⑴ 稳转株构建基本原理与步骤【新手入门】
细胞株的构建是生物研究中的基础步骤。它们是从原代培养物或细胞系中，通过选择或克隆形成法获得，具有特殊性质或标志的细胞培养物。这些细胞可培养到约40-50代，并在整个培养过程中保持其特殊性质或标志不变。在研究中，人类肿瘤细胞在体外培养半年以上，稳定生长并连续传代的可被视为连续性株或系。
构建细胞株的关键步骤之一是将外源DNA克隆到具有抗性的载体上，载体随后被转染到宿主细胞并整合至宿主染色体中。通过载体中的抗性标志进行筛选，筛选出能稳定表达目的蛋白或沉默特定基因的细胞株。常用的真核表达载体抗性筛选标志物包括新霉素、潮霉素和嘌呤霉素。
在构建多克隆稳转株时，荧光强度会随时间变化，通常从感染后72小时开始加入筛选药物，每2天更换一次液体并重新加入筛选药物。筛选过程至少持续14天，直至观察到100%的荧光细胞。稳定表达细胞株广泛应用于基因功能研究、基因干扰、拷贝数控制、诱导表达系统实验以及构建动物模型等。
慢病毒因其几乎能感染所有细胞并在感染后整合至基因组，提供了长期稳定表达的途径，因此常用于构建单克隆稳转细胞株。构建流程包括筛选合适抗生素浓度、病毒滴度、慢病毒构建与包装、慢病毒感染以及特定抗生素筛选稳转细胞株等步骤。
稳转株构建是一个复杂而细致的过程，涉及多平台的合作。在构建过程中，可能会遇到多种问题，如筛选失败、整合效率低、细胞活力下降等。分享构建过程中的经验和遇到的问题，有助于提高成功率和研究效率。欢迎讨论在构建稳转株过程中遇到的挑战和解决方案。