫細胞間相互作用導致多種細胞因子的釋放。因此細胞功能測定不僅涉及T細胞的數量和功能與包括各類因子活性測定,因此評價機體的細胞免疫功能不僅程序復雜,且很難標准化。
一、遲發型過敏反應的體外檢測方法
皮膚試驗和接觸性過敏的誘發是檢測遲發型過敏反應(DTH)的兩種常用方法。皮膚試驗中誘發對曾經使病人致敏的抗原的再次應答,而接觸性過敏是測試受者對從未接觸過的物質發生致敏的能力。
1.皮膚試驗 用皮膚試驗診斷DTH,常用的抗原有結核菌純蛋白衍生物(PPD)、腮腺炎病毒、念珠菌素等,在人類試驗時在前臂皮內注射少量可溶性抗原,24~48小後,測量紅腫硬結的大小,硬結直徑大於10mm即被看作為陽性。表明受試者對該病原菌有了一定的細胞免疫能力,若皮試無反應,可用更高濃度的抗原重復試驗,若仍無反應即為陰性,需排除皮試技術誤差,也可能受試者從未接觸過此抗原,也可能由於細胞免疫功能缺損,或由於細胞免疫功能缺損,或由於嚴重感染(麻疹、慢性播散性結核)造成的無反應性。
2.接觸性過敏常應用低分子量化合物如二硝基氯苯(DNCB)誘生接觸性過敏。化合物與皮膚蛋白質結合而導至DTH反應。在動物試驗時,初次皮膚上塗抹DNCB後間隔7~10天再激發刺激,則皮膚出現即為陽性。此試驗人類已不使用。
二、細胞免疫的體外檢測方法
體外檢測淋巴細胞的數量和功能,最易採集的是血標本,首先需分離或純化淋巴細胞,一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重為1.077的淋巴細胞分層液,當將血液重疊於淋巴細胞分層液之上離心時,由於紅細胞(1.092)、多形核白細胞(1.090)、淋巴細胞(1.070)的比重不同而相互分開。淋巴細胞和單核細胞在血漿和分層液交界處形成一薄層。仔細分出這一薄層的細胞,其中淋巴細胞佔80%,單核細胞佔20%,淋巴細胞中T細胞佔80%,B細胞佔4%~10%,其作為非DT、非B細胞。
1.T細胞計數
(1)E花環法:人類T細胞表面有SRBC受體(CD2)能與SRBC結合形成玫瑰花環樣結構,將經分層液分離現的RBM懸液與SRBC在含有血清的平衡鹽水中混合,經37℃培養5~10分鍾放4℃過夜,取細胞懸計數,外周血淋巴細胞中約70%~80%淋巴細胞結成花環即為T細胞。目前此方法已用來分離T細胞,而不用做T細胞計數。
(2)用單克隆抗體計數T細胞:將人的PBM分成三等份,分別用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的單克隆抗體作第一抗體與細胞結合,再用FITC標記的兔抗小鼠IgG抗體作第二抗體進行間接免疫熒光染色,在熒光顯微鏡下或流式細胞儀檢測結果,在PBM中被CD3抗體染上熒光的細胞稱為CD3 細胞即總T細胞。正常人在PBM中T細胞佔70%~80%。正常人的CD4 細胞和CD8 細胞之和應與CD3 細胞數一致。CD4 細胞與CD8 細胞的比值正常人約為2/1而艾滋病患者則比值小於1.7。
2.T細胞活化試驗 T細胞能被非特異的物質稱為有絲分裂原所激活而向淋巴母細胞轉化。T細胞轉化過程可伴隨有DNA、RNA、蛋白質的合成增加,最圖導致細胞分裂。在光學顯微鏡下可計數轉化後的淋巴細胞數,也可用氚標記的胸腺嘧啶核苷(3HTdR)摻入正在分裂的淋巴細胞,用液閃測定儀檢查摻入正在分裂的淋巴細胞,用液測量儀檢查摻入的3H-TdR的多少確定淋巴細胞轉化率。最近有一種不用同位素,又可用儀器測量的淋巴細胞增殖反應的檢查法,稱為MTT檢測法,MTT是一種甲氮唑鹽,它是細胞線粒體脫氫酶的底物,細胞內的酶可將MTT分解產生藍黑色甲(fromazan)產物。該產物的多少與活性細胞數正相關。結果可用酶標檢測儀(595mm)測量匯豐銀行密度,做為MTT法的檢查指標。此法的結果與3H-TdR摻入法平行,並能反應試驗中的活細胞數。
3.細胞毒試驗 TC細胞、NK細胞、LAK細胞、TIL細胞對其靶細胞有直接的細胞毒(殺傷)作用。常用的栓測細胞毒效應的方法是51Cr-Na2Cro4鹽水溶液與靶細胞胞混合,於37℃培養1小時左右,51Cr即可進入靶細胞,與胞漿蛋白結合,洗去游離的51Cr後,即可得到51Cr標記的靶細胞,將待檢細胞毒性的細胞與51Cr標記的靶細胞混合(比例約為50:1或100:1)靶細胞被殺傷越多,釋放到上清液中的液游離的51Cr越多,且不能被其他細胞吸收。用γ射線測量儀檢測上清液中的cpm值,即可計算出待檢細胞殺傷活性的高低。
細胞毒試驗檢測Tc細胞效應功能是否健全,及經IgG介導的ADCC效應,或NK細胞在抗腫瘤免疫中的作用是有意義的。
4.混合淋巴細胞的反應(MIR) 是體外研究T細胞的較好的方法,雙向MLR常被用來篩選骨髓移植的供體。來自不同供體的淋巴細胞分別與病人的淋巴細胞混合培養4~5天,在最後8小時摻入51TdR摻入法測T細胞的反應性。或用細胞毒法觀察受刺激的T細胞與活的靶細胞混合(靶細胞來自與刺激細胞相同的個體)如果T細胞受刺激後產生了細胞毒T細胞,可殺死活的細胞,根據靶細胞釋放51Cr的多少算出T細胞移動抑制因子)和LIF(白細胞移動抑制因子)來評估細胞免疫功能。近年來應用測定IL-2的免疫酶技術,操作簡單,並能定量以取代了MIF和LIF的測定。單個核細胞與分裂原一起培養24小時,然後測定清液中的IL-2活性。在細胞免疫功能缺損時,特別是AIDS病人,IL-2分泌明顯降低。而有些疾病,如多發性硬化、類風濕關節炎、移植排斥反應等病人體內血清中IL-2水平升高,表明病人T細胞活性增高。發生移植排斥反應的病人尿中IL-2也可升高。
也可用酶聯免疫吸附試驗測定各種體液中活化的T細胞脫落的IL-2受體(CD25),一般來說IL-2的水平和IL-2受體水平是平行的,IL-2和IL-2受體的檢測可用於對某些疾病的監測,如移桿排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治療的病人。
對體外培養的細胞進行細胞因子產生能力檢測是檢查細胞培養上清液中細胞因子的生物活性或抗原性。現已可用核酸雜交技術,即從組織中或細胞中提取RNA,與同位素或酶標記的該種細胞因子的cDNA探針作分子雜交試驗,即印跡(dot blotting)或Northern印跡,若查出有某種因子的mRNA存在,即說明該細胞在所處培養條件下有產生某種細胞因子的能力。

⑵ 免疫功能檢查包括哪些

免疫功能檢查包括哪些
1、免疫五項:包括 IgG、IgA、IgM、IgE、IgD的正常值及增高和降低的意義。
2、微量元素檢查:人體健康與體內微量元素的含量密切相關,兒童時期微量元素的缺乏可以導致生長發育遲緩,免疫功能下降等。包括銅、鐵、鋅、鈣、鎂等。
3、血常規化驗是了解寶寶免疫力的化驗項目之一。血紅蛋白的減少可能代表貧血,缺鐵性貧血可引起細胞免疫功能缺陷。
4、補體的檢測包括總補體 (CH50)、補體C3(正常值為0.85-2.00g/L)、C4(0.12-0.40g/L)、B因子、補體組分裂解產物(C3c、C3d、C3a 、 C4a 、 C5a 、Ba 和 C5b-C9 復合物等補體裂解片段)、C1 抑制物(診斷遺傳性血管神經性水腫)等。
免疫系統的疾病症狀
1、免疫系統疾病的症狀主要表現在易患感冒及其他感染性疾病,易疲勞或易過敏。根據病因及特性不同,大致常見的有:艾滋病、過敏性疾病、風濕性關節炎、過敏性哮喘、慢性疲勞、II型糖尿病、枯草熱、紅瘢狼瘡及多發性硬化症。其中最嚴重的是艾滋病、紅瘢狼瘡,比較輕的是過敏性疾病。
2、1過敏反應也是免疫系統疾病 特點是發作迅速、反應強烈、消退較快。一般不會破壞組織細胞,也不會引起組織損傷,有明顯的遺傳傾向和個體差異。 如果發生在皮膚,則出現紅腫、蕁麻疹等;如果發生在呼吸道,則出現嘔吐、腹痛、腹瀉等。個別病情嚴重的,可因支氣管痙攣、窒息或過敏性休克而死亡。
健康正常的人體,是身體組織內無數系統的正常運轉所維持的結果,所以,免疫系統作為人體對生活環境中的病菌、病毒抵抗組織,不論發生了什麼樣的變化,都會導致人體疾病的產生,所以,人們平時在保持健康以外,還需要積極鍛煉身體,保持一個開朗的心情,促進身體各個系統的運轉。

⑶ 自身免疫病全項檢查都有哪些

免疫系統檢查主要包括:血常規、免疫球蛋白測定、補體測定、腫瘤標志物、激素系列、抗核抗體、自身抗體系列如抗Sm抗體等、甲狀腺功能測定、生化全項以及抗磷脂抗體等,必要時需要做骨髓穿刺活檢等。

具體的檢查還需要結合患者具體的臨床症狀來選擇相應的檢查。建議患者去正規公立風濕免疫科或者是相關科室就診,聽從醫生的建議,接受規范化的檢查及治療,以免延誤病情。

免疫性疾病防治原則:

1、免疫缺陷可應用替代療法,如丙種球蛋白缺乏所致的免疫缺陷可應用丙種球蛋白治療 ; 還可應用免疫加強劑來提高機體的免疫反應性。

2、脫離或避免導致異常免疫反應的物質,如控制環境、停用某些葯物等。

3、Ⅰ型變態反應可進行特異性脫敏療法來提高機體對致敏物質的耐受性。

4、Ⅰ型變態反應還可應用葯物來抑制介質的產生,以阻斷免疫反應。

5、應用葯物來拮抗介質的作用和它們導致的組織反應。

6、用免疫抑制劑來抑制過度活躍的免疫反應。

7、除去激發免疫反應的感染灶和產生自身免疫的病灶。

8、清除可使臨床症狀加重的各種刺激。

以上內容參考網路—免疫性疾病、網路—自身免疫性疾病

⑷ 免疫學的檢測方法

免疫學檢測方法可分為體液免疫和細胞免疫。

⑸ 常用的免疫學技術有哪些

以下是幾種常用的免疫學技術:

1.免疫熒光技術免疫熒光技術是利用熒光素標記的抗體(或抗原)檢測組織、細胞或血清中的相應抗原(或抗體)的方法.由於熒光抗體具有安全、靈敏的特點,因此已廣泛應用在免疫熒光檢測和流式細胞計數領域.根據熒光素標記的方式不同,可分為直標熒光抗體和間標熒光抗體.間標熒光抗體中一抗並不直接連接熒光素,而是先將一抗結合到蛋白,然後帶有熒光素的二抗再結合至一抗.通過二抗的結合,能將信號進行放大,因此能在一定程度上提高檢測的靈敏度,但是隨之帶來的高背景也降低了檢測的特異性.近年來,隨著熒光素和熒光檢測技術的不斷進步,熒光檢測的靈敏度已經接近同位素檢測的水平,直接標記的熒光抗體逐漸取代間接標記抗體.這些標記了熒光素的抗體直接結合至抗原,大大提高了檢測的特異性,使檢測的結果更加准確可靠.熒光檢測技術的發展,使得免疫熒光技術在傳染病診斷上有廣泛的用途,如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病,檢查IgM抗體,做為近期接觸抗原的標志.利用單克隆熒光直接標記抗體鑒定淋巴細胞的亞類.通過流式細胞儀,針對細胞表面不同抗原,可以同時使用多種不同的熒光抗體,對同一細胞進行多標記染色.


2.放射免疫檢測放射免疫檢測技術是目前靈敏度最高的檢測技術,利用放射性同素標記抗原(或抗體),與相應抗體(或抗原)結合後,通過測定抗原抗體結合物的放射性檢測結果.放射性同位素具有pg級的靈敏度,且利用反復曝光的方法可對痕量物質進行定量檢測.但放射性同位素對人體的損傷也限制了該方法的使用.


3.酶聯免疫吸附試驗(ELISA)酶聯免疫檢測是目前應用最廣泛的免疫檢測方法.該方法是將二抗標記上酶,抗原抗體反應的特異性與酶催化底物的作用結合起來,根據酶作用底物後的顯色顏色變化來判斷試驗結果,其敏感度可達ng水平.常見用於標記的酶有辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶(AP)等.由於酶聯免疫法無需特殊的儀器,檢測簡單,因此被廣泛應用於疾病檢測.常用的方法有間接法、夾心法以及BAS-ELISA.間接法是先將待測的蛋白抱被在孔板內,然後依次加入一抗、標記了酶的二抗和底物顯色,通過儀器(例如酶標儀)定量檢測抗原.這種方法操作簡單但由於高背景而特異性較差.目前已逐漸被夾心法取代.夾心法利用二種一抗對目標抗原進行捕獲和固定,在確保靈敏度的同時大大提高了反應的特異性.近年來,抗原的定量檢測技術也不斷推陳出新.近年來,在夾心法ELISA的基礎上,開發了多抗原檢測試劑盒,能同時檢測微量液相樣本中多個抗原含量.這項技術的應用大大縮短了診斷的時間,提高診斷的可靠性和及時性.


4.免疫金膠體技術膠體金技術經過30多年的發展到現在已日趨成熟,該方法是將二抗標記上膠體金顆粒,利用抗原抗體間的特異性反應,最終將膠體金標記的二抗吸附於滲濾膜上,此方法簡單,快速,廣泛應用於臨床篩查.

⑹ 風濕病的免疫檢驗

風濕病的免疫檢驗

自身免疫病(AID)是指由於過度而持久的自身免疫反應導致組織器官損傷並引起相應器官病變或臨床症狀的一類疾病。風濕病是一類涉及到關節、軟骨、肌肉等結締組織的慢性疾病。下面是我為大家帶來的風濕病的免疫檢驗的知識,歡迎閱讀。

一、抗核抗體測定

(Antinuclear antibody ,ANA) ANA是抗細胞核多種成分的自身抗體,無種屬及器官特異性。ANA可分為抗DNA抗體、抗組蛋白抗體、抗非組蛋白抗體、抗核仁抗體及其他細胞成分抗體。這些抗體共同組成ANA譜。

抗核抗體(ANA)的檢查最常用於篩查全身性風濕病和自身免疫病。ANA的檢查可觀察到能與細胞核內的核酸和蛋白抗原起反應的自身抗體。細胞內可能存在對多種抗原起反應的抗體。只有某種抗體的效價很高時,IFA才能加以鑒別。

1、homogenous(均質型)

又稱彌散型,相應的抗原是雙鏈DNA和組蛋白復合物。常見於SLE,特別是腎臟受累病人。也可見於其它結締組織病,如:風濕性關節炎,MCTD,乾燥綜合征,硬皮病,慢性活動性肝炎及原發性膽汁性肝硬變。

2、Peripheral(周邊型)

相應的抗原為雙鏈DNA,多見於活動性SLE病人。

3、Speckle(斑點型)

主要是針對ENA的抗體,包括Sm,RNP,SSA,SSB,Scl-70。一般認為低效價的斑點型ANA不是結締組織病特有的,實際上不代表臨床異常。高效價的抗Sm抗體多與SLE有關。高效價的抗RNP自身抗體見於MCTD,但也見於SLE。抗SSA和抗SSB抗體,見於S.S,也可見於SLE。當病人有抗SSA抗體時,通常以皮膚表現和光過敏為主。,也存在於ANA陰性狼瘡和新生兒狼瘡。Scl-70抗體與硬皮病有關。

4、Nucleoli(核仁型)

其靶抗原是與RNA分子相關的核蛋白。多見於硬皮病。

5、Centromere(著絲點型)

抗著絲點抗體(ACA),多見於全身性硬皮病的CREST綜合征。

常用檢測方法為IFA、ELISA、免疫印跡法、RIA、免疫斑點法、膠體金標斑點免疫滲濾法等。其中IFA是應用較廣的一種方法。一般採用鼠肝切片或Hep-2細胞為底物抗原片,當加入病人血清時,病人血清中的ANA可與細胞中相應抗原成分結合。再加入熒游標記抗人IgG,在熒光顯微鏡下可見細胞核內亮綠色熒光。

〖參考值〗 <1:10或陰性

〖臨床意義〗

ANA陽性見於多種疾病,常用於風濕病及自身免疫病的診斷。SLE患者陽性率在95%以上,且效價常在1:80以上。在其他風濕病如RA、系統性硬化症、皮肌炎、乾燥綜合征 (SS)、混合結締組織病(MCTD)等也可陽性。其他如肝病,病毒感染等也可呈低效價陽性。

〖注意事項〗

在大約1%的正常人的體內可測到低效價的非特異性抗核抗體,80歲以上老人的檢出率可高達50%。高效價的ANA一般與活動期SLE密切相關。採用Hep-2細胞檢測ANA,可見到不同的染色模型。

此外,口服避孕葯的婦女也可檢測到ANA。

二、可提取性核抗原(Extractable nuclear antigen ENA)抗體

ENA是細胞內許多小分子的RNA和多肽組成的非組蛋白的酸性核蛋白顆粒。分布在細胞質中的稱為小細胞漿核糖核蛋白(scRNPs);分布在細胞核內的稱為小細胞核核糖核蛋白(snRNPs)。目前已發現的有20餘種,其中常用的抗ENA抗體有如下幾種。

(一)抗Sm抗體

Sm是病人Smith的縮寫。Sm抗原屬於SnRNP,由5個RNA和多肽組成,抗原表位在29KD、28KD和13.5KD多肽上,抗Sm抗體是酸性糖蛋白,是SLE的標記抗體。

(二) 抗nRNP(u1RNP)抗體

u1RNP是u1RNA和蛋白質組成的,抗原表位在73KD、32KD和17.5KD多肽上,是混合結締組織病(MCTD)的重要血清標志。

(三)抗SSA抗體

SS為乾燥綜合征的縮寫。此抗體又稱抗RO抗體。SSA抗原是RNA和蛋白質復合物,抗原表位在52KD多肽上,主要見於原發性乾燥綜合征患者及SLE。

(四)抗SSB抗體

SSB抗體常伴隨SSA抗體同時出現,又稱抗La抗體,SSB抗原屬於SnRNP,是含有RNA和50KD蛋白質的復合物。抗原表位在45KD、47KD和48KD多肽上。與SSA抗體並存對診斷SS有特異性。

(五)抗Scl-70抗體

Scl-70抗原表位在86KD、70KD的片段上,是DNA拓撲異構酶I的降解產物,抗Scl-70抗體幾乎僅見於硬皮病,陽性率30%左右。

(六)抗Jo-1抗體

Jo-1抗體是組氨醯tRNA合成酶,抗原表位在55KD多肽,抗Jo-1抗體是多發性肌炎和皮肌炎的標記抗體,陽性率25-40%。

(七)抗核糖體抗體

核糖體在核仁合成,然後轉入胞漿,抗原表位在大亞基上的38KD、16KD和15KD多肽上。抗核糖體抗體陽性主要見於SLE,陽性率20-30%。

檢測以上抗體的方法主要有:對流免疫電泳法(CIE)、雙相免疫擴散法,免疫印跡試驗(IBT),免疫斑點技術和ELISA法等。一般採用兔胸腺或牛胸腺提取物或細胞提取物作為抗原。近年來,應用分子重組抗原制備的試劑盒已投入市場。

〖參考值〗陰性

〖臨床意義〗

1. 抗n RNP抗體:見於35-40%的SLE病人,在MCTD病人中陽性率可達95-100%,也可見於其他風濕性疾病。

2. 抗Sm抗體:主要見於SLE及重疊綜合征,急性期病人75%為陽性。一般SLE患者30-40%陽性率。但Sm抗體陽性者90%以上為SLE,故稱之為SLE的標記抗體。

3. 抗SSA和抗SSB抗體:見於40-45%的SS病人。抗SSA抗體也可見於25%的SLE病人及其他風濕性疾病;抗SSA抗體與新生兒狼瘡和先天性傳導阻滯有關。抗SSA抗體也可見於病毒感染等非風濕性疾病。抗SSB抗體對原發性乾燥綜合征較特異,但陽性率僅27%左右。

4. 抗Scl-70抗體:一般僅見於系統性硬化症病人,陽性率20-60%。

5.抗Jol-1抗體見於30%的多發性肌炎病人及10%的皮肌炎病人。抗Jol-1抗體與多發性肌炎病人間質性肺炎的發生率增加有關。

6.抗rRNP 抗體:主要見於SLE患者,陽性率20%左右,與中樞神經系統病變有關,多在疾病活動期出現。

〖注意事項〗

判斷試驗結果時要結合臨床表現作出評價,也應根據試驗方法來作出解釋。對流免疫電泳法和雙相擴散法敏感性低,但特異性較高;免疫印跡法、斑點免疫法及ELISA方法敏感性提高,但特異性相對減少。

三.抗雙鏈DNA抗體(Antidouble-stranded DNA , A-dsDNA,)

A-dsDNA 對SLE有高度特異性,是針對細胞核脫氧核糖核酸的自身抗體。臨床上常用的檢測方法有:①Farr¡®s法:125I-DNA與待檢標本中的A-dsDNA形成免疫復合物,加飽和硫酸銨使復合物沉澱,以γ計數器分別測定上清中游離及沉澱物中已結合的125I-DNA含量,可計算出血清中A-dsDNA的結合活性。

②ELISA法:將小牛胸腺DNA包被在微孔板中,加入病人血清,如有A-dsDNA則結合到微孔板上,加入酶標抗人IgG,加入底物顯色後經酶標儀比色可知血清中A-dsDNA抗體的量。

③免疫熒光法:採用馬疫錐蟲或短膜蟲作為基質,加入病人血清。血清中的A-dsDNA與膜上的天然DNA結合,加入熒游標記抗人IgG。馬疫錐蟲和短膜蟲的動基體會發出綠色熒光。

④金標斑點法:雙鏈DNA包被於硝酸纖維膜上,加入病人血清,加入金標記抗人IgG,如有A-dsDNA存在,會顯示紅色斑點。

〖參考值〗依方法不同參考值也有不同。

Farr¡®s法:≤ 0.20 免疫熒光法:<1:10ELISA法:依試劑盒而定,一般<70u

金標法:陰性

〖臨床意義〗

A-dsDNA 陽性對 SLE 有較高的特異性。大約60%的活動性 SLE 病人會出現 A-dsDNA。其他風濕性疾病也會出現,但陽性率非常低,如RA、S.S。

〖注意事項〗

假陽性結果非常少見,但陰性亦不能排除SLE的診斷。

四.抗中性粒細胞胞漿抗體( Antineutrophil cytoplasmic antibody,ANCA) 測定

ANCA是針對中性粒細胞胞漿多種成分的 自身抗體,主要有髓過氧化物酶(MPO)和蛋白酶3( Proteinase 3 ,PR3)的抗體 。主要用於診斷Wegener 肉芽腫和系統性血管炎,特別是伴有腎病、呼吸疾病或其他類型血管炎引起多器官損害的患者。檢測方法有IFA、ELISA、 IBT等。

〖參考值〗 陰性。

〖臨床意義〗

免疫熒光法檢查ANCA陽性一般分為兩種熒光類型,一種是胞漿型,稱為cANCA,一種是核周型,稱為pANCA。cANCA產生彌漫性細胞漿染色,是針對PR3的抗體 ,一般見於wegener肉芽腫病(WG),特別是腎和肺受累的病人。pANCA產生核周染色,是針對MPO的抗體 ,主要見於系統性血管炎病人。

在WG病人中,cANCA陽性率在活動期可達80%,且有較高的抗體效價。在緩解期抗體陽性率低,且效價下降,或完全消失。

〖注意事項〗

ANCA 陽性也可見於 Good-Pastare¡®s 綜合征和SLE病人。WG的診斷不能單純依賴ANCA的結果,還要結合其他臨床表現,試驗室檢查和組織病理學檢查才能確定。ANCA效價不能完全反應疾病的活動以及對治療的反應。pANCA 陽性不是特異性的抗MPO抗體,也可以是抗粒細胞胞漿中其他酶的抗體,如彈性蛋白酶,組織蛋白酶G等。ANCA檢測應注意排除其他自身抗體的交叉反應,如ANA。因其可產生假陽性應注意鑒別,並進行ANA檢測。

五、抗線粒體抗體(Antimitochondrial antibody,AMA)

AMA是以細胞漿中的線粒體為抗原的一種自身抗體,無器官和種屬特異性。一般採用大鼠腎及胃作為抗原基質,採用IFA檢測,陽性可見大鼠腎和胃的細胞漿呈現細顆粒狀熒光。

採用免疫印跡法可將與線粒體抗原的反應分為從M1到M9九種類型,高效價的M2和M9型自身抗原與原發性膽汁性肝硬變相關。目前已有檢測M2的ELISA試劑盒供應。

〖參考值〗 陰性 >1:10 為陽性

〖臨床意義〗

AMA是原發性膽汁性肝硬化的標記抗體,陽性率達90%,並且50%患者抗體效價達1:1280或更高。此外,也可見於慢性活動性肝炎、隱匿性肝硬化。肝外阻塞性黃疸患者AMA常陰性,因此可作為鑒別診斷的一個指標。正常人中陽性率<10%,且效價較低。

六.抗平滑肌抗體(Antismooth muscle antibody,ASMA )

ASMA是抗肝細胞膜上一種肌動球蛋白的自身抗體。這種肌動球蛋白與平滑肌有交叉抗原性,因此與平滑肌有反應。一般採用IFA法,以大鼠胃作為抗原基質,陽性可見胃壁平滑肌呈現亮綠色熒光。

〖參考值〗 陰性,>1:10為陽性

〖臨床意義〗

主要見於明顯活動期的自身免疫性肝炎患者,陽性率在80%以上,效價 在1:80以上。急性病毒性肝炎早期ASMA也可陽性,且早於 HBsAg出現。其他疾病如傳染性單核細胞增多症、SS、RA、支原體肺炎、腫瘤和病毒感染者也有不同程度的陽性率。正常人中僅有2%陽性。

七. 抗甲狀腺球蛋白抗體(ATGA)和抗甲狀腺微粒體抗體(ATMA)

ATGA 是由甲狀腺炎引起的自身抗體 ,抗原是一種糖蛋白。ATGA有器官特異性而無種屬特異性。ATMA 的抗原是甲狀腺濾泡上皮細胞胞漿內的脂蛋白。常用檢測方法有:IFA、IHA、RIA、ELISA等。

〖參考值〗

IHA: 血清效價 ≤1:32, >1:32為陽性,ATGA 和ATMA

ELISA:正常為陰性,P/N < 2.1,>2.1 為陽性, ATGA 和 ATMA

RIA:ATGA <30%;ATMA <15%

l〖臨床意義〗

主要見於橋本甲狀腺炎、甲亢、甲低患者,也可見於甲狀腺瘤、惡性貧血、重症肌無力、Edison 病和肝臟疾病等。SLE及其他自身免疫病也有一定的陽性率。

正常人也可檢出這兩種抗體 ,並且隨著年齡的增長,陽性率增加,特別是40歲以上婦女,可達18%左右。

應該注意到,有的患者ATGA陰性,但ATMA陽性,因此兩種抗體同時檢測可提高抗甲狀腺自身抗體的檢出水平。

八. HLA-B27測定

HLA-B27 抗原為人類MHC I類 抗原B位點的表達產物,可分為幾種亞型。HLA -B27的檢測方法有多種,補體依賴性微量細胞毒法(CDMA);流式細胞儀法;玫瑰花法;ELISA法;等電聚焦法等。近來應用PCR法檢測HLA-B27,敏感而特異,並且可進行B27亞型的分析。

l〖參考值〗

非洲-美洲人:3-4%;l 高家索人:6-8%;l 亞洲人:1%。

〖臨床意義〗

強直性脊柱炎(AS)患者HLA-B27陽性率為90-95%。大約42%的青年類風濕關節炎(JRA)存在HLA-B27,Reiter¡®s 綜合征患者陽性率大約79%。此外,腸病性關節炎、銀屑病性關節炎也有一定的陽性率。RA病人陽性率不高。

〖注意事項〗

在評價HLA-B27陽性結果時應結合臨床表現綜合考慮,不能單純依靠此結果作出診斷。

其他免疫指標及檢測

C反應蛋白(C-Reactive Protein,CRP )

CRP是一種急性時相蛋白,由肝細胞合成,可與肺炎球菌細胞壁C多糖發生沉澱反應,故稱CRP。在各種炎症的急性期或組織創傷時,血清CRP濃度急劇升高。CRP不僅可結合多種細菌( bacteria ),真菌(fungi)及原蟲(protozoal)體內的多糖物質,而且在鈣離子存在下,還可以結合磷脂醯膽鹼和核酸。結合後的復合體具有激活補體(complement)的作用。〖參考值〗 <8mg/L

〖臨床意義〗

血清CRP 升高多見於:急性、慢性細菌感染;組織損傷壞死;急性心肌梗死;各種炎症;外科手術;腫瘤浸潤;急性風濕熱和活動性類風濕關節炎,以及其它關節炎性疾病。但病毒性感染一般CRP不升高,因此可作為病毒性感染和細菌性感染的'鑒別指標。

〖注意事項〗

CRP測定方法不同,在判定結果時應予考慮。此外,雌激素、口服避孕葯可使CRP增高,皮質激素和抗炎葯可使CRP下降。

類風濕因子(Rheumatoid Factor,RF)

RF是一種自身抗體,可與變性的IgG發生反應,與IgG 的Fc段結合。RF可分為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE五型。凝集試驗檢測的主要為IgM型RF。RF主要見於類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis RA),也可見於其他結締組織病及其他疾病。檢測方法有乳膠凝集試驗、致敏羊紅細胞凝集法、速率散射比濁法、ELISA法等。

〖參考值〗

乳膠法:陰性或<1:20 速率散射比濁法:<30IU/ml

〖臨床意義〗

RF見於90%以上的RA病人,效價常在1:160以上,含量多>80IU/ml。,一般方法所檢測的大部分是IgM-RF。

關於RF分型,臨床應用尚不廣泛。多數作者認為:IgM-RF效價高低可在一定程度上反映RA的活動性,但無明確的密切關系;IgG-RF與RA患者的滑膜炎、血管炎和關節外症狀密切相關;IgA-RF見於RA、硬皮病、Felty綜合征和系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE),也是RA臨床活動性的一個指標;IgE-RF 除RA患者外,也見於Felty綜合征和青年型RA。高水平 IgM-RF陽性病人預後較差。

從早期RA患者的X線片分析,IgM-RF持續陽性的病人更易發生骨侵蝕。IgA-RF在SS病人中陽性率較高;IgE-RF在惡性關節炎病人中陽性率較高。在RA病人,高效價RF存在並伴有嚴重的關節功能受限時,常提示預後不良。

〖注意事項〗

正常人也可有4%左右的陽性率。隨年齡增加,RF的檢出率會增加。RA病人RF也可陰性,不能單純依靠RF陽性來診斷RA。RF還可見於其它多種疾病,其中最常見的是乾燥綜合征(S.S), 發生率在90%以上,且含量一般較高。其它常見的RF陽性的疾病有: SLE、系統性硬化症、高球蛋白血症、結節病、梅毒、麻風、病毒感染、肝硬化等等。有些效價可在1:160以上,含量在80IU/ml以上,在解釋結果時應予注意。

冷球蛋白(Cryoglobulin CG,)

冷球蛋白是一種球蛋白,4℃時發生沉澱,30 ℃易聚合,37℃又溶解。CG分為三類:

1.I型(單克隆型):大多為IgM或IgG 型,無抗補體作用。

2.II型(混合型):兩種或兩種以上單克隆Ig混合,以IgM+IgG最常見,也可見IgA+ IgG;IgG+IgM+IgA等。有抗補體作用。

3. III型(多克隆型): 沒有單克隆蛋白。

其檢測方法有血球壓積管法(定性)和分光光度計法(定量)。

〖參考值〗 定性法:陰性 定量法:<80μg/ml。

〖臨床意義〗

SLE 病人血清中可出現混合型CG。在血管炎、腎小球腎炎、淋巴細胞增生性疾病也可陽性。在巨球蛋白血症或多發性骨髓瘤病人伴雷諾氏現象時與I型冷球蛋白血症有關。 II型冷球蛋白血症與自身免疫病例如血管炎、腎小球腎炎、SLE、RA 和 SS 有關。在某些感染如肝炎、傳染性單核細胞增多症、巨細胞病毒感染和弓形蟲病也可出現。

小結:

胞漿抗體

Hep-2細胞具有許多胞漿抗原。如有特異性胞漿抗體存在,可出現強陽性胞漿熒光。包括抗線粒體抗體(AMA)、抗核糖體抗體、抗肌動蛋白抗體即抗平滑肌抗體(ASMA)、抗高爾基體抗體、抗絲抗體(如Vimentin)。一般最有意義的是AMA和ASMA,可是熒光染色Hep2細胞卻不能鑒定這兩種抗體,可應用鼠腎和鼠胃切片作進一步分析。

系統性風濕病活動期的評價

自身抗體檢測以診斷全身性疾病比監測該病活動更有意義。但抗dsDNA抗體效價卻與活動性有關。應定期檢測抗dsDNA抗體的效價及C3、C4的含量。以及測定循環免疫復合物(CIC)的含量。ESR和CRP在炎症反應時常常升高。RA病情加重時,CRP明顯增高。SLE活動期,CRP一般正常。

器官特異性自身免疫性疾病

組織抗體

許多自身抗體可採用IFA測定,用鼠腎和胃的切片能測出抗線粒體、平滑肌、肝腎微粒體和胃壁細胞的抗體。甲狀腺組織切片可測定抗甲狀腺自身抗體。

自身免疫性肝病

在肝臟病變中,ANA陽性率可達40-80%。抗線粒體抗體(AMA)與原發性膽汁性肝硬變有關。特別是高效價的M2和M9線粒體抗原。

約一半的自身免疫性肝炎的病人有較高效價的ASMA。此外,肝腎微粒體抗體(LKMAs),抗可溶性肝抗原(SLA)抗體,抗肝細胞膜抗體等也可用於自身免疫性肝病診斷和監測。

其他

腎臟疾病常測定的抗體有抗dsDNA抗體,抗腎小球基底膜抗體等,還可測定CIC,以及作腎組織活檢進行熒光染色。

韋格納肉芽腫病是一種發生於上下呼吸道的壞死性血管炎,也累及腎臟,病人常死於腎和肺衰竭。檢查抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCAs)是診斷指標之一。也可通過ELISA測定抗髓過氧化物酶抗體,抗蛋白酶3抗體,有助於診斷和鑒別診斷。

胃腸道疾病中,惡性貧血與抗胃壁自身抗體有關,與抗內因子抗體的相關性達75%。抗胰島細胞抗體(ICAs),抗谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)與I型糖尿病有一定關系。重症肌無力病人可出現抗骨骼肌抗體。多發性肌炎和皮肌炎可有抗Pm1和抗Jo-1抗體。抗心肌抗體常見於心肌梗死、心臟手術或心肌損傷後。

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⑺ 免疫分析方法有哪些

(1)放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)。RIA技術是使用以放射性同位素(如125I、32P、3H等)作標記的抗原或抗體,用γ-射線探測儀或液體閃爍計數器測定γ-射線或β-射線的放射性強度,來測定抗體或抗原量的技術。它包括以標記抗原為特點的放射免疫分析和以標記抗體為特點的免疫放射分析(immunoradiometricassay,IRMA)。前者以液相競爭結合法居多,既測大分子抗原又測小分子抗原;後者以固相法測大分子抗原為主。

RIA在早期建立的農葯免疫分析方法中佔了很大比重,建立了狄氏劑、艾氏劑、2,4-D和2,4,5-T、對硫磷和百草枯等農葯的放射免疫分析法。盡管該方法靈敏度非常敏銳(RIA通常為10-9g、10-12g,甚至10-15g),應用范圍廣,但進行RIA需使用昂貴的計數器,也存在放射線輻射和污染等問題,因此在農葯殘留檢測領域的應用和發展受到了一定的限制,並逐步為其他免疫分析方法所取代。

(2)酶免疫分析法(enzymeimmunoassay,EIA)。EIA是繼RIA之後發展起來的一項免疫分析技術。其檢測原理與放射免疫法類似,但所用的標記物為酶,它將抗原、抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化作用有機結合起來,通過測定結合於固相的酶的活力來測定被測定物的量。用做標記物的酶有辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和鹼性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)、葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,GO)、脲酶(urease)等。酶標記反應的固相支持物有聚苯乙烯塑料管、膜等。目前大多數採用96孔酶標板(MTP)作為固相支持物。這種板的檢測容量大,樣本數量多,只需有台簡單的酶標儀就可得出准確的檢測數據。也有學者採用磁珠作為固相材料進行EIA研究,其原理是將高分子材料(聚苯乙烯、聚氯乙烯等)包裹到金屬小顆粒(Fe2O3,Fe3O4)外面,再通過化學方法鍵合上氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、羥基(-OH)等活性基團,再與抗體或抗原耦聯,製成免疫性微珠。該方法的優點是微珠比表面積大,吸附能力強,能懸浮在液相中快速均勻的捕獲樣品中的待測物,通過外加磁場後能夠實現微珠與樣品液的快速分離,從而減少檢測時間、提高檢測靈敏度。

由於酶標試劑制備容易、穩定、價廉,酶免疫分析的靈敏度接近放射免疫技術,故近年來EIA技術發展很快,已開發了多種EIA方法。其中酶聯免疫法(,ELISA)是目前農葯殘留檢測中應用最廣泛的酶免疫分析技術。

(3)熒光免疫分析法(fluorescenceimmunoassay,FIA)。FIA檢測的基本原理是將抗原抗體的高度特異性與熒光的敏感可測性有機地結合,以熒光物質作為示蹤劑標記抗體、抗原或半抗原分子,制備高質量的特異性熒光試劑。當抗原抗體結合物中的熒光物質受到紫外光或藍光照射時,能夠吸收光能進入激發態。當其從激發態回復基態時,能以電磁輻射形式放射出所吸收的光能,產生熒光。繪制農葯濃度-熒光強度曲線,可以定性、定量檢測樣品中的農葯殘留量。

適用於抗體、抗原或半抗原分子標記的熒光素須符合要求:①應具有能與蛋白質分子形成穩定共價鍵的化學基團,或易轉變成這類反應形式而不破壞其熒光結構;②標記後,熒光素與抗體或抗原各自的化學結構和性質均不發生改變;③熒光效率高,與蛋白質結合的需要量很少;④熒光素與蛋白質結合的過程簡單、快速,游離的熒光素及其降解產物容易除去;⑤結合物在一般儲存條件下性能穩定,可保存使用較長時間。

(4)化學發光免疫分析法(luminescentimmunoassay,LCIA)。LCIA又可分為化學發光免疫測定(chemiluminescentimmunoassay,CLCIA)和生物發光免疫測定(bio-luminescentImmunoassay,BLCIA)。

1976年,Shroeder首先用生物素(B)-親和素(A)系統建立了均相化學發光免疫測定技術,爾後Halman和Velan又將其引伸到非均相體系,現已滲入到生物學研究的各個領域。其原理是以發光指示抗原與抗體的結合,當發游標記物與相應的抗體或抗原結合後,底物與酶作用,或與發光劑產生氧化還原反應,或使熒光物質(例如紅熒烯等)激發,釋放光能。最後用光度計測定其發光強度,進行定量分析。常用發游標記物有辣根過氧化物酶(HRP)、魯米諾(luminol)、異魯米諾(isoluminol)、咯粉鹼(lophine)、光澤精(lucigen)、雙(2、4、6-三氯苯)草酸酯、聯苯三酚和6[N-(4-二氨基丁基)-N-乙基]-氨基-2,3-二氫吩嗪-1,4-二酮(ABEI)等。用上述發游標記物標記的抗體(或抗原)在一定的pH緩沖溶液中與相應的抗原(或抗體)結合時,在協同因子(例如H2O2等)的作用下發光,其發光強度與被測物的濃度成正比,故可以用於定量分析。

發光免疫測定具有特異性強、靈敏度高(檢測限量達10-15mol/L)、快速(1~3h)、發光材料易得等優點。但其發光過程和強度常受到發光物質本身的化學結構、介質的pH、協同發光物質和金屬離子雜質等影響。

(5)金免疫層析分析法(goldimmuno-chromatographyassay,GICA)。GICA檢測原理是將配體(抗體或抗原)以線狀包被固化於硝酸纖維素膜等微孔薄膜上,膠體金標記另以配體或其他物質並以干態固定在吸水材料上,通過毛細作用,使樣品溶液在層析條上泳動,當泳動至膠體金標記物處時,如樣品中含有待檢受體,則發生第一步高度特異性的免疫反應,形成的免疫復合物繼續泳動至線狀包被區時,發生第二步高度特異性的免疫反應,形成的免疫復合物被截留在包被的線狀區,通過標記的膠體金而顯紅色條帶(檢測帶),而游離的標記物則越過檢測帶,與結合的標記物自動分離。通過檢測帶上顏色的有無或色澤深淺來實現定性或定量測定2。

2金標試紙條檢測

GICA法具有快速(5~20min)、廉價、結果明確、無需復雜操作技巧和特殊設備、攜帶方便等優點。但相對於其他免疫分析方法,該方法檢測靈敏度稍低,主要適合現場快速定性或半定量測定。目前該方法已被應用於醫學和生物學等眾多研究領域,尤其在發達國家已經得到了廣泛的應用。

(6)免疫分析與儀器分析技術的聯用技術。使用單一的IA技術進行農葯殘留分析獲得的信息量少,而理化分析方法的選擇性又比較差。Kramer等人將免疫分析法和液相色譜法(LC)聯合起來使用,從而簡化了分析方法,提高了檢測效率。LC-IA的聯用,將LC的高分離能力和IA的高靈敏性和高特異性融為一體。該分析法尤其適合多組分殘留分析和微量分析。免疫分析與氣相色譜/質譜(GC/MS)的聯用可減少結構相似的農葯或代謝產物分析中的交叉反應,以降低假陽性。

⑻ 免疫診斷方法有哪些

應用免疫學的理論、技術和方法診斷各種疾病和測定免疫狀態。在醫學上,它是確定疾病的病因和病變部位,或是確定機體免疫狀態是否正常的重要方法。此外,還應用於法醫學的血跡鑒定、生物化學的血清成分鑒定和物種進化關系的研究等。可在體內和體外進行。從免疫學的角度免疫診斷可應用於:(1)檢查免疫器官和功能發生改變的疾病:如免疫缺陷病、自身免疫病。(2)由免疫機制引起的疾病:如輸血反應、移植排斥反應。(3)一些內分泌性的疾病:從臨床學的角度來說,免疫診斷可應用於檢查傳染性疾病、免疫性疾病、腫瘤和其他臨床各科疾病。就所檢測的反應物免疫診斷大致可以分為兩類,即:(1)免疫血清學診斷:檢測病人血清或組織內有無特異性抗體或特異性抗原。(2)免疫細胞學診斷:測定病人細胞免疫力的有無和強弱。免疫診斷須體現3項要求:(1)特異性強,盡量不出現交叉反應,不出現假陽性,以保證診斷的准確性。(2)靈敏度高,能測出微量反應物質和輕微的異常變化,有利於早期診斷和排除可疑病例。(3)簡便、快速、安全。

⑼ 免疫學檢驗常用技術有哪些

以下是幾種常用的免疫學技術:
1.免疫熒光技術
免疫熒光技術是利用熒光素標記的抗體(或抗原)檢測組織、細胞或血清 中的相應抗原(或抗體)的方法。由於熒光抗體具有安全、靈敏的特點,因此已 廣泛應用在免疫熒光檢測和流式細胞計數領域。根據熒光素標記的方式不同,可 分為直標熒光抗體和間標熒光抗體。間標熒光抗體中一抗並不直接連接熒光素, 而是先將一抗結合到蛋白,然後帶有熒光素的二抗再結合至一抗。通過二抗的結 合,能將信號進行放大,因此能在一定程度上提高檢測的靈敏度,但是隨之帶來 的高背景也降低了檢測的特異性。近年來,隨著熒光素和熒光檢測技術的不斷進 步,熒光檢測的靈敏度已經接近同位素檢測的水平,直接標記的熒光抗體逐漸取 代間接標記抗體。這些標記了熒光素的抗體直接結合至抗原,大大提高了檢測的 特異性,使檢測的結果更加准確可靠。熒光檢測技術的發展,使得免疫熒光技術 在傳染病診斷上有廣泛的用途,如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病,檢查IgM 抗體,做為近期接觸抗原的標志。利用單克隆熒光直接標記抗體鑒定淋巴細胞的 亞類。通過流式細胞儀,針對細胞表面不同抗原,可以同時使用多種不同的熒光 抗體,對同一細胞進行多標記染色。
2.放射免疫檢測
放射免疫檢測技術是目前靈敏度最高的檢測技術,利用放射性同素標記抗 原(或抗體),與相應抗體(或抗原)結合後,通過測定抗原抗體結合物的放射 性檢測結果。放射性同位素具有pg 級的靈敏度,且利用反復曝光的方法可對痕 量物質進行定量檢測。但放射性同位素對人體的損傷也限制了該方法的使用。

3.酶聯免疫吸附試驗(ELISA)
酶聯免疫檢測是目前應用最廣泛的免疫檢測方法。該方法是將二抗標記上 酶,抗原抗體反應的特異性與酶催化底物的作用結合起來,根據酶作用底物後的 顯色顏色變化來判斷試驗結果,其敏感度可達ng 水平。常見用於標記的酶有辣 根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶(AP)等。由於酶聯免疫法無需特殊的儀器, 檢測簡單,因此被廣泛應用於疾病檢測。常用的方法有間接法、夾心法以及BAS -ELISA。間接法是先將待測的蛋白抱被在孔板內,然後依次加入一抗、標記了 酶的二抗和底物顯色,通過儀器(例如酶標儀)定量檢測抗原。這種方法操作簡 單但由於高背景而特異性較差。目前已逐漸被夾心法取代。夾心法利用二種一抗 對目標抗原進行捕獲和固定,在確保靈敏度的同時大大提高了反應的特異性。近 年來,抗原的定量檢測技術也不斷推陳出新。近年來,在夾心法ELISA 的基礎上, 開發了多抗原檢測試劑盒,能同時檢測微量液相樣本中多個抗原含量。這項技術 的應用大大縮短了診斷的時間,提高診斷的可靠性和及時性。
4.免疫金膠體技術
膠體金技術經過30 多年的發展到現在已日趨成熟,該方法是將二抗標記上 膠體金顆粒,利用抗原抗體間的特異性反應,最終將膠體金標記的二抗吸附於滲 濾膜上,此方法簡單,快速,廣泛應用於臨床篩查。

⑽ 免疫檢測方法

免疫檢測方法大全2017

免疫學檢測技術的用途非常廣泛,它們可用於有關免疫疾病的診斷、療效評價及發病機制的研究。如對傳染病、免疫增殖性疾病、免疫缺損病、超敏反應、自身免疫病、移植排斥反應腫瘤的免疫學檢測,對診斷、治療均有很大幫助。此外在醫學生物學研究中對抗原性物質或細胞的定性、定量檢查不僅推動了對各種免疫學現象的研究,而且擴大免疫學與醫學生物許多領域的聯系。本章僅介紹常用免疫學檢測方法的原理,簡要過程和實用意義。下面是我為大家帶來的關於免疫學檢測法的知識,歡迎閱讀。

第一節抗原或抗體的檢測

一、檢測的原理

藉助抗原和抗體在體外特異結合後出現的各種現象,對樣品中的抗原或抗體進行定性、定量、定位的檢測。

1.抗原與抗體的親和力(affinity)抗原抗體的結合就像酶與底物的結合,激素與其受體的結合一樣不是化學的反應,而是非共價鍵的可逆的結合。抗原決定簇和抗體分子可變區互補構型,造成兩分子間有較強的親和力。空間構型互補程度不同,抗原和抗體分子之間結合力強弱也不同。互補程度高,則親和力強。此外,反應溫度、酸鹼度和離子濃度對抗原和抗體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重要的影響,抗體與抗原決定簇之間的結合力大小可用親合力來表示。高親合力的抗體與抗原的結合力強,即使抗原濃度很低時也有較多的抗體結合抗原形成免疫復合物。

2.抗原或抗體外檢測原理根據抗原抗體結合形成免疫復合物的性狀與活性特點,對標本中的抗原或抗體進行定性、定位或定量的檢測。定性和定位檢測比較簡單,即用已知的抗體和待檢樣品混合,經過一段時間,若有免疫復合物形成的現象發生,就說明待檢樣品中有相應的抗原存在。若無預期的現象發生,則說明樣品中無相應的抗原存在。同理也可用已知的抗原檢測樣品中是否有相應抗體。

對抗原或抗體進行定量檢測時,以反應中加入抗原和抗體的濃度與形成免疫復物的濃度呈函數關系。

(1)根據免疫復合物產生的多少來推算樣品中抗原(或抗體)的含量:在一定的反應條件下,加入的已知抗體(或抗原)的濃度一定,反應產生的免疫復合物多少與待檢樣品中含有相應抗原(或抗體)量成正比。也就是抗體濃度一定時,免疫復合物越多則樣品中的抗原量也越多。可用實驗性標准曲線推算出樣品中抗原(或抗體)的含量。如免疫單向擴散試驗、免疫比濁試驗和酶聯免疫檢測等都屬於這類方法。

(2)抗原或抗體效價滴定的原理:當抗原抗體復合物形成多少不能反應抗原抗體反應強弱時,就不能以檢測反應強度來對抗原或抗體進行定量。在實際工作中,把濃度低的反應成分(抗原或抗體)的濃度固定,把濃度高的另一種反應成分作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫3隻家兔,比較3隻家兔產生抗體的多少,即滴定3隻兔血清抗體效價,可用雙向瓊脂擴散法來滴定,例如將抗體濃度固定,將抗原作不同的稀釋度,分別將抗原或抗體滴入瓊脂的相應小孔中,觀察免疫兔血清與不同稀釋度的抗原出現明顯沉澱淺的抗原稀釋度(如甲兔的抗體效價為1/2000,而丙免的是1/8000則可比較出後者比前者產生抗體的效價要高)。也就是表示效價的稀釋度越高,樣品中所含待檢成分越多。因人血清(抗原)和抗體(免疫兔血清)相比,濃度高,故應稀釋抗原。

二、抗原或抗體檢測的實用意義

1.抗體檢測的意義檢測抗體可用於評價人和動物免疫功能的指標。抗體用於臨床治療或實驗研究時也需做純度分析和定量測定。臨床上檢測病人的抗病原生物的抗體、抗過敏原的抗體、抗HLA抗原的抗體、血型抗體及各種自身抗體,對有關疾病的診斷有重要意義。

2.抗原檢測的意義可做為抗原進行檢測的物質可分為以下四類:

(1)各種微生物及其大分子產物:用於傳染病診斷、微生物的分類及鑒定以及對菌苗、疫苗的研究。

(2)生物體內各種大分子物質:包括各種血清蛋白(如各類免疫球蛋白、補體的各種成分)、可溶性血型物質、多肽類激素、細胞因子及癌胚抗原等均可做為抗原進行檢測。在對這些成分的生物學作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意義。

(3)人和動物細胞的表面分子:包括細胞表面各種分化抗原(如CD抗原)、同種異型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相關抗原和腫瘤相關性情抗原等。檢測這些抗原對各種細胞的分類、分化過程及功能研究、對各種與免疫有關的疾病的診斷及發病機制的研究,均有重要意義。

(4)各種半抗原物質:某些葯物、激素和炎症介質等屬於小分子的半抗原,可以分別將它們偶聯到大分子的載體上,組成人工結合的完全抗原。用其免疫動物,制備出各種半抗原的抗體,應用於各種半抗原物質的檢測,例如對某些病人在服用葯物後進行血中葯物濃度的監測。對運動員進行服用違禁葯品的檢測,都是應用半抗原檢測的方法。

三、抗原或抗體檢測的方法

由於各種檢測方法中所用的抗原性狀不同,出現結果的現象也不同。最廣泛應用方法有下述幾種:

(一)沉澱反應

可溶性抗原與抗體結合,在兩者比例合適時,可形成較大的不溶性免疫復合物。在反應體系中出現不透明的沉澱物,這種抗原抗體反應稱為沉澱反應(precipitation neaction)。

1.環狀沉澱試驗先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小於0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊於上,讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇,形成白色免疫復合物沉澱環,故名為環狀沉澱試驗(ring precipitationtest),此法簡便易行,需用材料較多是其缺點。

2.單向免疫擴散試驗單向免疫擴散試驗(single immunodiffusion)是在凝膠中進行的沉澱反應。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中,傾注於玻片上,製成含有抗體的瓊脂板,在適當位置打孔,將抗原材料加入瓊脂板的小孔內,讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴散,與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復合物。當復合物體積增加到一定程度時停止擴散,出現以小孔為中心的圓形沉澱圈,沉澱圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關。本方法簡便,易於觀察結果,可測定抗原的靈敏度(最低濃度)約為10~20μg/ml,常用於定量測定人或動物血清IgG、IgM、IgA和C3等,其缺點是需1~2天才能看結果

3.免疫比濁法 當抗體濃度高,加入少量可溶性抗原,即可形成一些肉眼看不見的小免疫復合物,它可使通過液體的光束發生散射,隨著加入抗原增多,形成的免疫復合物也增多,光散射現象也相應加強。免疫比濁法(immunonephelomytry)就是在一定的抗體濃度下,加入一定體積的樣品,經過一段時間,用光散射濁度計(nephelometry)測量反應液體的濁度,來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便,可取代單向擴散法定量測定免疫球蛋白的濃度。

4,雙向免疫擴散試驗 雙免疫擴散試驗(double immunodiffusion)是在瓊脂板上按一定距離打數個小孔,在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散,在兩孔間可出現2~3條沉澱線,本法常用於抗原或抗體的定性或定量檢測,或用於兩種抗原材料的抗原相關性分析。

5.對流免疫電泳對流電泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快速的檢測方法,即在電場作用下的雙向免疫擴散。將瓊脂板放入電泳槽內,使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向,於負極側的孔內加入抗原,於正極側的孔內加入抗體,通電後,抗原帶負電荷向正極泳動,抗體分子雖也帶負電荷,但因分子量大,向正極的位移小,而受瓊脂中電滲作用向負極移動,抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復合物的沉澱線。只需1小時左右即可觀察結果。

6.免疫電泳 免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個步驟,即先進行電泳,再進行瓊脂擴散。先將樣品加入瓊脂中電泳,將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然後在適當的位置上沿電泳方向挖一直線形槽,於槽內加入含有針對各種抗原混合抗體液,讓各抗原成分與相應抗體進行雙向免疫擴散,可形成多答卷沉澱線。常用此法進行血清的蛋白種類分析。對於免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義

7.免疫印跡法免疫印跡法(immunoblotting)又稱為Western印跡法,用於AIDS的血清抗體檢測。第一步,為電泳分離HIV抗原,在電場中根據分子量大小不同病毒抗原各成分散開。第二步,將電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維膜上(電印跡),然後將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕於病人血清中。如果病人血清中含有與一種或幾種抗原相對應的抗體的話,則在該抗原印跡部位形成免疫復合物沉澱。在洗去未沉澱的抗原和抗體後,在膜上加標記的抗人免疫球蛋白的抗體,此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復合物發生反應,最後加入顯色底物(如果抗人Ig是用酶標記的)或做放射自顯影(抗人Ig用125Ⅰ標記)以顯示結果

第一步:經電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離;

第二步:將已分離的抗原經電印跡轉移到硝酸纖維膜上;

第三步:將待檢病人血清加入覆蓋於硝酸纖維膜上;

第四步:加入標記的第二抗體使之覆蓋膜上;

第五步:加入顯色底物(或放射自顯影)顯現第二抗體

(二)凝集反應

細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆粒抗原,當與相應抗體結合,抗原與抗體結合形成凝集團塊,即稱為凝集反應(agglutination)。

1.直接凝集 直接凝集(direct agglutination)是將細菌或紅細胞與相應抗體結合產生的細菌凝集或紅細胞凝集現象。可用於傳染病診斷如肥達氏反應(Widal reaction)診斷傷寒病。或利用血細胞凝集現象檢查血型。

2.間接凝集 間接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳膠顆粒或紅細胞表面,與相應抗體混合出現的凝集現象。如用γ球蛋白包乳膠顆粒檢測類風濕關節炎病人血清中的類風濕因子,用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用於檢測甲狀腺球蛋的抗體。也可以將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標本中的抗原,如細菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆粒,一旦與含有相應抗原的腦脊液混合,便可發生凝集,可進行快速診斷。故凝集反應即可測定抗原,也可測抗體,方法簡便、敏感。

3.抗球蛋白試驗 抗球蛋白試驗(antiglobulin test,coombs test)的原理為間接凝集試驗。例如應用於診斷自身免疫溶血性貧血症時,Rh+紅細胞與抗Rh血清間的反應。因抗Rh抗體是IgG只有兩個結合價,分子較小(不如IgM結合價多,分子大)很難直接引起Rh+紅細胞凝集。如果加入抗IgG的抗體,就可幫助抗Rh的IgG的抗體凝集紅細胞。也就是經抗Ig的作用提高凝集反應的'靈敏度。

(三)補體參與抗原抗體反應

這一類反應主要包括溶血反應(hemolytic assay)、補體介導的細胞毒試驗(complement mediated cytotoxicuty test)及補體結合試驗(complement fixation test)。

1.溶血反應 抗體與紅細胞表面抗原相遇,形成紅細胞-抗體復合物即可使加入反應中的補體活化,導致紅細胞溶解,此方法可用於紅細胞的各種抗原或相應抗體的檢測,此法比凝集反應敏感。溶血反應也是用於抗體分泌細胞即空斑形成細胞(PFC)檢測的原理。

2.補體介導的細胞毒試驗各種有核細胞與針對其表面抗原的抗體相遇,所形成的免疫復合物能活化反應中的補體,引起細胞膜穿孔,在一定時間內,細胞仍能維持一定的形態不破碎,加入水溶性染如伊紅Y(eosin Y)或台盼藍(trypan blue)後,染料即可進入被活化補體穿孔的細胞,不帶相應抗原細胞膜保持完整的活細胞不著色。此方法可用於帶各種抗原的細胞的檢測,如進行細胞MHC抗原的鑒定,和進行淋巴細胞中T細胞總數或其亞類的計數。在一些免疫學實驗中也可用這種方法,根據需要特異地消除帶某種抗原的細胞。

3.補體結合試驗當抗原(可溶性或顆粒性)與相應抗體結合,由於濃度低不出現可見反應時,應用補體結合試驗可檢出此抗原抗體反應,它比凝集反應或沉澱反應靈敏度高。本法包括兩個抗原抗體系統。一為檢測系統由待檢樣品與已知抗原(或抗體)組成;另一為指示系統,由綿羊紅細胞(SRBC)和抗SRBC組成。另加入作為補體的新鮮豚鼠血清。試驗時試管中先加入檢測系統和補體,混合經37℃30分鍾使抗原、抗體、補體形成復合物,再加入指示系統,如出現溶血現象,說明檢測系統中沒有相對應的抗原抗體,補體是游離的指示系統的SRBC和抗體結合而出現溶血,即為反應陰性。如不出現溶血,表明檢測系統中有抗原抗體復合物並結合補體,則指示系統無多餘的補體作用而沒有溶血現象,即為陽性。

在敏感的抗原、抗體檢測方法(如酶標方法)出現之前補體結合試驗曾廣泛用於檢測各種細菌、病毒或螺旋體(如梅毒)的抗原或抗體,由於本試驗影響因素多,結果不穩定現已被新檢測方法所代替。

四、用標記抗體或抗原進行的抗原、抗體反應

用熒光素、同位素或酶標記抗體或抗原,用於抗原或抗體檢測是目前廣泛應用的敏感、可靠的方法。上述三種常用的標記物與抗原或抗體化學連接之後不改變後者的免疫特性。本方法可用於定性、定量或定位檢測。

1.免疫熒光技術免疫熒光技術(immunofluorescence techni)是用化學方法使熒光素標記的抗體(或抗原)與組織或細胞中的相應抗原(或抗體)結合,進行定性定位檢查抗原或抗體的方法。

(1)直接熒光法:把熒光抗體加到待檢的細胞懸液,細胞塗片或組織切片上進行染色,經抗原抗體反應後,洗去未結合的熒光抗體,將待檢標本在熒光顯微鏡下觀察,有熒光的部位即有相應抗原存在,此法可用於病毒感染細胞、帶某種特異抗原的細胞(如T細胞和B細胞)或病原菌的檢查,也可用於組織中沉著的免疫復合物的檢查。本法的缺點是檢查多種抗原,就需分別制備相應的多種標記抗體。

(2)間接熒光法:可克服直接法需制備多種熒光抗體的復雜操作。將組織或細胞上的抗原直接與相應抗體(不標記熒光)結合,此為第一抗體,再把能與第一抗體特異結合的熒游標記的抗免疫球蛋白抗體加入,此為熒游標記的第二抗體,觀察結果與直接法相同。間接法比直接法敏感性高,如果用於檢查抗原的第一抗體是人或動物的只需制備一種抗人或動物的免疫球蛋白熒光抗體

免疫熒光技術在傳染病診斷上有廣泛的用途,如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病,檢查抗原或抗體,如查出IgM抗體,可做為近期接觸抗原的標志,所以使用熒游標記抗IgM可診斷近期感染。除微生物學方面的應用外,還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細胞的亞類。使用流式細胞儀(fluorescene-activated cell sorting,FACS),能自動檢測細胞的大小、熒光強度。針對細胞表面不同抗原,可以使用兩種不同的熒光染料,如用異硫氰熒光素(FITC)發黃綠熒光,用羅丹明(TMRITC)發紅色熒光。由於熒光顏色不同標記兩種不同的抗體,對同一細胞進行雙標記染色。對淋巴細胞亞類鑒定起著巨大推動作用。應用間接熒光法也用於自身免疫病的抗核抗體檢查。

2.放射免疫分析法 放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)應用競爭性結合的原理,應作放射性同素標記抗原(或抗體)與相應抗體(或抗原)結合,通過測定抗原抗體結合物的放射活性判斷結果,本方法可進行超微量分析,敏感性高,可用於測定抗原、抗體、抗原抗體復合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。

放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種:

(1)液相法:將待檢標本(例如含胰島素抗原)與定時的同位素標記的胰島素(抗原)和定時的抗胰島素抗體混合,經一定作用時間後,分離收集抗原抗體復合物及游離的抗原,測定這兩部分的放射活性,計算結合率。在反應系統中,待檢標本的胰島素抗原與同位素標記的胰島素競爭奪戰性與胰島素抗體結合。非標記的抗原越多,標記抗原與抗體形成的復合物越少。非標記抗原含量與標記抗原抗體復合物的量呈一定的函數關系。預先用標準的非標記抗原作成標准曲線後,即可查出待檢標本中胰島素的含量

(2)固相法:將抗原或抗體吸附到固相載體表面,然後加待檢標本,最後加標記抗體。測定固相載體的放射活性,常用的固相載體有溴化氰(CNBr)海豹化的紙片或聚苯乙烯小管

放射免疫分析法應用范圍廣泛,包括多種激素(胰島素、生長激素、甲狀腺素等)維生素、葯物、IgE等。

3.酶聯免疫分析法 酶聯免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)是當前應用最廣泛的免疫檢測方法。本法將抗原抗體反應的特異性與酶對底物高效催化作用結合起來,根據酶作用底物後顯色,以顏色變化判斷試驗結果,可經酶標測定儀作定量分析,敏感度可達ng水平。常用於標記的酶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酶(alkaline phosphatase)等。它們與抗體結合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩定性,製成酶標抗體可保存較長時間。目前常用的方法有酶標免疫組化法和酶聯免疫吸附法。前者測定細胞表面抗原或組織內的抗原;後者主要測定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測試儀器,所以較放射免疫分析法更易推廣。

(1)酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是與上述固相RIA相似的原理,將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行政區。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。

(2)夾心法(sandwich assay):將已知的特異抗體包裝在固相載體(塑料板凹孔或紙片上),加入待檢標本,標本中的抗原即可與載體上的抗原結合,洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體,洗去未結合的酶標抗體,加底物顯色,用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度,可定量測定抗原。

間接法(indirecr ELISA)常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體,加入待檢標本(可能含有相應抗體),再加入酶標抗Ig的抗全(即第二抗體),經加底物顯色後,根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。

(3)BAS-ELISA:近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑,組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素(avidin)分子可以結合4個生物素分子(biotin)。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合,而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子,通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統(biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA),它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統,同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。

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