规模化培养细菌常用什么方法

1. 细菌分离培养的基本要领和常用方法有哪些

一、基本要领

菌种分离主要在培养皿上进行，常用的方法是稀释法和划线法。

菌种分离的目的是是微生物的一个个体通过繁殖，在固体培养基上长出肉眼能见的群体，然后根据培养特征，用接种针调取所需菌种并在显微镜下检查，证明为单一形状的菌体。

改变培养基条件也有助于菌种分离。没有一种培养基或一种培养条件能够满足一切微生物生长的需要，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。

如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计特定环境使之适合这种微生物的生长，因而能够从混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。

二、方法

1、稀释倒平板法

首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。

如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。

2、涂布平板法

因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。

其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。

3、平板划线法

最简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。

有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

4、 稀释摇管法

用固体培养基分离严格厌氧菌有特殊性，如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。

对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式。

先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。

培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡--石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。

(1)规模化培养细菌常用什么方法扩展阅读

在以上介绍的几种方法中，平板分离法普遍用于实验室微生物的分离与纯化，稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。

一般情况下可以通过适当改善培养基的条件来培养特点菌种。

如为了得到嗜热微生物，可在50℃~60℃下进行培养。有时投加相应的抑制剂也能提高菌种分离效果，如在土壤样品的悬浮液中投加10%的苯酚数滴，可以抑制霉菌和细菌的生长，而有利于放线菌的分离。在培养基中投加一定量的青霉素或链霉素能抑制细菌的生长，而有利于霉菌的分离。

2. 培养细菌和真菌的一般方法及各方法的目的

细菌、真菌培养的一般方法：首先要配制含有营养物质的培养基，可以用牛肉汁加琼脂熬制，然后把培养基和所有用具进行高温灭菌，以防杂菌对实验的干扰，为防止高温杀死细菌、真菌，要等冷却后，在进行接种，接种后放在温暖的地方进行恒温培养．注意：定期观察并详细记录实验现象．故细菌、真菌培养的一般方法：（1）配置培养基一（2）高温灭菌一（3）接种一（4）培养．
故答案为：（1）配置培养基；
（2）高温灭菌；以防杂菌对实验的干扰；
（3）接种培养
（4）培养

3. 细菌培养一般使用什么样的方法

细菌分离培养的方法有哪些如果是液体培养基，那分离起来就比较困难，要用到专门的冻干设备，还要加很多柔和的保护性物质。 所以在一般的情况下最好的办法是把细菌接种到固体培养基上，这样长出来的菌落或菌苔就是你所要分离出的细菌了。原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。

4. 动物细胞大规模培养的方法有哪些

动物细胞大规模培养常用方法
根据动物细胞的类型，可采用贴壁培养、悬浮培养和固定化培养等三种培养方法进行大规模培养。

一、动物细胞生长特性及培养温度
1、细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素
2、细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差
3、需氧少，不耐受强力通风与搅拌
4、群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）
5、培养过程产品分布细胞内外，成本高
6、原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡
依据在体外培养时对生长基质依赖性差异，动物细胞可分为两类：
贴壁依赖型细胞：需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长，大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。
非贴壁依赖型细胞：无需附着于固相表面即可生长，包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化细胞。
培养细胞的最适温度相当于各种细胞或组织取材机体的正常温度。人和哺乳动物细胞培养的最适温度为35~37℃。偏离这一温度，细胞正常的代谢和生长将会受到影响，甚至死亡。总的来说，培养细胞对低温的耐力比高温高。温度不超过39℃时，细胞代谢强度与温度成正比；细胞培养置于39~40℃环境中1h，即受到一定损伤，但仍能恢复；当温度达43℃以上时，许多细胞将死亡。当温度下降到30~20℃时，细胞代谢降低，因而与培养基之间物质交换减少。首先看到的是细胞形态学的改变以及细胞从基质上脱落下来。当培养物恢复到初始的培养温度时，它们原有的形态和代谢也随之恢复到原有水平。

二、贴壁培养（attachment culture）
是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。
1、生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
2、贴壁培养的优点：
容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。
容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。
当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。
同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。
适用于所有类型细胞。
3、贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比
扩大培养比较困难，投资大；
占地面积大；
不能有效监测细胞的生长；
4、细胞贴壁的表面：要求具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷密度；若为有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。
5、贴壁培养系统：主要有转瓶、中空纤维（后面专题介绍）、玻璃珠、微载体系统（后面介绍）等。
转瓶培养系统：培养贴壁依赖型细胞最初采用转瓶系统培养。转瓶培养一般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段，或作为生物反应器接种细胞准备的一条途径。细胞接种在旋转的圆筒形培养器-转瓶中，培养过程中转瓶不断旋转，使细胞交替接触培养液和空气，从而提供较好的传质和传热条件。
转瓶培养具有结构简单，投资少，技术成熟，重复性好，放大只需简单的增加转瓶数量等优点。 但也有其缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受到限制等。 现在使用的转瓶培养系统包括二氧化碳培养箱和转瓶机两类。
反应器贴壁培养 此种培养方式中，细胞贴附于固定的表面生长，不因为搅拌而跟随培养液一起流动，因此比较容易更换培养液，不需要特殊的分离细胞和培养液的设备，可以采用灌流培养获得高细胞密度，能有效地获得一种产品；但扩大规模较难，不能直接监控细胞的生长情况，故多用于制备用量较小、价值高的生物药品。
CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器是常用的贴壁培养式生物反应器，用于细胞贴壁培养时可用篮式搅拌系统和圆盘状载体。此载体是直径6毫米无纺聚酯纤维圆片，具很高表面积与体积比（1200cm2/g），利于获得高细胞密度。篮式搅拌系统和载体培养是目前贴壁细胞培养使用最多方式，用于杂交瘤细胞、Hela细胞、293细胞、CHO细胞及其它细胞培养。此种方式培养细胞，细胞接种后贴壁快。

三、悬浮培养（suspension culture）
是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等；是在微生物发酵的基础上发通起来的。
无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方向。

四、固定化培养（immobilization culture）
是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养。上述两大类细胞都适用，具有细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易于产物分开，有利于产物分离纯化。制备方法很多，包括吸附法、共价贴附法、离子/共价交联法、包埋法、微囊法等。
1、吸附法:用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法（adhesion）。操作操简便、条件温和、是动物细胞固定化中最早研究使用的方法。缺点是：载体的负荷能力低，细胞易脱落。微载体培养和中空纤维培养是该方法的代表，稍后专门介绍。
2、共价贴附法:利用共价键将动物细胞与固相载体结合的固定化方法称为共价贴附法（attachment by covalent bonding）。此法可减少细胞的泄漏，但须引入化学试剂，对细胞活性有影响，且因贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保护。
3、离子/共价交联法:双功能试剂处理细胞悬浮液，会在细胞间形成桥而絮结产生交交联作用，此固定化细胞方法称为离子/共价交联法（cross-linking by covalent bonding）。交联试剂会使一些细胞死亡，也会产生扩散限制。
4、包埋法:将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法称为包埋法（entrapment）。优点是：步骤简便、条件温和、负荷量大、细胞泄漏少，抗机械剪切。缺点是：扩散限制，并非所有细胞都处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内部。一般适用于非贴壁依赖型细胞的固定化，常用载体为多孔凝胶，如琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白。
5、微囊法（microencapsulation）:是用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜；囊内是种微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。微囊直径控制在200-400μm为宜。制备中应注意：
温和、快速、不损伤细胞，尽量在液体和生理条件下操作；
所用试剂和膜材料对细胞无毒害；
膜的孔径可控制，必须使营养物和代谢物自由通过；
膜应有足够机械强度抵抗培养中搅拌。

5. 学校要给细菌培养、复壮、增菌，用中海普通肉汤培养基够实验室使用的吗

给细菌培养、复壮、增菌可以用普通肉汤培养基。
配置方法：
1.将新鲜牛肉（去除结缔组织和脂肪）400g绞碎加水，4℃过夜。
2.加热100℃1h，用数层纱布或滤纸过滤，加水补充至1000ml。
3.再加入蛋白胨10g和NaCl5g，加热熔解，冷至40~50℃，校正pH至7.4~7.6，分装于锥形瓶或试管内，加塞后103.43kPa 20min高压蒸汽灭菌。
4.冷后放阴暗处或4℃备用。
培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。
(1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。
(2)液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。
(3)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。
近年来，在政策的支持下，我国生物制品产业发展势头强劲，资本投入持续增加，在部分产品领域逐渐实现进口替代。作为生物制品的关键原材料，受生物制品产业快速发展的推动，细胞培养基行业规模持续扩大。根据新思界发布的《2021-2025年中国细胞培养基行业市场行情监测及未来发展前景研究报告》，2020年，中国细胞培养基市场规模达到了40亿元以上。但是，中国细胞培养基产品绝大部分依赖进口，对我国生物制品行业的健康发展造成了不利影响。
细胞培养基产品对外依赖度高主要是由于该产品技术壁垒高，国内起步晚，研发经验积累不足，导致产品开发进程缓慢。细胞培养基制备与应用涉及生物、化学、物理、医学等多门学科知识与前沿技术，配方一般包含70-100种不同化学成分（包括糖类、氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、促进生长的因子等），需要通过分析细胞特性和工艺试验确定适合细胞生长的配方组份，往往需要反复、大量的实验论证及科学分析。
且不同应用领域的用户对细胞培养基的配方有着非常强烈的个性化需求，这就导致细胞培养基产品的研发需要投入大量的人力、物力、财力以及时间，因此虽然近年来进入该领域的企业及研究机构数量持续增长，但是实现规模化生产的极少

6. 细菌培养的方法有哪些

根据培养细菌的目的和培养物的特性培养方法分为一般培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法三种。

1、一般培养法：将已接种过的培养基,置37℃培养箱内18－24小时,需氧菌和兼性厌氧菌即可于培养基上生长。少数生长缓慢的细菌，需培养3－7天直至一个月才能生长。

为使培养箱内保持一定湿度，可在其内放置一杯水。培养时间较长的培养基，接种后应将试管口塞棉塞后用石腊凡士林封固，以防培养基干裂。

2、二氧化碳培养法：某些细菌，如牛流产布氏杆菌和胎儿弧菌等需要在含有10％二氧化碳的空气中才能生长，尤其是初代分离培养要求更为严格。将已接种的培养基置于二氧化碳环境中进行培养的方法即二氧化碳培养法，

3、厌氧培养法：常用的厌氧培养方法有厌氧罐法、气袋法及厌氧箱三种。

(6)规模化培养细菌常用什么方法扩展阅读：

培养时应根据细菌种类和目的等选择培养方法、培养基，制定培养条件（温度、pH值、时间，对氧的需求与否等）。

一般操作步骤为先将标本接种于固体培养基上，做分离培养。再进一步对所得单个菌落进行形态、生化及血清学反应鉴定。培养基常用牛肉汤、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、血液等和某些细菌所需的特殊物质配制成液体、半固体、固体等。

一般细菌可在有氧条件下，37℃中放18～24小时生长。厌氧菌则需在无氧环境中放2～3天后生长。个别细菌如结核菌要培养1个月之久。

通过日常管理、检测、检查，了解光合细菌的生长情况，就可以结合当时环境条件的变化进行分析，找出影响光合细菌生长繁殖的原因，采取相应的措施。影响光合细菌生长的原因很多，内因是菌种是否优良，外因是光照、温度、营养、敌害和厌气程度等。

温度、光照和pH值都能影响着光合细菌的生长，而且温度、光照和pH值之间是互相制约的，温度与光照的强弱是对立统一的，所以光合细菌生长的最适条件应是互应的，即温度高，光照应弱；温度低，光照应强。

如果是温度高，光照强，pH值就会迅速升高，培养基产生沉淀，抑制光台细菌的生长；如果温度低，光照弱，光合细菌得不到最佳能源，生长速度也慢。经试验得出光合细菌生长的最适条件是：

①温度15～20℃时，光照30000～50000lx，培养基pH值为7.0；

②温度25～30℃时，光照为3000～5000lx，培养基的pH值为7.0。

7. 简述细菌的人工培养程序并列举常用的人工培养方法

细菌的人工培养程序为:
1、标本(估计菌量少的标本,先增菌培养)
2、根据培养目的,接种于适当的培养基
3、适宜的培养环境,35℃-37℃,18-24h
4、观察细菌的生长情况,选择可疑菌落进行分离、鉴定。

根据对气体的需求,细菌的人工培养方法可分为:
1、需氧培养(需氧菌与兼性厌氧菌):置于空气中即可,适于大多数细菌;
2、厌氧培养(专性厌氧菌):需在无游离氧的环境中培养;
3、二氧化碳培养(少数细菌如脑膜炎奈瑟菌、布鲁菌、空肠弯曲菌等):需在含5%-10%C02环境中培养;4微需氧环境(仅在5%左右的低氧压环境中才能生长的细菌的培养)。

8. 微生物大规模工业生产常用的培养的方法有哪些

深层液体发酵搅拌罐； 固态发酵培养；

9. 微生物的培养方法有哪些

微生物培养法是在人为条件下繁殖微生物的方法。根据微生物的种类以及对养料、温度、氧气、水分、酸碱度等环境条件的要求不同，并联系生产和实验上的具体要求，可有不同的培养方法。可分好气培养法和厌气培养法两类。中海生物技术的培养基一是好气微生物培养法，常用：
①摇床培养法，即将微生物接种于盛有液体培养基的三角瓶后，放在恒温培养室中的摇床上作有节奏的振荡，使空气不断进入培养液中，促其良好生长;
②浅盘培养法，又称表面培养法，在盘内放一浅层培养基，使微生物能够充分接触空气，而有利于生长繁殖，但此法所需空间大，并且容易污染杂菌;
③深层培养法，适用于好气微生物的大规模发酵培养，在大容积的液体培养基中，通入无菌空气，并不断搅拌，可使微生物充分接触空气，迅速繁殖并积累代谢产物。二是厌气微生物培养法，实验室常用化学还原剂或抽气机吸除培养基中的分子氧，也有用静止状态的深层培养法。在生产中常用密封式发酵罐或不通风的固体发酵法。