酶蛋白檢測試驗方法

A. 蛋白的常用蛋白鑒定方法

傳統的蛋白鑒定方法，如免疫印跡法、內肽的化學測序、已知或未知蛋白comigration分析，或者在一個有機體中有意義的基因的過表達通常耗時、耗力，不適合高流通量的篩選。目前，所選用的技術包括對於蛋白鑒定的圖象分析、微量測序、進一步對肽片段進行鑒定的氨基酸組分分析和與質譜相關的技術。 「滿天星」式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺，每一個圖象上斑點的上調、下調及出現、消失，都可能在生理和病理狀態下產生，必須依靠計算機為基礎的數據處理，進行定量分析。在一系列高質量的2-DE凝膠產生(低背景染色，高度的重復性)的前提下，圖象分析包括斑點檢測、背景消減、斑點配比和資料庫構建。
首先，採集圖象通常所用的系統是電荷耦合CCD(charge coupled device)照相機;激光密度儀(laser densitometers)和Phospho或Fluoro imagers，對圖象進行數字化。並成為以象素(pixels)為基礎的空間和網格。
其次，在圖象灰度水平上過濾和變形，進行圖象加工，以進行斑點檢測。利用Laplacian，Gaussian，DOG(difference of Gaussians) opreator使有意義的區域與背景分離，精確限定斑點的強度、面積、周長和方向。
圖象分析檢測的斑點須與肉眼觀測的斑點一致。在這一原則下，多數系統以控制斑點的重心或最高峰來分析，邊緣檢測的軟體可精確描述斑點外觀，並進行邊緣檢測和鄰近分析，以增加精確度。通過閾值分析、邊緣檢測、銷蝕和擴大斑點檢測的基本工具還可恢復共遷移的斑點邊界。以PC機為基礎的軟體Phoretix-2D正挑戰古老的Unix為基礎的2-D分析軟體包。
第三，一旦2-DE圖象上的斑點被檢測，許多圖象需要分析比較、增加、消減或均值化。由於在2-DE中出現100%的重復性是很困難的，由此凝膠間的蛋白質的配比對於圖象分析系統是一個挑戰。IPG技術的出現已使斑點配比變得容易。因此，較大程度的相似性可通過斑點配比向量演算法在長度和平行度觀測。用來配比的著名軟體系統包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，計算機方法如相似性、聚類分析、等級分類和主要因素分析已被採用，而神經網路、子波變換和實用分析在未來可被採用。配比通常由一個人操作，其手工設定大約50個突出的斑點作為「路標」，進行交叉配比。之後，擴展至整個膠。
例如：精確的PI和MW(分子量)的估計通過參考圖上20個或更多的已知蛋白所組成的標准曲線來計算未知蛋白的PI和MW。 在凝膠圖象分析系統依據已知蛋白質的pI值產生PI網路，使得凝膠上其它蛋白的PI按此分配。所估計的精確度大大依賴於所建網格的結構及標本的類型。已知的未被修飾的大蛋白應該作為標志，變性的修飾的蛋白的PI估計約在±0。25個單位。 同理，已知蛋白的理論分子量可以從資料庫中計算，利用產生的表觀分子量的網格來估計蛋白的分子量。 未被修飾的小蛋白的錯誤率大約30%，而翻譯後蛋白的出入更大。 故需聯合其他的技術完成鑒定。 蛋白質的微量測序已成為蛋白質分析和鑒定的基石，可以提供足夠的信息。盡管氨基酸組分分析和肽質指紋譜(PMF)可鑒定由2-DE分離的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是進行鑒定的主要技術。目前已實現蛋白質微量測序的自動化。 首先使經凝膠分離的蛋白質直接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上，染色、切割，然後直接置於測序儀中，可用於subpicomole水平的蛋白質的鑒定。 但有幾點需注意：Edman降解很緩慢，序列以每40 min 1個氨基酸的速率產生;與質譜相比，Edman降解消耗大;試劑昂貴，每個氨基酸花費3～4$。 這都說明泛化的Edman降解蛋白質不適合分析成百上千的蛋白質。然而，如果在一個凝膠上僅有幾個有意義的蛋白質，或者如果其他技術無法測定而克隆其基因是必需的，則需要進行泛化的Edman降解測序。
近來，應用自動化的Edman降解可產生短的N-末端序列標簽，這是將質譜的序列標簽概念用於Edman降解，業已成為一種強有力的蛋白質鑒定。當對Edman的硬體進行簡單改進，以迅速產生N-末端序列標簽達10～20個/d，序列檢簽將適於在較小的蛋白質組中進行鑒定。若聯合其他的蛋白質屬性，如氨基酸組分分析、肽質質量、表現蛋白質分子量、等電點，可以更加可信地鑒定蛋白質。選擇BLAST程序，可與資料庫相配比。目前，採用一種Tagldent的檢索程序，還可以進行種間比較鑒定，又提高了其在蛋白質組研究中的作用。 質譜已成為連接蛋白質與基因的重要技術，開啟了大規模自動化的蛋白質鑒定之門。用來分析蛋白質或多肽的質譜有兩個主要的部分，(1)樣品入機的離子源，(2)測量被介入離子的分子量的裝置。
首先是基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)為一脈沖式的離子化技術。它從固相標本中產生離子，並在飛行管中測其分子量。
其次是電噴霧質譜(ESI-MS)，是一連續離子化的方法，從液相中產生離子，聯合四極質譜或在飛行時間檢測器中測其分子量。
在MALDI-TOF中，最重要的進步是離子反射器(ion reflectron)和延遲提取(delayed ion extraction)，可達相當精確的分子量。在ESI-MS中，納米級電霧源(nano-electrospray source)的出現使得微升級的樣品在30～40 min內分析成為可能。
將反相液相色譜和串聯質譜(tandem MS)聯用，可在數十個picomole的水平檢測;若利用毛細管色譜與串聯質譜聯用，則可在低picomole到高femtomole水平檢測;當利用毛細管電泳與串聯質譜連用時，可在小於femtomole的水平檢測。甚至可在attomole水平進行。目前多為酶解、液相色譜分離、串聯質譜及計算機演算法的聯合應用鑒定蛋白質。下面以肽質指紋術和肽片段的測序來說明怎樣通過質譜來鑒定蛋白質。
(1)肽質指紋術
由Henzel等人於1993年提出。用酶(最常用的是胰酶)對由2-DE分離的蛋白在膠上或在膜上於精氨酸或賴氨酸的C-末端處進行斷裂，斷裂所產生的精確的分子量通過質譜來測量(MALDI-TOF-MS，或為ESI-MS)，這一技術能夠完成的肽質量可精確到0。1個分子量單位。所有的肽質量最後與資料庫中理論肽質量相配比(理論肽是由實驗所用的酶來「斷裂」蛋白所產生的)。配比的結果是按照資料庫中肽片段與未知蛋白共有的肽片段數目作一排行榜，「冠軍」肽片段可能代表一個未知蛋白。若冠亞軍之間的肽片段存在較大差異，且這個蛋白可與實驗所示的肽片段覆蓋良好，則說明正確鑒定的可能性較大。
(2)肽片段的部分測序
肽質指紋術對其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白質。為進一步鑒定蛋白質，出現了一系列的質譜方法用來描述肽片段。用酶或化學方法從N-或C-末端按順序除去氨基酸，形成梯形肽片段(ladder peptide)。
首先以一種可控制的化學模式從N-末端降解，可產生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定數目的肽質量由MALDI-TOF-MS測量。另一種方法涉及羧基肽酶的應用，從C-末端除去不同數目的氨基酸形成肽片段。化學法和酶法可產生相對較長的序列，其分子量精確至以區別賴氨酸和谷氨醯胺。或者，在質譜儀內應用源後衰變(post-source decay，PSD)和碰撞誘導解離(collision-inced dissociation，CID)，目的是產生包含有僅異於一個氨基酸殘基質量的一系列肽峰的質譜。因此，允許推斷肽片段序列。 肽片段PSD的分析在MALDI反應器上能產生部分序列信息。首先進行肽質指紋鑒定。 之後，一個有意義的肽片段在實驗儀器質譜儀被選作「母離子」，在飛行至離子反應器的過程中降解為「子離子」。在反應器中，用逐漸降低的電壓可測量至檢測器的不同大小的片段。但經常產生不完全的片段。現在用肽片段來測序的方法始於70年代末的CID，可以一個三聯四極質譜ESI-MS或MALDI-TOF-MS聯合碰撞器內來完成。在ESI-MS中，由電霧源產生的肽離子在質譜儀的第一個四極質譜中測量，有意義的肽片段被送至第二個四極質譜中，惰性氣體轟擊使其成為碎片，所得產物在第三個四極質譜中測量。與MALDI-PSD相比，CID穩定、強健、普遍，肽離子片段基本沿著醯胺鍵的主架被轟擊產生梯形序列。 連續的片段間差異決定此序列在那一點的氨基酸的質量。由此，序列可被推測。由CID圖譜還可獲得的幾個序列的殘基，叫做「肽序列標簽」。這樣，聯合肽片段母離子的分子量和肽片段距N- C端的距離將足以鑒定一個蛋白質。 1977年首次作為鑒定蛋白質的一種工具，是一種獨特的「腳印」技術。利用蛋白質異質性的氨基酸組分特徵，成為一種獨立於序列的屬性，不同於肽質量或序列標簽。Latter首次表明氨基酸組分的數據能用於從2-DE凝膠上鑒定蛋白質。 通過放射標記的氨基酸來測定蛋白質的組分，或者將蛋白質印跡到PVDF膜上，在155℃進行酸性水解1 h，通過這一簡單步驟的氨基酸的提取，每一樣品的氨基酸在40min內自動衍生並由色譜分離，常規分析為100個蛋白質/周。依據代表兩組分間數目差異的分數，對資料庫中的蛋白質進行排榜，「冠軍」蛋白質具有與未知蛋白質最相近的組分，考慮冠亞軍蛋白質分數之間的差異，僅處於冠軍的蛋白質的可信度大。Internet上存在多個程序可用於氨基酸組分分析，如AACompIdent，ASA，FINDER，AAC-PI，PROP-SEARCH等，其中，在PROP-SEARCH中，組分、序列和氨基酸的位置被用來檢索同源蛋白質。 但仍存在一些缺點，如由於不足的酸性水解或者部分降解會產生氨基酸的變異。故應聯合其他的蛋白質屬性進行鑒定。

B. 蛋白濃度測定的方法具體有哪些

蛋白濃度測定的方法：

1. 紫外分光光度法

紫外光譜吸收法測定蛋白質含量是講蛋白質溶液直接在紫外分光光度計中測定的方法，不需要任何試劑，操作簡單且易回收。蛋白質溶液在280nm附近有強烈的吸收，這是由於蛋白質中酪氨酸、色氨酸殘基而引起的，所以光密度受這兩種氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取過程中雜有的核酸對測定結果引起極大誤差，其最大吸收在260nm。所以同時測定280及260nm兩種波長的吸光度，通過計算可得較為正確的蛋白質含量。

2. 雙縮脲法

利用半飽和硫酸銨或27.8％硫酸鈉——亞硫酸鈉可使血清球蛋白沉澱下來，而此時血清白蛋白仍處於溶解狀態，因此可把兩者分開，這種利用不同濃度的中性鹽分離蛋白的方法稱為鹽方法。鹽析分離蛋白質的方法不僅用於臨床醫學，而且還廣泛地用於生物化學研究工作中，如一些特殊蛋白質—酶、蛋白激素等的分離和純化。

蛋白質和雙縮脲一樣，在鹼性溶液中能與銅離子形成紫色絡合物（雙縮脲反應），且其呈色深淺與蛋白質的含量成正比，因此可於蛋白質的定量測定。

但必須注意，此反應並非蛋白質所特有，凡分子內有兩個或兩個以上的肽鍵的化合物以及分子內有—CH2—NH2等結構化合物，雙縮脲反應也呈陽性。本實驗用27.8％硫酸鈉—亞硫酸鈉溶液稀釋血清，取出一部分用雙縮脲反應測定蛋白質的含量，剩餘部分則用濾紙過濾，使析出的球蛋白與白蛋白分離，取出濾液用同一反應測定白蛋白的含量。總蛋白與白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白與球蛋白之比即所謂的白／球比值。

3. Folin-酚試劑法

目前實驗室較多用Folin-酚法測定蛋白質含量，此法的特點是靈敏度高，較雙縮脲高兩個數量級，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應約在15分鍾有最大顯色，並最少可穩定幾個小時，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類的物質都會影響測定結果的准確性。其原理是蛋白質中含有酚基的酪氨酸，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產生蘭色化合物，顏色深淺與蛋白含量成正比。

4. 考馬氏亮藍G-250

此方法是1976年Bradform建立。染料結合法測定蛋白質的優點是靈敏度較高，可檢測到微量蛋白，操作簡便、快迅，試劑配製極簡單，重復性好，但干擾因素多。考馬氏亮藍G－250具有紅色和青色兩種色調、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當它通過疏水作用與蛋白質結合後，變成藍色，最大吸收波長從465nm轉移到595nm處，在一定的范圍內，蛋白質含量與 595nm的吸光度成正比，測定595nm處光密度值的增加即可進行蛋白質的定量。

以上便是實驗室中常見的幾種蛋白濃度測定的方法，另外還有凱氏定氮法和BCA法，有凱氏定氮法結果最精確，但操作復雜，BCA法又以其試劑穩定，抗干擾能力較強，結果穩定，靈敏度高而受到歡迎。

C. 目前蛋白質的精確定量檢測方法都有哪些

蛋白質鑒定是指對復配類蛋白品通過前處理提純並通過生物質譜鑒定蛋白種類及含量（包括具體的分子量、定性、定量結果）或對純蛋白品通過生物質譜鑒定具體的蛋白類型（包括具體的分子量、定性、定量結果）。
蛋白質種類鑒定業務范圍：

水溶性蛋白、水解酶、蛋白酶、脂肪酶； 血清蛋白（白蛋白和球蛋白）、牛血清（白）蛋白、血清球蛋白； 乳清蛋白、復合蛋白質、乳清蛋白粉、β-乳球蛋白，α-乳白蛋白，免疫球蛋白，乳鐵蛋白； 大豆分離蛋白、小麥蛋白（谷朊粉）、酪蛋白、纖維素酶、β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶、糖化酶； 鹼性蛋白酶、果膠酶、聚半乳糖醛酸水解酶、脂肪酶、過氧化氫酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、超氧化物歧化酶、彈性蛋白酶。 動物飼料，大米，油料種子、谷類食品、谷類，大豆、玉米、魚肉、果汁等各種食物中蛋白種類及含量。

D. 求助：蛋白酶酶活的測定方法

酶活測定方法 還原法
酶與底物在特定的條件下反應,酶可以促使底物釋放出還原性的基團。在此反應體系中添加化學試劑 ,酶促反應的產物可與該化學試劑發生反應,生成有色物質。通過在特定的波長下 比色 ,即可求 出還原產物的含量 ,從而計算出酶活力的大小 。
色原底物法
通過底物與特定的可溶性生色基團物質結合,合成人工底物。該底物與酶發生反應後 ,生色基團可被釋放出來 ,用分光光度法即可測定顏色的深淺,在與已知標准酶所做的曲線比較後 ,即可求出待測酶的活力。 粘度法
該法常用於測定纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情況下可形成極高的粘度,當酶作用於粘性底物時木聚糖和β-葡聚糖會被切割成較小的分子使其粘度大 為降低。基 於Poiseuille定律我們知道 ,只要測定一定條件下溶劑和樣品溶液的運動粘度,便可計算特性粘數,並以此來判斷酶的活力。
高壓液相色譜法
酶與其底物在特定的條件下充分反應後 ,在一定的色譜條件下從反應體系中提取溶液進行色譜分析,認真記錄保留時間和色譜圖,測量各個樣的峰高和半峰高,計算出酶促反應生成物的含量 ,從而換算出酶活力的數值。
免疫學方法
常用 於酶活性分析的免疫學方法包括:免疫電泳法 、免疫凝膠擴散法。這兩種方法都是根據酶與其抗體之間可發生特定的沉澱反應 ,通過待測酶和標准酶的比較,最終確定酶活力。免疫學方法檢側度非常靈敏,可檢側出經過極度稀釋後樣品中的酶蛋白,但其缺點是不同廠家生產的酶產品需要有不同特定的抗體發生反應。
瓊脂凝膠擴散法
將酶作用的底物與瓊脂混合熔融後 ,倒入培養皿中或載波片上製成瓊脂平板。用打孔器在瓊脂平面上打出一個約4-5mm半徑 的小孔。在點加酶樣並培養24h以後 ,用染色劑顯色或用展開劑展開顯出水解區,利用水解直徑和酶活力關系測定酶活力。

E. 一般採用什麼方法檢驗蛋白質即鑒定

一般用雙縮脲試劑鑒定，雙縮脲試劑可以和蛋白質發生紫色反應。

F. 測定蛋白質分子量的常用方法

蛋白定量的測試方法有很多種，其中較為常見的有五種，分別是Bradford法、Bradford斑點試驗、Coomassie 斑點試驗、紫外分光度檢測法及BCA法這五種。

在生化實驗中，對樣品中的蛋白質進行准確可靠的定量分析，是經常進行的一項非常重要的工作。蛋白質是一種十分重要的生物大分子，它的種類很多，結構不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個理想而又通用的蛋白質定量分析的方法帶來了許多具體的因難。

(6)酶蛋白檢測試驗方法擴展閱讀

蛋白定量分析也就涉及到生產科研的多個領域及行業，也是生物學科、食品檢驗及摻假摻偽、臨床檢驗、診斷疾病和質量檢驗中最常見的方法。

蛋白定量是生物學實驗不可缺少的一部分。為驗證細胞裂解是否成功，或為了將多個樣品進行平行實驗比較或標准化保存，需對細胞裂解液進行蛋白定量。

為了判定蛋白的產量，需對純化好的蛋白進行定量。為了將純化好的蛋白用生物素或者報告酶進行標記，同樣需首先對蛋白樣品進行定量，以保證標記反應在適當的化學濃度下進行。

G. 酶活性中心的測定方法

測定酶活性中心組成和結構是研究酶催化作用的重要課題。目前常用方法有：化學修飾法、反應動力學法、X－射線衍射法等。
1.化學修飾法：此方法是研究最早，應用最廣泛的方法。原則上講，酶分子側鏈上的各種基團，如羧基、羥基、巰基和咪唑基等均可由特定的化學試劑進行共價修飾。當它被某一化學試劑修飾後，若酶活性顯著下降或喪失，則可初步推斷該基團為酶的必需基團。
2.動力學分析法：酶蛋白是含有許多解離基團的兩性電解質，pH改變必然影響到解離基團的解離狀態，處於活性中心基團的解離狀態的改變必然影響到酶的活性。因此，通過研究酶活性與pH關系，可以推測到與催化直接相關的某些基團的pK值，進而推測這些基團的作用。另外，改變反應溫度求出Vmax和Km與pH關系，從而求出有關基因解離的DH，DH的求得有助於補充pK值對活性中心的判斷。在有機溶劑存在條件下，測定酶pK值與介電常數的關系，也有助於對活性部位的判斷。
3.X－射線衍射分析法：化學修飾法和動力學分析只能推斷酶活性部位氨基酸殘基的數目，活性中心空間結構的信息，則需用X－射線衍射法。採用X射線衍射法在研究酶活性中心空間構象時，通常是將酶與底物類似物或專一性抑制劑形成復合物，而後作X－射線衍射分析，從而得到有關酶活性中心構象、酶與底物的接觸狀況以及催化機理的信息。
4.蛋白質工程：蛋白質工程是近年來發展的研究酶必需基團和活性中心的最先進的方法。蛋白質工程實質是按照人們的設想，通過改變基因來改變蛋白質的結構，製造新的蛋白質。利用基因定點突變技術將酶相應的互補DNA（cDNA）基因定點突變，突變的cDNA表達出被一個或幾個氨基酸置換的酶蛋白，再測定其活性就可以知道被置換的氨基酸是否為酶活性所必需。此方法可改變酶蛋白中任一氨基酸而不影響其他同類殘基和不引起底物和活性中心結合的立體障礙，以及可人工地造成一個或幾個氨基酸的缺失或插入，了解肽鏈的縮短或延長對酶活性的影響和定點改變酶蛋白的糖基化位點或磷酸化位點，從而了解糖基化或磷酸化對酶結構和功能的影響。

H. 測定鹼性蛋白酶活有哪些方法

鹼性蛋白酶酶活力檢測方法

酶活力是指酶催化某些化學反應的能力。酶活力的大小可以用在一定條件下它所催化的某一化學反應的速度來表示。測定酶活力實際就是測定被酶所催化的化學反應的速度。酶促反應的速度可以用單位時間內反應底物的減少量或產物的增加量來表示，為了靈敏起見，通常是測定單位時間內產物的生成量。由於酶促反應速度可隨時間的推移而逐漸降低其增加值，所以，為了正確測得酶活力，就必須測定酶促反應的初速度。

鹼性蛋白酶酶活測定原理 福林法原理

鹼性蛋白酶在鹼性條件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸為含有酚羥基的氨基酸，可與福林試劑（Folin)（磷鎢酸與磷鉬酸的混合物）發生福林酚反應。（福林酚反應：福林試劑在鹼性條件下極其不穩定，容易定量地被酚類化合物還原，生成鎢藍和鉬藍的混合物，而呈現出不同深淺的藍色。）利用比色法即可測定酪氨酸的生成量，用鹼性蛋白酶在單位時間內水解酪蛋白產生的酪氨酸的量來表示酶活力，以此計算其酶活力。

酶活力測定實驗步驟

酶液制備：精確稱取干酶粉1g（±0.001），加入10mL緩沖液（2.2.5），在小燒杯中溶解，並用玻璃棒攪拌，靜置片刻後，將上層液小心傾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量緩沖液，如此反復攪拌溶解4次，最後全部移入100mL容量瓶中。用緩沖液定容至刻度，充分搖勻，用四層紗布過濾。吸取濾液5mL，移入100mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，所得液位稀釋2000倍的酶液。（稀釋倍數具體要看待測酶樣品的酶活）

酶活定義

鹼性蛋白酶活力單位的定義：1克鹼性蛋白酶粉在pH10，40℃的條件下，每分鍾水解酪蛋白能產生1微克酪氨酸，定為一個酶活力單位。

酶活力測定注意事項

1、酶反應的溫度、pH和時間對被水解的肽鍵數量有直接的影響，因此必須嚴格控制。

2、用三氯醋酸終止反應後，過濾反應混合物所得的濾液必須是澄清的。

3、因為Folin試劑對酸性環境比較敏感，容易發生變化，因此在測定時有順序的規定，需要先加入碳酸鈉溶液形成一個鹼性環境，之後再加入Folin試劑，使其能正常發揮作用

I. 酶聯免疫檢測的幾種方法及其原理

（1）酶聯免疫吸附試驗（enzyme
linked
immunosorbent
assay,ELISA）：是將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。
（2）夾心法（sandwich
assay）:將已知的特異抗體包裝在固相載體（塑料板凹孔或紙片上），加入待檢標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結合，洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結合的酶標抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。
間接法（indirecr
ELISA）常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標本（可能含有相應抗體），再加入酶標抗Ig的抗全（即第二抗體），經加底物顯色後，根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。
（3）BAS-ELISA：近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素（avidin）分子可以結合4個生物素分子（biotin）。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合，而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統（biotinavidin
system-
ELISA,BAS-ELISA），它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統，同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。

J. 酶的特異性鑒定試驗

【實驗目的】

1、了解酶的特異性

2、掌握檢查酶特異性的方法及原理

【實驗原理】

酶是生物體內一類具有催化功能的蛋白質（傳統酶的概念），即生物催化劑。它與一般催化劑的最主要區別就是具有高度的特異性（專一性）。

所謂特異性是指酶對所作用的底物有嚴格的選擇性，即一種酶只能對一種化合物或一類化合物（其結構中具有相同的化學鍵）起一定的催化作用，而不能對別的物質起催化作用。酶的特異性是酶的特徵之一，但各種酶所表現的特異性在程度上有很大差別，又可分為結構特異性和立體異構特異性。

澱粉和蔗糖都是非還原性糖，分別為唾液澱粉酶和蔗糖酶的專一底物。唾液澱粉酶可水解澱粉生成具有還原性的麥芽糖，但不能水解蔗糖；蔗糖酶可水解蔗糖生成具有還原性的葡萄糖和果糖，但不能水解澱粉。

Benedict試劑是含硫酸銅和檸檬酸鈉的碳酸鈉溶液，可以將還原糖氧化成相應的化合物，同時 Cu2+被還原成Cu+，即藍色硫酸銅溶液被還原產生磚紅色的氧化亞銅沉澱。因此，可用Benedict試劑檢查兩種酶水解各自的底物所生成產物的還原性，來加深對酶特異性的理解。

【器材及試劑】

1、儀器：

（1）研缽 ；

（2）試管：6 支；

（3）試管架；

（4）小燒杯；

（5）刻度吸管：1毫升×5，2毫升×1 ；

（6）漏斗；

（7）電熱恆溫水浴。

2、試劑：

（1）1% 澱粉溶液（含0.3%NaCl）：將1克可溶性澱粉及0.3克氯化鈉，混懸於5毫升蒸餾水中，攪動後緩慢倒入沸騰的60毫升蒸餾水中，攪動煮沸1分鍾。晾至室溫後加水至100毫升，放置於冰箱貯存。

（2）2% 蔗糖溶液：蔗糖是典型的非還原糖，若商品蔗糖中還原糖含量超過一定標准，則呈還原性，這種蔗糖不能使用。所以，實驗前必須進行檢查。本實驗用的蔗糖至少應是分析純的試劑，要現用現配。

（3）澱粉酶液：稀釋200倍的新鮮唾液。

（4）蔗糖酶液：取1克新鮮酵母放入研缽中，加少量石英砂和蒸餾水，研磨10分鍾左右，用蒸餾水稀釋至50毫升，靜止片刻再過濾，濾液即為蔗糖酶提取液。

（5）本乃狄（Benedict）試劑：將17.3克硫酸銅溶解於100毫升蒸餾水中。冷卻後稀釋至150毫升。取檸檬酸鈉173克及碳酸鈉（Na2CO3·H2O）100克，加水600毫升，加熱使之溶解，冷卻後，稀釋至850毫升。最後把硫酸銅溶液緩緩傾入檸檬酸鈉-碳酸鈉溶液中，邊加邊攪拌，如有沉澱可停止。

【操作步驟】

取6支試管編號，按下表操作：

酶的反應特點：

1、高效性：酶的催化效率比無機催化劑更高，使得反應速率更快；

2、專一性：一種酶只能催化一種或一類底物，如蛋白酶只能催化蛋白質水解成多肽；

3、多樣性：酶的種類很多，迄今為止已發現約4000多種酶，在生物體中的酶遠遠大於這個數量；

4、溫和性：是指酶所催化的化學反應一般是在較溫和的條件下進行的；

5、活性可調節性：包括抑制劑和激活劑調節、反饋抑制調節、共價修飾調節和變構調節等；

6、易變性：大多數酶是蛋白質，因而會被高溫、強酸、強鹼等破壞；

7、有些酶的催化性與輔助因子有關；

8、改變化學反應速率，本身幾乎不被消耗；

9、只催化已存在的化學反應；

10、能加快化學反應的速度，但酶不能改變化學反應的平衡點，也就是說酶在促進正向反應的同時也以相同的比例促進逆向的反應，所以酶的作用是縮短了到達平衡所需的時間，但平衡常數不變；

11、降低活化能，使化學反應速率加快；

12、與無機催化劑一樣，也會出現中毒現象。