酶提取常用的方法

A. 常用酶的提取方法有哪些并解释提取机理

血中DNA的提取血液中DNA提取的原理：如果以外周血为DNA提取材料,在外周血中提取DNA就是从有核的白细胞中提取DNA.因此,从外周血中提取DNA包括以下几个关键步骤：第一,破坏红细胞,通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异,先使红细胞裂解,经离心后收集白细胞；第二,白细胞裂使膜蛋白和核蛋白变性,游离DNA,通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性；第三,除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质,使DNA留在上清液中；第四,在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出. 取材 取外周血5ml,EDTA抗凝 1.新鲜抗凝血,离心弃去上清液； 2.取出4℃冰箱预冷的ELS裂解液,按1:6-10的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml细胞压积加入6-10ml裂解液）,轻轻吹打混匀；红细胞裂解液ELS配方： NH4Cl:4.15克加双蒸水500ml,取450ml; Tris:1.0297克加双蒸水50ml,再加上上面的450ml,共计500ml,高压灭菌, 用时加10-20ml 3.800-1000rpm离心5-8分钟,离心弃去上层红色清液； 4.收集沉淀部分,加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次； 5.如裂解不完全可重复步骤2和3； 6.重悬细胞,用于后续实验；提取DNA,最好是于步骤4开始使用DEPC水配制的溶液进行. 酚氯仿方法提取DNA 在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础.是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的.这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验. 原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏. 一、试剂准备 1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0). 2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl. 3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml. 4．20% SDS 5．2mg/ml蛋白酶K 6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿 7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理 1．白细胞处理 ⑴ 取红细胞裂解完全后收集的沉淀,加入0.5ml TE ⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中. ⑶ 加20% SDS 25 μl,蛋白酶K (2mg/ml) 25 μl,混匀. ⑷ 60°C水浴1-3hr. 2．培养细胞处理： ⑴ 将培养细胞悬浮后,用TBS洗涤一次. ⑵ 离心4000g×5min,去除上清液. ⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液. ⑷ 50-55°C水浴1-2hr. （二）DNA提取 1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和、充分混匀3min. 2. 离心5000g×10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中. 3. 加等体积饱和酚,混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中. 4. 加等体积酚/氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中.如水相仍不澄清,可重复此步骤数次. 5. 加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中. 6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀. 7. 待絮状物出现后,离心5000g×5min,弃上清液. 8. 沉淀用75%乙醇洗涤,离心5000g×3min ,弃上清液. 9. 室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜. (三）DNA定量和电泳检测 1.DNA定量： DNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处.因此,可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA.如用1cm光径,用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000. DNA纯品的OD260/OD280为1.8,故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度.若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在.OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间,若比值较高说明有残余的盐存在. 2.电泳检测：取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳,检测DNA的完整性,或多个样品的浓度是否相同.电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带. 三、注意事项 1. 所有用品均需要高温高压,以灭活残余的DNA酶. 2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制. 3. 用大口滴管或吸头操作,以尽量减少打断DNA的可能性. 4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的.如要求更高,可参考有关资料进行DNA纯化.

B. 从组织细胞中获得酶的粗提取样品常有哪些方法

从动物胰脏中提取胰蛋白酶,一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来,然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH值调至酸性（pH3.0左右）,使大量的酸性蛋白沉淀出来.经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀.沉淀物经水溶解并调至pH8.0,用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活,同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原也被激活,三种酶原相互作用过程如下：
也可采用从胰脏中提取出胰蛋白酶原,利用合适的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶,并通过溶液中Ca2+的环境,使胰蛋白酶原被开始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活,转变为具有活性的胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶原及弹性蛋白酶原亦同时被胰蛋白酶激活成有活性的酶）.
激活后的酶溶液再进一步分离纯化.
〔试剂和器材〕
1、试剂
（1）pH2.3.0乙酸化的水溶液
（2）10%（体积分数）乙酸
（3）2mol/L硫酸
（4）固体硫酸铵
（5）无水CaCl2
（6）结晶胰蛋白酶
（7）25%乙醇溶液(含0.015mol/LHCl 、0.05mol/LCaCl2)
（8）95%（体积分数）乙醇
（9）5mol/L NaOH
（10）丙酮
2、器材
（1）胰脏
（2）组织捣碎机
（3）离心机
（4）磁力搅拌器
（5）透析袋、20目筛网、纱布、水浴锅
（6）烧杯、量筒、刻度吸管、试管、玻璃漏斗
（7）布氏漏斗、抽滤瓶、温度计、滴管、玻璃搅棒、纱布、pH试纸等
〔方法和步骤〕
方法一
1、 胰蛋白酶原的提取
取新鲜胰脏约150g,剥去结缔组织和脂肪,取净重100g,切成碎块,在组织捣碎机中捣碎,并加入2倍体积预冷的pH2.3.0乙酸化水溶液,制成匀浆.浆液倒入500mL烧杯中,用10%（体积分数）乙酸调节pH在2.3.0之间,在5～10℃下提取6h以上,并间隙轻轻搅拌.用4层纱布过滤,尽量挤出滤液.组织残渣中再加入0.5倍体积（约50mL左右）预冷的pH2.3.0乙酸化水溶液再提取一次（放置1～2h）,再用4层纱布过滤.合并两次滤液,用2.5mol/L硫酸调节滤液pH在2.3.0之间,4℃放置4h（pH始终保持在2.3.0）,使提取液中酸性蛋白沉淀析出.提取液用折叠滤纸于玻璃漏斗中自然过滤,收集滤液,量取体积（约200mL左右）.
滤液中加入粉末状固体硫酸铵,使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492g,5℃）.放置过夜,使胰蛋白酶原完全析出.次日抽滤,弃滤液,压紧并收集滤饼,即胰蛋白酶原粗品.
2、 胰蛋白酶原的激活
将胰蛋白酶原粗品称重（湿重）,分次加入10倍体积预冷的蒸馏水（按滤饼重量计算）,使滤饼完全溶解（一般情况滤饼中硫酸铵含量约占饼重1/4）.用5mol/L NaOH将溶液调至pH8.0,慢慢地搅拌下加入固体无水CaCl2使溶液的Ca2+终浓度达到0.1mol/L（要减去一部分氯化钙与硫酸铵结合生成硫酸钙的钙离子）.取出2mL溶液用于测定激活前的蛋白含量及酶活性.原溶液中加入5mg结晶胰蛋白酶,轻轻搅拌均匀,25℃放置2～4h,或4℃放置12～16h,使胰蛋白酶原活化.每隔1h取样测定胰蛋白酶活性增长情况,直至酶激活速度变慢或停止增长.一般比活可达到3 500～4 000 BAEE单位/mg.留取2mL溶液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性.激活酶溶液用2mol/L硫酸调pH至2.3.0,滤纸过滤,滤去硫酸钙沉淀,收集滤液,4℃保存备用.
方法二
称取冷冻猪胰脏100g,在2～5℃下解冻,切成小块,用组织捣碎机中绞碎成胰浆,在5～10℃存放24h以上,使胰酶自身活化.胰浆中加入25%（质量分数）乙醇溶液250mL（25%乙醇溶液中加0.015mol/L HCl 、0.05mol/L CaCl2）,捣碎机中捣碎1min.胰浆倒入500mL烧杯中,间隙搅拌,温度20℃左右,活化5～6h.每隔1.5h,吸取2mL活化液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性.
活化反应结束后,胰浆3 500 r/min离心20min,将离心后上清液用二层纱布过滤.滤液置250mL烧杯中,以过滤清液的体积为准,加入粉末状硫酸铵,搅拌溶解,使溶液硫酸铵饱和度为20%.放置 6h后,3 500 r/min离心20min,保存上清液待用,取沉淀.沉淀分别用适量95%乙醇洗涤过滤,再用丙酮洗涤,过滤.最后将沉淀置于表面皿上自然干燥,即得胰蛋白酶粗品Ⅰ.
在上述离心上清液中,加入粉末状硫酸铵,搅拌溶解,使上清液溶液达到55%硫酸铵饱和度,放置 6h后,3 500 r/min离心30min,取离心沉淀,分别用适量95%乙醇、丙酮洗涤,过滤后将沉淀置于表面皿上自然干燥,即得胰蛋白酶粗品Ⅱ.

C. 如何从含酶的生物中提取酶，急需具体方法

这个说法太笼统了。如果这个酶有特定的吸附物，那可以用过柱的办法。如果只是要它的活性，那也可以不必提纯，直接把组织匀浆就去实验就行了。但有个前提条件，就是要先清楚这个酶的活性在提取过程中是否会变化。比如有些酶，你把生物组织提取出来一见空气酶的活性就没了。

D. 如何提取植物叶片细胞液里面的酶

数:251
酶提取法
天然植物的细胞壁由纤维素构成，其中植物的有效成分往往被包裹在细胞壁内。酶提取法就是利用纤维素酶果胶酶蛋白酶等（主要是纤维素酶），破坏植物的细胞壁，以促使植物有效成分最大限度溶解分离出的一种方法。在酶提取法的提取工艺中，酶的选择、酶浓度、pH值、酶解温度、酶解时间都会影响植物提取物的提取率。
E. BARZANA等人采用酶提取法从万寿菊提取类胡萝卜素，主要研究了料液比、酶浓度、酶解时间和温度等对提取率的影响，研究结果表明最佳提取工艺为：料液比1∶4、酶浓度0.3%、提取时间为1.5h、温度为25℃。张小清等人采用酶提取法提取银杏中的活性成分—黄酮，并通过正交实验找出酶浓度、pH值、酶解温度和时间等影响提取率的最佳工艺条件。（一）水溶液提取法（二）有机溶剂提取法

E. 盐溶液提取酶的方法

1．盐析法
2．有机溶剂沉淀法
乙醇、丙酮等能与水互溶的有机溶剂，在不同的浓度下能沉淀不同的蛋白质，因此能用来纯化酶。此法分辨能力高，提纯效果好。但高浓度的有机溶剂常常引起酶活力的丧失，同时整个操作过程都应该严格控制在低温进行。
3．吸附法
有些吸附剂如淀粉、氧化铝、硅藻土、磷酸钙以及近年来使用的羟基磷灰石可以选择性地吸附酶，故可以用于酶的纯化。一般在弱酸性或中性环境中，在酶液中加入吸附剂，经搅拌，酶即被吸附在吸附剂的表面上。过滤分离后，再用较高pH的高浓度盐溶液把酶从吸附剂上洗脱下来，即可达到纯化酶的目的。
除了以上3种酶的纯化方法以外，还有利用分子大小不同以纯化酶的凝胶过滤法和超离心法、利用不同蛋白质分子在某一pH环境中荷电性质不同而建立的离子交换法、以及利用酶具有和底物或竞争性抑制剂结合的功能而建立的亲和层析法等。以上这些方法在酶的分离纯化上已逐渐得到广泛的应用。
制备好的较纯的酶，一般都不太稳定。特别是在溶液中，酶更容易丧失活力。通常应在冰箱中保存。此外也可以酶溶液中加入一些保护剂，如巯基酶可加入还原剂保存。
最好的办法还是把酶制成干粉，可以延长保存时间。但酶在干燥器中的干燥过程中，有时部分变性，这时可采用冷冻干燥法。使酶溶液在冷冻状态下迅速升华失去水分，可以避免酶力的损失，得到便于保存的干粉。

F. 从各种组织细胞中获取酶的方法

从动物胰脏中提取胰蛋白酶,一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来,然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH值调至酸性（pH三.0左右）,使大量的酸性蛋白沉淀出来.经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀.沉淀物经水溶解并调至pH吧.0,用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活,同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原也被激活,三种酶原相互作用过程如下： 也可采用从胰脏中提取出胰蛋白酶原,利用合适的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶,并通过溶液中Ca二+的环境,使胰蛋白酶原被开始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活,转变为具有活性的胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶原及弹性蛋白酶原亦同时被胰蛋白酶激活成有活性的酶）. 激活后的酶溶液再进一步分离纯化. 〔试剂和器材〕 一、试剂 （一）pH二.三.0乙酸化的水溶液 （二）一0%（体积分数）乙酸 （三）二mol/L硫酸 （四）固体硫酸铵 （5）无水CaCl二 （陆）结晶胰蛋白酶 （漆）二5%乙醇溶液(含0.0一5mol/LHCl 、0.05mol/LCaCl二) （吧）95%（体积分数）乙醇 （9）5mol/L NaOH （一0）丙酮 二、器材 （一）胰脏 （二）组织捣碎机 （三）离心机 （四）磁力搅拌器 （5）透析袋、二0目筛中国、纱布、水浴锅 （陆）烧杯、量筒、刻度吸管、试管、玻璃漏斗 （漆）布氏漏斗、抽滤瓶、温度计、滴管、玻璃搅棒、纱布、pH试纸等 〔方法和步骤〕 方法一 一、 胰蛋白酶原的提取 取新鲜胰脏约一50g,剥去结缔组织和脂肪,取净重一00g,切成碎块,在组织捣碎机中捣碎,并加入二倍体积预冷的pH二.三.0乙酸化水溶液,制成匀浆.浆液倒入500mL烧杯中,用一0%（体积分数）乙酸调节pH在二.三.0之间,在5～一0℃下提取陆h以上,并间隙轻轻搅拌.用四层纱布过滤,尽量挤出滤液.组织残渣中再加入0.5倍体积（约50mL左右）预冷的pH二.三.0乙酸化水溶液再提取一次（放置一～二h）,再用四层纱布过滤.合并两次滤液,用二.5mol/L硫酸调节滤液pH在二.三.0之间,四℃放置四h（pH始终保持在二.三.0）,使提取液中酸性蛋白沉淀析出.提取液用折叠滤纸于玻璃漏斗中自然过滤,收集滤液,量取体积（约二00mL左右）. 滤液中加入粉末状固体硫酸铵,使溶液达0.漆5饱和度（每升滤液加四9二g,5℃）.放置过夜,使胰蛋白酶原完全析出.次日抽滤,弃滤液,压紧并收集滤饼,即胰蛋白酶原粗品. 二、 胰蛋白酶原的激活 将胰蛋白酶原粗品称重（湿重）,分次加入一0倍体积预冷的蒸馏水（按滤饼重量计算）,使滤饼完全溶解（一般情况滤饼中硫酸铵含量约占饼重一/四）.用5mol/L NaOH将溶液调至pH吧.0,慢慢地搅拌下加入固体无水CaCl二使溶液的Ca二+终浓度达到0.一mol/L（要减去一部分氯化钙与硫酸铵结合生成硫酸钙的钙离子）.取出二mL溶液用于测定激活前的蛋白含量及酶活性.原溶液中加入5mg结晶胰蛋白酶,轻轻搅拌均匀,二5℃放置二～四h,或四℃放置一二～一陆h,使胰蛋白酶原活化.每隔一h取样测定胰蛋白酶活性增长情况,直至酶激活速度变慢或停止增长.一般比活可达到三 500～四 000 BAEE单位/mg.留取二mL溶液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性.激活酶溶液用二mol/L硫酸调pH至二.三.0,滤纸过滤,滤去硫酸钙沉淀,收集滤液,四℃保存备用. 方法二 称取冷冻猪胰脏一00g,在二～5℃下解冻,切成小块,用组织捣碎机中绞碎成胰浆,在5～一0℃存放二四h以上,使胰酶自身活化.胰浆中加入二5%（质量分数）乙醇溶液二50mL（二5%乙醇溶液中加0.0一5mol/L HCl 、0.05mol/L CaCl二）,捣碎机中捣碎一min.胰浆倒入500mL烧杯中,间隙搅拌,温度二0℃左右,活化5～陆h.每隔一.5h,吸取二mL活化液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性. 活化反应结束后,胰浆三 500 r/min离心二0min,将离心后上清液用二层纱布过滤.滤液置二50mL烧杯中,以过滤清液的体积为准,加入粉末状硫酸铵,搅拌溶解,使溶液硫酸铵饱和度为二0%.放置 陆h后,三 500 r/min离心二0min,保存上清液待用,取沉淀.沉淀分别用适量95%乙醇洗涤过滤,再用丙酮洗涤,过滤.最后将沉淀置于表面皿上自然干燥,即得胰蛋白酶粗品Ⅰ. 在上述离心上清液中,加入粉末状硫酸铵,搅拌溶解,使上清液溶液达到55%硫酸铵饱和度,放置 陆h后,三 500 r/min离心三0min,取离心沉淀,分别用适量95%乙醇、丙酮洗涤,过滤后将沉淀置于表面皿上自然干燥,即得胰蛋白酶粗品Ⅱ

G. 纤维素酶的提取方法

用产酶菌
酶的提取主要有几个方法：盐析、凝胶住分离、膜分离、透析。。。
对于纤维素的分离查了篇文献，粗粉采用的是盐析，细分用的凝胶柱分离，过程如下：
提取：
1.用硫酸钱沉淀法获粗酶制剂，溶在适量蒸馏水中.
2.经过透析脱盐，Ba2+检测脱盐程度，以不形成白色浑浊为限.
3.停止透析，浓缩
分离：
4.上样，过Sephadex 凝胶柱柱，sephadex型号的选择可以通过ladder估计分子量后选择
5.通过活性实验对凝胶柱分离的每一组分做活性实验，确定活性组分，然后对活性组分进一步细分或者直接得到酶。
6.再细分的话，可以选择更合适的葡聚糖凝胶或者用电泳分离。

H. 酶进行提纯的方法是什么

酶，从动植物细胞和微生物中提取之后，往往不能直接应用，这是因为生物在合成酶的同时也合成其他大分子物质。而这些大分子物质会严重干扰酶的作用，因此必须把酶从中分离出来。如果酶不纯，那么极有可能在应用中形成几个生化反应同时进行，结果得到的产物也就不是单一的。当然，酶并不是越纯越好。不同的生物化学反应，对酶的纯度要求也不一样。因此，要把酶制成不同的酶制剂，以便适应各种需求。

要对酶进行分离和提纯，有多种方法。当酶从生物细胞以及微生物中产生之后，可能留在细胞内，也可能分泌到细胞外面。如果是胞外酶，这就方便多了，只要收集微生物和细胞的培养液进行分离和提纯就可以了。如果酶在细胞内(称胞内酶)，则必须研碎细胞，才能把酶提取出来。不论是胞外酶还是胞内酶，都可能会含有一些其他大分子物质，如核酸、蛋白质和淀粉之类的东西。

对付核酸，只要在酶溶液中加入核酸酶，就可以去掉核酸。对于淀粉也比较好办。最难对付的是蛋白质，因为酶也是蛋白质，能破坏蛋白质的方法也可以破坏酶，所以提纯是件比较困难的事。但随着现代科学技术的不断进步，经过研究，已找到沉淀法、分子过滤法等。采用以上提纯方法，就可以得到不同纯度的酶，这为酶的广泛应用打开了方便之门。

I. 酶分离提纯的方法有哪些

酶是蛋白质，因此一般蛋白质的分离原则都应该遵行。但酶作为特殊的蛋白质，最重要的原则是一定在纯化过程中保持酶的活性，所以纯化过程中一般要注意保持低温、缓冲液配方避免酶的抑制。每个步骤都要检测酶活性，一方面直观了解纯化的回收率，另一方面可以计算酶的纯度。
酶的分离纯化方法一般根据酶的分子量、等电点、疏水性等生化性质，选择相应的沉淀、盐析、层析方法，其中亲和层析可以应用可逆性底物作为配基或特异性抗体，制备亲和层析胶。

J. 酶的分离和纯化方法是什么

酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。

首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。

酶分离纯化的最终目的是获得单一纯净的酶，因此，容许在不破坏“目的酶”的限度内，使用各种手段;酶与底物和抑制剂的结合常使其理化性质和稳定性发生改变，这种特性已被用于酶的分离纯化。

由于酶及其来源的多样性及与之共存的高分子物质的复杂性，目前还很难找到一种通用的方法以适用于一切酶的纯化。为了使一种酶达到高度纯化，往往需要多种方法协同作用，通过酶活性的跟踪检测确定最佳流程。

(10)酶提取常用的方法扩展阅读：

酶的本性是蛋白质，凡可用于蛋白质分离纯化的方法都同样适用于酶，但酶易失活，故分离纯化需在低温(4℃)、温和pH(4<pH>10)等条件下进行。

与蛋白质类似，酶易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，因此操作中应尽量减少泡沫形成，此外重金属易使酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏。

在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称是分离纯化。