elisa檢測細胞的方法與步驟

1. ELISA檢測試劑盒的基本操作步驟有哪些

ELISA檢測試劑盒的基本操作步驟可分為以下核心環節，每個步驟均需嚴格遵循規范以確保檢測准確性：

一、試劑與樣本准備

• 樣本處理

• 血清/血漿：血液需室溫靜置2小時或4℃過夜析出血清，30分鍾內離心（血清2000×g 20分鍾，血漿1000×g 15分鍾），分裝後-20℃/-80℃保存，避免反復凍融。

• 細胞培養上清/裂解液：離心去除細胞碎片，裂解液需超聲或反復凍融破碎細胞後取上清。

• 組織勻漿：預冷PBS沖洗組織，機械勻漿後離心取上清。

• 注意事項：避免使用NaN₃（抑制HRP活性），溶血樣本需棄用。

• 試劑平衡
  所有試劑需提前30分鍾恢復至室溫（約25℃），避免溫度差異影響反應速率。

、實驗核心步驟

1. 包被與封閉（若試劑盒未預包被）

• 包被：將抗原/抗體以5μg/ml濃度溶於碳酸鹽緩沖液（pH 9.6），加入酶標板孔（100μL/孔），4℃過夜或37℃孵育2小時。

• 封閉：加入含1% BSA或5%脫脂奶粉的封閉液（200μL/孔），37℃孵育1小時，防止非特異性吸附。

2. 加樣與孵育

• 加樣規范：

• 使用校準後的微量加樣器，45°角貼壁加入樣本/標准品（50-100μL/孔），避免氣泡或液體濺出。

• 樣本需按梯度稀釋，復孔加樣量≥100μL/指標，每加一種試劑需更換吸頭防止交叉污染。

• 孵育條件：

• 溫度：通常為37℃，多板操作時避免疊加放置以減少邊緣效應。

• 時間：一抗孵育1-2小時，二抗孵育30-60分鍾，具體依試劑盒說明調整。

3. 洗滌

• 方法：甩去孔內液體後，注入洗滌液（PBST或含Tween-20的緩沖液）至滿孔，浸泡30秒後拍干，重復3-5次。

• 關鍵點：洗滌不徹底會導致高背景，過度洗滌可能損失結合物，需平衡次數與強度。

4. 酶標抗體結合

加入HRP或AP標記的二抗（100μL/孔），37℃孵育30-60分鍾，再次洗滌去除未結合酶標物。

5. 顯色反應

• 底物選擇：HRP常用TMB（顯藍色），AP常用PNPP（顯黃色），避光條件下加入（100μL/孔）。

• 顯色控制：室溫避光反應10-30分鍾，密切觀察標准孔梯度，顯色過深時提前終止。

6. 終止反應

每孔加入50μL終止液（如2M H₂SO₄），立即搖勻使顏色穩定（藍色轉黃色），15分鍾內完成讀數。

三、結果分析

• 讀數：使用酶標儀在450nm（TMB）或405nm（PNPP）波長讀取OD值，雙波長檢測可減少孔間干擾。

• 標准曲線繪制：以標准品濃度為橫坐標、OD值為縱坐標，採用四參數邏輯（4PL）模型擬合曲線。

• 濃度計算：樣本OD值代入標准曲線方程，乘以稀釋倍數獲得實際濃度。若OD值超出線性范圍，需調整樣本稀釋度復測。

  四、常見問題與優化策略

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  五、關鍵注意事項

• 全程防污染：使用無菌耗材，操作台定期消毒，避免樣本間交叉污染。

• 溫度一致性：孵育時使用預熱的濕盒或恆溫搖床，減少孔間溫差。

• 設備校準：酶標儀每年校準一次，移液器每月驗證精度。

• 數據記錄：詳細記錄試劑批號、操作時間及環境溫濕度，便於追溯異常結果。

通過上述步驟的精細化控制，可顯著提高ELISA檢測的重復性與准確性，滿足臨床診斷與科研需求。實際操作中需以試劑盒說明書為准，結合預實驗優化條件。