內毒素檢測方法驗證方案

① 細菌內毒素檢查方法是否必須做驗證

細菌內毒素的檢測必須進行驗證方可用於產品驗證，因每一個產品的所使用的細菌內毒素限值勻不一樣，故須進行驗證確定產品的細菌內毒素限值。並確定產品的最終稀釋倍數。

② 中國葯典和美國葯典中的細菌內毒素檢測法的不同點比較

中國葯典和美國葯典中的細菌內毒素檢測法的不同點比較

1、細菌內毒素工作標准品（CSE）

CP 對CSE的用途及效價進行定義「細菌內毒素工作標准品中每1ng細菌內毒素的效價應不小於2EU，不大於50EU」

USP未提

2、細菌內毒素檢查用水

CP ： 與靈敏度為0.03EU/ml或更高靈敏度的鱟試劑在37±1℃條件下24小時不產生凝集反應的滅菌注射用水

USP：與鱟試劑在限定的靈敏度下不發生反應的滅菌注射用水或其它水。

CP：用於細菌內毒素定量測定用的細菌內毒素檢查用水，內毒素含量應小於0.005EU/ml。

USP： 未提到。

3、實驗用具的准備

CP：實驗所用器皿需要經處理，除去可能存在的外源性內毒素，常用的方法是250℃下干烤至少1小時，也可用其它確證不幹擾細菌內毒素檢查的適宜方法。

USP：使用經驗證的除熱原程序對所有玻璃器皿和遇熱穩定的材料在熱空氣烘箱中進行除熱原，常用的最低溫度和最少的時間是250℃下30分鍾。

(2)內毒素檢測方法驗證方案擴展閱讀

細菌內毒素檢查法的注意事項：

在細菌內毒素檢查方法的建立中，計算內毒素限值L、MVD和MVC時，需要注意最大人用劑量、產品規格、鱟試劑的靈敏度等重要的參數，因為計算錯誤會導致後續的所有努力均告失敗。常見的問題有：

(1)臨床用葯劑量確定不正確，僅用常規用葯劑量，未考慮臨床可能的人體最大用葯劑量和給葯途徑，在限值計算公式L=K/M中，由於對K值及M值的定義模糊，使K值及M值賦值不準確，最終導致限值計算錯誤。

例如，某注射劑臨床成人每次靜脈滴注給葯40-80mg，嬰兒(三個月以上)靜脈滴注給葯每次10-20mg。

按成人(體重60kg)劑量計算限值為3.75EU/mg，而嬰兒體重僅為5kg左右，計算限值約為1.25EU/mg，如果不考慮臨床每公斤體重最大用葯劑量，細菌內毒素限值就會出現較大的差別。

(2)有的申報品種細菌內毒素限值不是根據臨床用量計算出來，而是根據同品種熱原檢查的劑量推算出來的，造成限值錯誤。

(3)有的品種細菌內毒素限值從國外葯典抄來，沒有考慮該品種國內上市的臨床使用劑量及中國人與國外人均體重等的差異，也造成限值確定不正確。

(4)錯誤的計算日給葯劑量(一日內多次給葯)。

(5)在品種規格(濃度)發生變化時，計算MVD沒有進行調整。

(6)建立方法時所用的最大給葯劑量已經超出了臨床所用劑量等。

③ 在檢測內毒素中，哪些樣品需要預處理方法是什麼和檢測方法

1、對於過酸、過鹼或本身有緩沖能力的供試品，需調節被測溶液（或其稀釋液）的PH值，可使用酸、鹼溶液或適宜的緩沖液調節PH值。
2、酸或鹼溶液須用細菌內毒素檢查用水在已去除內毒素的容器中配製。
3、內毒素凝膠法或定量法。

④ 求助：注射用水的細菌內毒素檢查方法

《中國葯典》規定注射用水細菌內毒素限值為：0.25EU/ml
因注射用水無干擾成分存在，可以不用稀釋直接檢測，最簡便的方法是採用靈敏度0.25EU/ml的鱟試劑（TAL））直接檢查。
即 取8支靈敏度為0.25EU/ml的TAL，每支加0.1ml細菌內毒素檢查用水（BET水）復溶，再分別制樣品管2支（直接加入1ml注射用水）；陰性對照管2支；陽性對照管2支；PPC管2支，按葯典規定操作。
加果採用 靈敏度0.125EU/ml的鱟試劑 ，就要用BET水稀釋一倍後再進行實驗。

⑤ 內毒素的檢測方法和原理

本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素 以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法
細菌內毒素檢查包括濁度法和顯色基質法 供試品檢測時 可使用其中任何一種方法進行試驗 當測定結果有爭議的時候 除另有規定外 以凝膠法結果為准
本實驗操作過程硬防止微生物和內毒素的污染
凝膠法鱟試劑原理 鱟試劑為鱟科動物東方鱟變形細胞溶解物的冷凍乾燥品 內含能被微量細菌內毒素激活的凝膠酶原和凝固蛋白源 在適宜的條件下（溫度、pH值及無干擾物質）細菌內毒素能激活鱟試劑中的凝固酶原 使鱟試劑產生凝集反應形成凝膠 凝膠法鱟試劑是根據凝集反應所形成凝膠的堅實程度來限量檢測細菌內毒素

⑥ 內毒素檢測原理是什麼

內毒素測定方法有：
凝膠法
動態濁度法
終點濁度法
動態顯色法
終點顯色法
凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來定性檢測或半定量內毒素的方法。凝膠法鱟試劑常見規格為0.1ml/支或0.5ml/支或者更大裝量，使用時應加除熱原水（細菌內毒素檢查用水）復溶後使用。凝膠法是通過觀察有無凝膠形成作為反應的終點。此法操作比較簡單，經濟，不需要專用測定設備，可以進行定性或半定量測定。
動態濁度法、終點濁度法、動態顯色法、終點顯色法，這四種方法都是定量檢測內毒素的。
根據檢測原理，終點濁度法和動態濁度法都屬於濁度法。濁度法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。終點濁度法未見商品化產品。動態濁度法（又稱動態比濁法）是檢測反應混合物的濁度上升某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。
終點顯色法和動態顯色法都是屬於顯色基質法。顯色基質法系利用鱟試劑與內毒素反應過程中產生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團的多少而測定內毒素含量的方法，根據產物顏色判斷內毒素濃度，又稱為比色法。廈門鱟試劑廠於2005年推出以鱟四肽為顯色底物的鱟試劑盒，抗干擾能力強,
靈敏度高達0.005eu/ml,
質量達到國際領先水平。目前已有500多家單位使用該試劑盒，並有部分單位發表相應文獻。國內有少量國外產品，但價格遠高於國產試劑，到貨周期長。
如果您僅需要檢測樣品的內毒素限量，可以選擇凝膠法鱟試劑，通過確定內毒素限值及最大有效稀釋倍數，做樣品的干擾試驗從而確定使用的鱟試劑的靈敏度。
如果您需要定量測定樣品中內毒素含量則應選擇顯色基質鱟試劑盒或動態濁度法鱟試劑。
動態濁度法與動態顯色法需要帶溫育系統的動態光度測定儀器及配套軟體，例如，微板鱟試儀elx808及軟體talgent
或gen5。動態濁度法與動態顯色法簡單方便、一步即成，線性范圍寬。
終點顯色法需要配套酶標儀或可見分光光度計進行檢測。配套帶有溫育系統的酶標儀，如微板鱟試儀elx808，可減少試劑用量。

⑦ 簡述快速檢測食品和葯品中可能存在的內毒素的方法和步驟

食品不用測內毒素，自然界中大量存在內毒素，通過食物進入人體並不影響人體健康，只有注射等方式進入人體血液的內毒素對人體有害，所以要檢測注射類葯品（注射液，疫苗等）的內毒素。測內毒素用鱟試劑，看要定量還是定性。廈門鱟試劑廠有定性和定量的鱟試劑可以檢測內毒素，包括濁度法的。