测定氨基酸态氮常用的方法

‘壹’ 用甲醛法测定酱油中氨基酸态氮的操作方法

酱油测的应该是氨基态氮的含量吧。方法如下：
1 校正PH计。
2 吸取试样5ml于容量瓶中，定容100ml。
3 吸取稀释液20ml于烧杯瓶中,将烧杯置于电磁搅拌器上,电极插入烧杯内试样中适当位置。
4 开动电磁搅拌器,先用0.1mol/L氢氧化钠溶液慢慢中和试样中的有机酸，当pH达到8.2左 右时,记录消耗0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。然后慢慢加入10mL中性甲醛溶液，至PH值稳定，再用0.1mol/L氢氧化钠溶液调至pH9.2,并保持1min不变。记录消耗0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。
4 结果表示 测定结果表示见公式:
c·V·K×14
X = ———————-×100
m
式中：X--每100g(或100mL)试样中氨基态氮的毫克数,mg/100g(或mg/100mL);
c--氢氧化钠标准滴定溶液的浓度,mol/L;
V--加入中性甲醛溶液后,滴定试样消耗0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积,mL;
m--试样的质量,g(或体积mL);
K--稀释倍数；
14--1 mL 1N氢氧化钠标准滴定溶液相当于氮的毫克数。

‘贰’ 简述液体调味料氨基酸态氮检测的基本步骤

简述液体调味料氨基酸态氮检测的基本步骤
电位甲醛滴定法【酱油卫生标准的分析方法Method for analysis of hygienic standard of soybean sauce】（第一法甲醛值法）
（一）原理
氨基酸有氨基及羧基两性基团，它们相互作用形成中性内盐，利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出来酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，根据酸度计指示pH值，控制终点。
R—CH—COOH——→R—C—C=O
∣ ∣ ∣
NH2 H3N—O

R—CH—COOH+HCHO——→R—CH—COOH
∣ ∣
NH2 NH—CH2OH

R—CH—COOH +NaOH=R—CH—COONa
∣ ∣
NH—CH2OH NH—CH2OH
（二）试剂
1、甲醛（36%）：应不含有聚合物。
2、氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH )=0.050mol/L]
（三）仪器
1、pHS—25型酸度计：包括标准缓冲溶液和KCL饱和溶液；
2、20mL移液管；3、10mL微量滴定管；4、100mL容量瓶；
5、250mL烧杯；

（四）测定方法
1、吸取5.0mL试样，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，备用。
2、吸取上述稀释液20.00mL置于200mL烧杯中，加水60mL水，插入电极，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH)=0.050mol/L]滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH )=0.050mol/L]的毫升数，（可计算总酸含量）。
3、向上述溶液中准确加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH )=0.050mol/L]继续滴定至pH9.2，记录加入甲醛后滴定所消耗氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH )=0.050mol/L]的毫升数。
4、取80mL水，先用氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH )=0.050mol/L]滴定至酸度计指示pH8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，混匀,再用氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH )=0.050mol/L]滴定至pH9.2，记录加入甲醛后滴定所消耗氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH )=0.050mol/L]的毫升数。

（五）结果计算
试样中氨基酸态氮的含量为：

式中：X—试样中氨基酸态氮的含量，g/100Ml；
V1—测定用试样稀释液加入甲醛后消耗标准碱液的体积，mL；
V2—测定空白试验加入甲醛后消耗标准碱液的体积，mL；
C—氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；
0.014—与1.00 mL氢氧化钠标准滴定溶液[c(NaOH )=1.000mol/L]相当的氮的质量，g；
（六）注意事项
1、加入甲醛后放置时间不宜过长，应立即滴定，以免甲醛聚合，影响测定结果。
2、由于铵离子能与甲醛作用，样品中若含有铵盐，将会使测定结果偏高。
3、计算结果保留两位有效数字。精密度:在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%

‘叁’ 检验氨基酸用什么方法

你若是问蛋白质，我可以直接告诉你又双缩脲试剂（中学阶段），但氨基酸的检验比蛋白质麻烦多了。 一、氨基酸的分离和检测氨基酸的分离和检测手段，以往用化学分析法、层析法、比色法、气相色谱法、氨基酸自动分析仪。随着高效液相色谱及填料的发展，HPLC在氨基酸检测方面显示了其特有的优越性。但大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特性，为提高分析检测灵敏度和分离选择特性，通常将氨基酸衍生，衍生方式有柱前衍生法与柱后衍生法。HPLC与各种衍生相结合的氨基酸分析技术，构成了具有广泛适用性的现代氨基酸分析技术。
二、鉴定是哪种氨基酸，不同的氨基酸要用不同的方法。1、茚三酮反应 （ninhydrin reaction） 茚三酮（弱酸环境加热） 紫色（脯氨酸、羟脯氨酸为黄色） （检验α－氨基）
2、坂口反应 （Sakaguchi reaction） 丙氨酸
α-萘酚+碱性次溴酸钠 红色 （检验胍基 精氨酸有此反应）
3、米隆反应（又称米伦氏反应） HgNO3+HNO3+热 红色 （检验酚基 酪氨酸有此反应，未加热则为白色）
4、Folin-Ciocalteau反应（酚试剂反应） 磷钨酸-磷钳酸 蓝色 （检验酚基 酪氨酸有此反应）
5、黄蛋白反应 浓硝酸煮沸 黄色 （检验苯环 酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸有此反应）
6、Hopkin-Cole反应（乙醛酸反应） 加入乙醛酸混合后徐徐加入浓硫酸 乙醛与浓硫酸接触面处产生紫红色环 （检验吲哚基 色氨酸有此反应）
7、Ehrlich反应 P-二甲氨基苯甲醛+浓盐酸 蓝色 （检验吲哚基 色氨酸有此反应）
8、硝普盐试验 Na2(NO)Fe(CN)2*2H2O+稀氨水 红色 （检验巯基 半胱氨酸有此反应）
9、Sulliwan反应 1，2萘醌、4磺酸钠+Na2SO3 红色 （检验巯基 半胱氨酸有此反应）
10、Folin反应 1，2萘醌、4磺酸钠在碱性溶液 深红色 （检验α－氨基酸）
三、关于氨基酸态氮的测定：（定量分析）1.双指示剂甲醛滴定法2.电位滴定法 另请参阅： http://www.docin.com/p-69133358.html

‘肆’ 在测定氨基酸态氮时为什么加入甲醛溶液

当加入甲醛溶液时，一NH。基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定一COOH基，并用间接的方法测定氨基酸总量。蛋白、多肽或氨基酸中游离氨基-NH3+上的H+会被甲醛取代，生成—NH—CH2OH、—N(CH2—OH)2等羟甲基衍生物，从而游离出H+。
氨基酸态氮是判定发酵产品发酵程度的特性指标。该指标不达标，主要是由于生产工艺不符合标准要求，产品配方缺陷或者是产品与已制定指标不匹配等原因造成的。该指标越高，说明酱油中的氨基酸含量越高，鲜味越好。酱油中氨基酸态氮最低含量不得小于0.4g/100ml。可以通过NaOH滴定来测定生成的H+从而测定游离氨基含量。

‘伍’ 酱油中氨基酸态氮含量的测定是什么

食品中的氨基酸组成十分复杂，在一般的常规检验中，多测定食品中氨基酸的总量，即氨基酸态氮的总量，通常采用碱滴定法进行简易测定。

氨基酸含有羧基和氨基，利用氨基酸的两性作用，加入甲醛固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后进行定量，用酸度计测定终点。

蛋白质是一类含氮的高分子化合物，基本组成单位是氨基酸。参加蛋白质合成的氨基酸共有二十多种，其中有9种（赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、组氨酸、蛋氨酸和缅氨酸）人体自身不能合成，必须由食物中供给。

否则人体就不能维持正常代谢的进行，称为必需氨基酸。蛋白质是生命的基础，生命现象是通过蛋白质来体现的。蛋白质是人体组织细胞的重要组成部分，人体重量的18%由蛋白质构成。

试验：

准确吸取酱油5.0ml置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度后摇匀吸取20.0ml置于100ml烧杯中，加水60ml，插入酸度计的指示电极作为参比电极。

开动磁力搅拌器（若是冬季需加热到二十摄氏度左右），再用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定酸度计指示Ph-8.2，记录用去氢氧化钠标准使用液的体积（ml）（按总酸计算公式可以计算出酱油的总算含量）。

向上述溶液中准确加入甲醛溶液10ml，摇匀，继续用0.05m01/LNaOH标准溶液滴定滴定至Ph-9.2，记录用去氢氧化钠标准使用液的体积（ml），供计算氨基酸态氮含量用。

酱油中的氨基酸态氮是氨基酸含量的特征指标，含量越高酱油的鲜味越强，质量越好。酱油分两种：

1、酿造酱油（Fermented soy sauce）：以大豆和/或脱脂大豆、小麦和/或麸皮为原料，经微生物发酵制成的具有特殊色、香、味的液体调味品。按GB18186-2000要求其理化指标应符合规定。

2、配制酱油（Blended soy sauce）以酿造酱油为主体，与酸水解植物蛋白调味液、食品添加剂等配制而成的液体调味品。按SB10336-2000（国家国内贸易局行业标准）要求其理化指标应符合规定。

‘陆’ 国标法如何测定食醋中氨基酸态氮

由中国疾病预防控制中心营养与食品安全所研制，北京智林科技公司出品的“食品安全快速检测箱”、“常见急性食物中毒快检箱”，外型小巧、庄重大方、携带方便。箱内储物盒，不但容量大、且可随意组合。检测箱内的检测项目，都是针对社会关注的焦点、难点及食物链中容易发生问题的关键性环节。在这些方法中，除微生物法外，项目的平均检测时间不到10分钟，最长的也可在30分钟内出结果，非常适合现场使用。
食品安全快速检测箱由外箱、公共试剂盒、检测试剂盒、辅助仪器组成。检测箱外色为黑色和银灰色，上盖内侧有规范的装具袋，装备有常用的器材，如多功能剪刀、移液管、量筒等。检验箱采用耐酸碱、耐冲击、耐挤压材料，设计合理便于携带及现场操作。食品安全快速检测箱的外型设计得体、大小适宜、携带方便。箱内储物盒的设计不但容量大、且可随意组合。检测项目针对社会关注的食品安全热点、难点及食物链中容易发生问题的关键性环节。检测设备是目前国内较为先进或较为恰当的。

检测方法来源：一是将国标法、AOAC法或经典的教科书方法所用的诸多试剂事先做成试剂盒、试剂包或试纸卡，尽量减少现场试剂的配置。将方法中所用的仪器、器皿等研制成为或精心选购一些小巧和便于携带的设备。二是将实验室中最新的科研成果转化成为能适于现场使用的检测设备和方法。所采用的一些快速检测方法正在制订我国国家标准，如蔬菜中亚硝酸盐快速检测方法等，还有已成为了国家标准方法，如大肠菌群的检测方法、农药残留快速检测方法等。

目前,食品安全快速检测箱中有40多个理化快速检测项目，随着社会需求和技术的发展在不断增加。操作方法力求简单、易用，给操作者带来方便，为食品安全的监管、质控、以及食物中毒现场快速筛查提供科学有效的手段 。

一、食品安全快速检测箱 配置简介

食品安全快速检测箱分为：精简配置，中档配置，高档配置，微生物部分。可成套装备，也可根据需要选择配置。

1. 精简配置 （两个箱体,38个检测项目）

1.1基本配置

产品名称
产品规格
产品名称
产品规格

仿皮或铝合金箱体
1个
300ml塑料储液瓶各
1个

微型电子天平
1台
滤纸
1盒

计算器
1个
漏斗
2个

储物盒
5个
农药提取罐
10个

试管架
1个
一次性滴管
10支

多功能剪刀
1把
药勺
3个

比色管
5支
pH试纸
1包

大小试管各
5支
微型水浴锅
1个

5ml移液管移液球各
1个
说明书
1份

100ml塑料储液瓶
1个

1.2检测项目配置

产品名称
产品规格
产品名称
产品规格

食品中心温度计
一支
电导仪
1支

酒醇速测箱
1套
农药残留速测卡
2盒（40份用量）

亚硝酸盐速测管
40份用量
二氧化硫速测盒
约100份用量

甲醛定性速测包
100份用量
甲醛定性速测管
15份用量

苏丹红检测试剂盒
50份用量
注水肉检测试纸
60份用量

奶粉蛋白快速检测盒 50份用量
瘦肉精快速检测卡
10份用量
砷、汞检测试剂
约50份用量

氰化物检测试剂
约20份用量
氰化物检测装置
1套

食用油中大麻油速测鉴别试剂
约10份用量
食用油脂酸价、过氧化值速测卡
10份用量

食用油中巴豆油速测鉴别试剂
约10份用量
食用油中桐油速测鉴别试剂
约50份用量

食用油中矿物油速测鉴别试剂
约10份用量
假冒伪劣味精速测液
约20份用量

食醋中游离矿酸速测试纸
40份用量
食醋中总酸快速测定试液包
约25份用量

酱油中总酸与氨基酸态氮速测试液包
约25份用量
消毒液有效氯和双氧水速测试纸
1盒

碘盐含碘量速测液
（约500份用量）
食品安全快速检测技术（书）
1册

理化检验数据统计软件
1张
食品安全检测技术讲座（光盘）
1张

2. 中档配置 （三个箱体,41个检测项目）

在精简配置基础上增加：

农药残留速测仪(箱)1台

手动可调式移液器1.0～5.0ml（芬兰中国基地产品）1支

精密酸度计(带校准试剂)1支,手持式室内外电子温湿度计1台

车载电源转换器1个

游离性余氯速测盒1盒。

3. 高档配置 （四个箱体,45个检测项目）

在中档配置基础上增加：

食品和环境专用远红外线测温仪

消毒间紫外线辅照强度计

肉类水分快速测定仪

便携式超声波提取、溶解、清洗器

微型离心机各1个（台）

食品粉碎机1台

双通道计时定时器1个

卫生指标检砷管1套

仿皮箱体改为真皮箱体

增加1个铝合金箱体

二、部分检测项目简介

（一）急性食物中毒物质的快速筛选和测定

1. 农药测定：速测卡法（国标法），定性兼半定量。主要用于蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速定性，阳性结果为超标，超标符合率在80%左右。选用为速测卡而设计的速测仪后，15分钟内可测试10份样品。本方法还适用于食物中毒物质的快速筛选定性。

2. 鼠药测定：试剂包法（实验室科研成果），定性检测。30分钟内可完成毒鼠强（0.1μg/ml）、氟乙酰胺（50μg/ml）、敌鼠钠盐（45μg/ml）和安妥（20μg/ml）四种鼠药的定性。主要用于预防性监测和中毒物的筛选、定性鉴别。（括号内为检出限）。

3. 亚硝酸盐测定：速测管法（国标基础上的速测方法），定性兼半定量检测。可用作卫生指标检测、投毒监测和食物中毒物质的快速筛选、定性定量。最低检出量为0.025mg/L。现场使用，15分钟出结果。

4. 甲醇测定：酒醇速测仪（专利方法），不需试剂，定量测定,10分钟内出结果。主要用于配制酒中甲醇（≥1% V/V）的测定，尤其适用于可引起甲醇急性中毒酒样的现场快速测定。甲醇速测盒，适用于蒸馏酒中国家标准规定含量的现场快速测定，也适用于经过重新蒸馏的配制酒中甲醇含量的快速测定。

5. 砷、汞测定：工具盒法（经典传统方法），主要用于预防以三氧化二砷（砒霜）为代表的剧毒砷化物和以氯化汞为代表的剧毒汞化物混入、掺入食品的监测和中毒物的筛选、定性鉴别。检出限砷为1μg/g，汞为20μg/g，基本定性30分钟内出结果。

6. 氰化物的快速定性：苦味酸试纸法（国标法），主要用于预防剧毒氰化物混入、掺入食品的监测和中毒物的筛选、定性鉴别。现场检测20分钟出结果。10克样品中，苦味酸试纸对氰化物的检出限为0.15mg，相当于15mg/kg。

7. 食用油脂酸价和过氧化值测定：速测卡法（专利方法），半定量检测，酸价测试范围0～5.0 mg KOH/g，过氧化值测试范围0～50meq/Kg，2分钟内出结果。主要用于食用油脂卫生指标的监测，判定食用油脂是否新鲜和酸败程度。

8. 非食用油测定：试剂包法（国标法和经典方法），定性检测。5~20分钟内出结果。主要用于被矿物油（0.1%）、桐油（0.5%）、巴豆油（2.5%）等污染了的食用油的定性鉴别，以及这几种非食用油引起的中毒物的筛选定性。（括号内为检出限）。

9. 瘦肉精（盐酸克伦特罗）快速定性：胶体金标记法（专利方法），定性检测。20分钟出结果。

（二）慢性伤害物质的快速检测

1. 甲醛测定：试剂包或速测管法（实验室科研成果），定性检测。适用于水发产品和需要防腐的加工食品中人为加入甲醛或吊白块的测定。检出限10μg/ml。3分钟内出结果。

2.. 食醋中游离矿酸和感官的快速检测: 纸片法（国标法），定性，最低检出量为5μg，5分钟内出结果。

3.. 食品中漂白剂（二氧化硫）的快速测定：滴瓶法，国家标准分析方法改进后的现场快速检测方法。主要用于食品中滥用漂白剂的快速测定，以及人为加入吊白块的鉴别测定。检出限0.0016g/kg。检测时间（以白糖样品计）5分钟。

4. 游离性余氯测定：试剂盒法（国标基础上的快速方法），半定量，检出限0.05mg/，5分钟内出结果。适用于餐（饮）具消毒后残留余氯的测定、管网末梢饮用水中游离性余氯的测定、以及人工游泳池水中余氯的测定。

5. 苏丹红的快速检测：采用国家标准分析方法GB/T5009.35-2003中的纸层析法，并加以改进。在排除含有食用色素的情况下，检测非食用色素，并将苏丹红1、2、3、4号快检测出来。最低检出量为目视可见的苏丹红色素。同时也可检测其他一些非食用色素。

6.硼酸和硼砂的快速检测：采用国家药典方法并加以改进使其适合于现场使用。适用于粮食中掺入硼酸或硼砂作为杀虫防腐剂现象的检测。现场检测，10分钟内完成。

（三）伪劣食品的快速检测

1. 碘盐含碘量测定：一滴法（实验室方法），半定量，主要用于碘盐中碘含量测定和真假碘盐的鉴别。测试范围0～40 mg / kg 。1分钟内出结果。

2. 食醋中总酸含量的快速测定：滴瓶计数法（国标基础上的快速方法）。主要用于产品质量和假冒伪劣产品的现场检测。5分钟内出结果，方法误差±0.3%。

3. 酱油中总酸与氨基酸态氮含量的快速测定：滴瓶计数法（国标基础上的快速方法）。主要用于产品质量和假冒伪劣产品的现场检测。10分钟内出结果，本方法总酸测定误差±0.45%，氨基酸态氮测定误差±0.078%。

4. 假冒伪劣味精的快速检测：滴瓶计数法（国标基础上的快速方法）。现场检测5分钟内出结果，本方法误差±2.6%。

5. 注水肉的快速鉴别：肉类水分快速分析仪（专利方法）和注水肉监测试纸法，5分钟内可出结果。

6. 瓶装饮用纯净水的快速鉴别：电导率测定（国标法），2分钟内可出结果。

7. 掺杂使假伪劣木耳检测：吸水量和pH值检测（实验室方法）。30分钟可出结果。

8. 食品酸碱度测定：试纸法和酸度计法，测量范围0～14 Ph，准确度：试纸法±1pH，酸度计法±0.2pH， 1分种内出结果。主要用于检测食品酸碱度是否在规定的范围。

9.蜂蜜浓度和含水量的快速检测：蜂蜜比重计法。采用国家行业标准GH012-82方法并加以改进使其适合于现场使用。20分钟内出结果。适用于劣质蜂蜜和掺假蜂蜜的快速检测。

10.蜂蜜酸度的快速检测：滴瓶计数法。是在国家行业标准GH012-82方法基础上加以改进使其适合于现场使用。5分钟内出结果。适用于劣质蜂蜜和掺假蜂蜜的快速检测。

11.伪劣木耳的快速检测：吸水量和pH值检测。适于掺杂使假伪劣木耳的快速检测。30分钟可出结果。

（四）食品加工贮藏安全度的快速测定

1. 食品中心温度测定：中心温度计，范围 -50~150℃，分辨率0.1℃，精度 ±1℃。5分钟内出结果。主要用于《餐饮行业卫生管理办法》中规定的食品中心温度的监测。

2. 食品表面、环境温度测定：远红外测温仪（美国产品），范围 -30~200℃，分辨率0.5℃，精度 ±1℃，1秒种内出结果。主要用于HACCP要求的食品生产、贮藏、运输、销售等环节温度的测定。

3.消毒间紫外线辅照强度的测定：便携式辅照计（部颁标准方法），10分钟内即可完成卫生部消毒卫生规范中规定的检测项目。

4. 有效氯测定：速测卡法（实验室方法），半定量，测量范围10~300 mg/L。1分钟内出结果。主要用于监测含氯消毒液中有效氯的含量，保证消毒效果。

（五）微生物的快速检测

1. 餐饮具大肠菌群测定：纸片法（国标法），现场3分钟采样完毕，恒温箱24小时培养得出结果。主要用于监测餐饮具卫生状况。

2. 食品中大肠菌群测定：测试片法，适用于牛乳、冷饮和调味品中大肠菌群的快速测定。15～24小时出结果，而传统方法需要近一周的时间。

3. 食品中菌落总数测定：测试片法，18～24小时出结果，传统方法需要48小时。

4. 食品中霉菌、酵母菌数测定：纸片法，48小时出结果，传统方法需要近一周的时间。

5. 食品中金黄色葡萄球菌测定：测试片法，26小时出结果。

三、辅助设备简介

1． 微型电子天平
手掌大小的体积、携带方便。去皮清零显示，便于操作，0.1~200g的量程，可满足现场采样和试剂称量。

2． 微型超声波提取、溶解、清洗器
体积小巧，便于携带。一、可用于提取蔬菜中的农药残留，省时、省力、效果好。二、可加快难溶固体样品或固体试剂的溶解速度。三可使实验用器皿清洗的速度加快，清洗后的器皿清洁度高

3． 微型恒温水浴锅
可用于鼠药氟乙酰胺测定中排除氨的干扰，可提高试管反应结果的稳定性，还可将恒温水浴锅中的电热板部分用于砷、汞检测，可替代传统的酒精灯、酒精和三角架，携带更为方便。

4． 微型离心机
体积小巧，携带方便。可缩短某些样品需要提取、分离（沉淀）的操作时间，减少杂质干扰，拓宽检测食品种类的范围。

5. 手动可调式移液器 （芬兰）
100~1000 ul的量程，操作简单，使用方便，非常适合现场使用。

6．电导仪

既是鉴别真假饮用纯净水的仪器，又是确定实验用水是否可用的设备。笔式电导仪携带方便，掌式电导仪耐用。

7.样品粉碎仪

便携式，用于将样品粉碎均匀

‘柒’ 酱油中氨基酸态氮含量的测定

酱油测的应该是氨基态氮的含量吧。方法如下：
1 校正PH计。
2 吸取试样A毫升（氨基态氮的含量为1～5mg）于烧杯中,加5滴30%过氧化氢.将烧杯置于电磁搅拌器上,电极插入烧杯内试样中适当位置。如需要加适量蒸馏水。
3 开动电磁搅拌器,先用0.1mol/L氢氧化钠溶液慢慢中和试样中的有机酸。当pH达到7.5左右时,再用0.05mol/L氢氧化钠溶液调至pH8.1,并保持1min不变。然后慢慢加入10～15mL中性甲醛溶液(量取200mL甲醛溶液于400mL烧杯中,置于电磁搅拌器上, 边搅拌边用0.05mol/L氢氧化钠溶液调至pH8.1).1min后用0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH8.1.记录消耗0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。
4 结果表示 测定结果表示见公式:
c·V·K×14
X = ———————-×100
m
式中：X--每100g(或100mL)试样中氨基态氮的毫克数,mg/100g(或mg/100mL);
c--氢氧化钠标准滴定溶液的浓度,mol/L;
V--加入中性甲醛溶液后,滴定试样消耗0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积,mL;
m--试样的质量,g(或体积mL);
K--稀释倍数； 14--1 mL 1N氢氧化钠标准滴定溶液相当于氮的毫克数。

‘捌’ 测定蛋白质中氨基酸含量的主要步骤有哪些为什么一般分析报告显示17种氨基酸成分

一般来说人体必须的17种氨基酸，也较为重视

氨基酸的定性测定
一、氨基酸的一般显色反应
本节介绍三种显色反应：茚三酮法、吲哚醌法和邻苯二甲醛法。前二种是经典的常用显
色法，后一种是近年来发展起来的荧光显色法，具有灵敏度高的特点。
1. 茚三酮法
显色方法有下列数种：
①常用法：将点有样品的层析或电泳完毕的滤纸充分除尽溶剂，用 5g/L 茚三酮无水丙
酮溶液喷雾，充分吹干，置65℃烘箱中约30min（温度不宜过高，避免空气中氨，以免背
景泛红色），氨基酸斑点呈紫红色。
为了使各种氨基酸呈现不同颜色，可用下列方法：
②用 0.4g 茚三酮，10g 酚和90g 正丁醇的混合液显色。
③用 1g/L 茚三酮无水丙酮溶液显色完毕后，再用盐酸蒸汽熏1min。
④用 1g 茚三酮，600mL 无水乙醇，200mL 冰醋酸及80mL2,4,6-三甲基吡啶混合液80
℃染色5～10min。
为了使显色稳定，可用下列方法：
⑤配制含醋酸镉 2g 加蒸馏水200mL 及冰醋酸40mL 的贮存液。将上述贮存液加200mL
丙酮及2g 茚三酮，即为显色液。点有样品的滤纸上浸有此显色液后，放置于盛有一小杯浓
硫酸的密闭玻璃容器中，25℃，18h，或较高温度下适当缩短时间。背景色浅，氨基酸斑点
也比较稳定。
⑥用含 2g/LCoCl2(或CuSO4)的4g/L 茚三酮异丙酮溶液显色时，氨基酸斑点呈红色，也
可在茚三酮显色后喷以含钴、镉或铜等无机离子的异丙醇溶液，斑点自蓝紫色变成红色。
2．吲哚醌法
（1）原理
各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辩认氨基酸。氨对吲哚醌显色没
有妨碍，但其灵敏度较茚三酮法稍差，显色不稳定，颜色只有在绝对干燥的环境中才能保存。
（2）试剂
①显色剂：1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸中（若冰醋酸用量减少则灵敏度
稍差）。
②底色褪色剂：在 100mL 200g/L 碳酸钠溶液中加入60g 硅酸钠（Na2SiO3•9H2O）在水
浴（60～70℃）中加热搅拌直至完全溶解，待溶液比较清澈为止。在溶解过程中，有时硅酸
钠会结成凝胶，此时只需继续搅拌即可溶解。配制时若硅酸钠用量多则褪色较快，但背景容
易变黄，硅酸钠用得少（40g），虽裉色较慢，但背景较为洁白。
显色步骤
层析或电泳后滤纸烘干后，仔细喷上或涂上显色剂，用电吹风迅速吹干，待醋酸气味不
太刺鼻时移置100℃烘箱烘5～15min，直至显色为止（温度不要太高，以免引起减色）注
意观察所显出的颜色，然后均匀地涂上底色褪色剂，纸的背景即由黄色变为绛红而后逐渐变
浅，待黄色背景几乎褪尽时，迅速用电吹风吹干，并随时观察颜色的变化。例如苏氨酸在褪
色前为浅红带褐色，褪色后则呈橙黄色或黄色：脯氨酸在褪色前为蓝色，吹干时很快褪成无
色。室温较低时，底色褪色很慢，此时可将褪色剂加温到30～40℃。温度过高也不宜，因
氨基酸斑点的褪色速度也同时加快，应该避免。
其他显色步骤：显色剂为 1g 吲哚醌，1.3g 醋酸锌溶解于70～80mL 热异丙醇中，冷却
后加1mL 吡啶。或者1g 吲哚醌，1.5g 醋酸锌溶解于95mL 热异丙醇中，加3mL 水，冷却
后加1mL 冰醋酸。点有样品的滤纸仔细喷以显色剂后，80～85℃放置10min，背景可用水
迅速浸洗去而不使氨基酸斑点退去
由于吲哚醌试剂配制方法不同，对同一种氨基酸所显颜色往往也有差异。
3．邻苯二甲醛法
邻苯二甲醛法是目前纸上层析、硅胶薄层层析荧光显色氨基酸最灵敏的方法之一，也可
用于氨基酸溶液定量，并推广应用于乙内酰苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白质的检出和定量。根
据文献报道，氨基酸纸上层析灵敏度达0.5μmoL，在硅胶薄层层析上为0.05～0.2μmoL。
这里介绍在纸上层析显现氨基酸方法。（荧光胺是另一种常用的荧光试剂，由于荧光胺来源
比较困难，这里未作介绍）
（1）原理
邻苯二甲醛在 2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适
的激发光和发射光波长分别为340nm 和455nm。
各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，
异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨
酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。
（2）试剂
邻苯二甲醛显色液：取0.1g 邻苯二甲醛，0.1mg 巯基乙醇，1mL 三乙胺，加丙酮+石油
醚（60℃～90℃）（1+1）的混合溶剂至100mL。放置0.5h 后使用。
显色步骤
将含有氨基酸样品的滤纸浸入邻苯二甲醛显色液中 1min，冷风吹干，在温度18℃以下，
湿度50%～90%之间显色0.5h，于紫外灯下观察荧光点。
说明
在滤纸上显现氨基酸时，邻苯二甲醛浓度以 0.1%为宜。显色时必须有一定的湿度，以
便氨基酸溶解，提高分子碰撞机率，并使极性基团解离，促进反应趋于完全。湿度太低，显
不出荧光。温度对显现的荧光延时有显着影响，温度高荧光延时短，温度低荧光延时长。
二、个别氨基酸的显色反应
利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸。可应用于纸层析和纸电
泳显色，也可单独应用。方法很多，仅将常用的方法介绍如下：
1．精氨酸的显色——坂口（Sakaguchi）反应
(1)第一种方法
试剂：①5g 尿素溶解于100mL0.1g/Lα-萘酚乙醇中。使用前，每100mL 加约5g KOH。
②0.7mL 溴水溶解于100mL 5%NaOH 中。
显色步骤：在点有样品的滤纸上喷试剂①后，在空气中吹几分种，再喷试剂②。精氨
酸或含精氨酸的多肽显红色。此试剂对含精氨酸的蛋白质也适用。
(2)第二种方法：
试剂：①1g/L 8-羟基喹啉的丙酮溶液。②0.02mL 溴水溶解于100mL 0.5mol/LnaOH 溶
液中。
显色步骤：将点有样品的滤纸烘干后，喷上试剂①，吹干后，再喷试剂②。精氨酸或
其他胍类物质显桔红色。
2．胱氨酸和半胱氨酸的显色
试剂：①1.5g 亚硝基铁氰化钠（Na2Fe(CN)5NO2•5H2O）溶于5mL 2mol/L H2SO 4 溶液
中，加95mL 甲醇。此时会有沉淀产生，可保存一个月以上。使用时在每100mL 上述溶液
中加10mL 28%氨水，过滤除去沉淀，清液仅能保持一天左右。②2g 氰化钠溶于5mL 水中，
然后加95mL 甲醇。此时有沉淀产生，使用时只需摇匀即可。
显色步骤：半胱氨酸的显色：在滤纸上喷以试剂①的清液，5min 后半胱氨酸显红色。
胱氨酸的显色：先将滤纸浸入试剂②，迅速取出，稍等片刻再喷试剂甲的清液，5min 后胱
氨酸显红色。也可以把试剂②配制的浓度增加一倍，在显色前混和，再喷到滤纸上。
3．甘氨酸的显色
试剂；0.1g 邻苯二甲醛溶于100mL 77%乙醇中。
显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂，甘氨酸显墨绿色，在汞灯（365nm）下显巧克力
棕色。吲哚醌显色后，再用此试剂仍有效。以甘氨酸为N 端的小肽也能显色，但其N 端被
保护后，以及其他氨基酸均不显色。
4．脯氨酸的显色
试剂：1g 吲哚醌和1.5g 醋酸锌，1mL 醋酸，5mL 蒸馏水混和，再加入95mL 异丙醇。
新鲜配制。
显色步骤：层析滤纸除尽溶剂，喷上以上试剂，80℃～85℃烘箱内放置30min，脯氨酸
显蓝色，再以30℃温水漂洗除去多余的试剂后，背景为白色或浅黄色。
也可剪下脯氨酸斑点，在试管中加入5mL 水饱和酚，在黑暗中洗脱15min，间歇振摇，
于610nm 测定其吸光度。从已知标准曲线即可求得样品内脯氨酸含量，测定范围5～20μg。
5．丝氨酸和羟赖氨酸的显色
试剂：①0.035mol/L 过碘酸钠（748mgNaIO4 溶于数毫升甲醇中，加2 滴6mol/L 盐酸，
再用甲醇稀释至100mL）。②15g 醋酸铵加0.3mL 冰醋酸，加1mL 乙酰丙酮，用甲醇稀释到
100mL。
显色步骤：点有样品的滤纸吹干，先喷试剂①，近干后再喷试剂②，室温放置 2h，紫
外灯下照射0.5h，丝氨酸和羟赖氨酸呈黄色斑点，在紫外线下都有荧光。
6．羟脯氨酸的显色
试剂：①1g 吲哚醌溶于100mL 乙醇及10mL 冰醋酸。②1g 对二甲胺苯甲醛溶于100mL
的丙酮浓盐酸（9＋1）混合液中。（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增深发黑，灵敏度降
低，故用时新鲜少量配制。
显色步骤：将待鉴定的溶液点于小方块纸上，干后先点上试剂①，热风吹干。这时纯
羟脯氨酸呈墨绿色，纯脯氨酸呈深蓝色（极灵敏），对其他氨基酸呈程度不同的紫红色（不
太灵敏）；然后再点上试剂②吹干，如溶液中含有羟脯氨酸即转变为玫瑰红色，而其他氨基
酸与吲哚醌所生成的颜色则褪去。
7．色氨酸的显色
(1)第一种方法
试剂：1g 对二甲氨基苯甲醛加90mL 丙酮，10mL 浓盐酸。新鲜配制。
显色步骤：点有样品的滤纸干燥后，喷上以上试剂，在室温下放置几分钟后，色氨酸
显蓝色或紫红色。茚三酮显色后，仍可使用本法。
(2)第二种方法：
试剂：10mL 35%甲醛加10mL25%盐酸，20mL 无水乙醇。
显色步骤：点有样品的滤纸喷上以上试剂后，100℃烘5min，色氨酸在长波长紫外光下
呈现荧光（黄-橙-带绿色）。
8．酪氨酸的显色
试剂：①0.1%α-亚硝基β-萘酚的95%乙醇溶液。②10%硝酸水溶液。
显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂①后，吹干，再喷试剂②，然后在100℃烘3min，
酪氨酸或含酪氨酸的多肽在浅灰绿色的背景上显红色，0.5h 后转变为桔红色，其后渐退去。
灵敏度1～2μg 酪氨酸。茚三酮显色后，再用此试剂处理，仍能显色，茚三酮所显出的紫红
色斑点变成红色。
9．酪氨酸和组氨酸的显色——pauly 反应
试剂：①4.5g 对氨基苯磺酸与45mL 12mol/L 盐酸共热溶解，以蒸馏水稀释至500mL。
用时取出30mL，在0℃与等体积的5%亚硝酸钠水溶液相混合。（室温放置太长会失效）
②10%碳酸钠水溶液。
显色步骤：点有样品的滤纸上喷试剂①，片刻后再喷试剂②。组氨酸及含组氨酸的多
肽显桔红色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽显浅红色。
第六节 氨基酸定量测定
一、氨基酸的一般定量测定
（一）甲醛滴定法
1．原理
氨基酸具有酸性的-COOH 基和碱性的-NH2 基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内
盐。当加入甲醛溶液时，-NH2 基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用标准强碱
溶液来滴定-COOH 基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式（有三种不同的推论）如
下：
2．方法特点及应用
此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此
法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此
作为控制发酵生产的指标之一。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪
氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反
应，往往使结果偏高。
3．操作方法
吸取含氨基酸约 20mg 的样品溶液于100mL 容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0mL
置于200mL 烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定至
酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液mL 数，供计算总酸含量。
加入10.0mL 甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消
耗氢氧化钠标准溶液毫升数。
同时取 80mL 蒸馏水置于另一200mL 洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至pH8．2，
（此时不计碱消耗量），再加入10.0mL 中性甲醛溶液，用0.05mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定
至pH9.2，作为试剂空白试验。
4．结果计算
氨基酸态氮质量分数（%）=
式中：V1——样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（pH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液
的体积，mL；
V2——空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL；
c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；
m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g；
0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmoL。
5．说明
①本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。②浑浊和色深样液可不经处
理而直接测定。
(二)茚三酮比色法
1．原理
氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），
可用吸光光度法测定。
该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为 570nm，故据此
可以测定样品中氨基酸含量。
2．操作方法
(1)标准曲线绘制
准确吸取 200μg /mL 的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相当于
0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加
水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH 为8.04）各
1mL，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15min
后，在570nm 波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克
数为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)样品测定
吸取澄清的样品溶液 1～4mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A 值，
用测得的A 值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。
3．结果计算
氨基酸含量（mg/100g）=
式中：c——从标准曲线上查得的氨基酸的质量数，μg；
m——测定的样品溶液相当于样品的质量，g。
4．说明及注意事项
①通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品 5～10g 或吸取样液样品5～10mL，
置于烧杯中，加入50mL 蒸馏水和5g 左右活性炭，加热煮沸，过滤，用30～40mL 热水洗
涤活性炭，收集滤液于100mL 容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。
②茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行
纯化，具体操作可参阅黄伟坤等编着《食品检验与分析》。
(三)非水溶液滴定法
1．原理
氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。根据酸
碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱；弱碱在酸性溶剂中碱
性显得更强，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强，因此本来在水溶液中不能滴定的弱碱或弱
酸，如果选择适当的溶剂使其强度增加，则可以顺利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中
呈现中性，而在冰醋酸中就能接受质子显示出碱性，因此可以用高氯酸等强酸进行滴定。
本法适合于氨基酸成品的含量测定。允许测定的范围是几十毫克的氨基酸
2．测定
(1)直接法（适用于能溶解于冰醋酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品50mg 左右，溶解
于20mL 冰醋酸中，加2 滴甲基紫指示剂，用0.100mol/L 高氯酸标准液滴定（用10mL 体积
的微量滴定管），终点为紫色刚消失，呈现蓝色。空白管为不含氨基酸的冰醋酸液，滴定至
同样终点颜色。
(2)回滴法（适用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样
品30～40mg 左右，溶解于5mL0.1mol/L 高氯酸标准溶液中，加2 滴甲基紫指示剂，剩余的
酸以醋酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不褪的紫色为终点。
3．说明
(1)能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法测定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、组
氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。不易溶解于冰
醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法测定的有：赖氨酸、丝氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。
(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以将样品溶解于2mL 甲酸中，再
加20mL 冰醋酸，直接用标准的高氯酸溶液滴定。
(四)邻苯二甲醛法(OPT 法)
1．原理
邻苯二甲醛在 2-巯基乙醇存在下，于碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适
的激发光和发射光波长分别为340 和455nm。可能产物为：
各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，
异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨
酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸，和半胱氨酸。
本法可用于测定游离氨基酸的含量。灵敏度较茚三酮法约高 100 倍以上，可测到0.1～
1×10－4mol 氨基酸。如用于血清中α-氨基氮的测定，每次血清用量只需5～10μL。与另一
种荧光试剂（萤光胺）一样，空白无荧光，只有与氨基酸结合才产生荧光。缺点是与脯氨酸
不产生荧光，邻苯二甲醛与半胱氨酸荧光值太低。荧光胺已有用于氨基酸自动分析定量分析，
但由于试剂昂贵及个别氨基酸反应不满意，目前还未普遍应用。
(五)三硝基苯磺酸法
三硝基苯磺酸（TNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。TNBS 在偏碱性的条件下
与氨基酸反应，先形成中间络合物，如下式所示：
中间络合物在光谱上有二个吸收值相近的高峰，分别位于355nm 和420nm 附近。然
而溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420nm 处的吸收值
显着下降，而350nm 附近的吸收峰则移至340nm 处。
利用 TNBS 与氨基酸反应的这一特性，可在420nm 处（偏碱性溶液中）或在340nm
（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。下表列出各种氨基酸与TNBS 反应后在不同条
件下测定的吸光度。在340nm 处，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 处的吸光度
因氨基酸种类而异；在加入适量SO3
2－时，吸收值升高。
本法允许的测定范围是 0.05～0.4μmol 氨基酸。
表 10-3 各种氨基酸与TNBS 反应后在不同条件下测定的吸光度
氨基酸种类 碱性溶液① 酸性溶液加 SO3
①取不同含量氨基酸液1mL，加4%NaHCO3 1mL，0.1%TNBS 1mL，于40℃反应2h，用水补充至4mL，
在420nm 处测定。制作氨基酸浓度—吸光度坐标图，从曲线中求得各氨基酸于1μmol 时的吸光度。
②条件同上，但在与TNBS 反应时加0.01mol/L Na2SO3 1mL，最后总体积也是4mL，同样在420nm 处
测定。
③条件同①，但与 TNBS 反应后加1mol/L HCl 1mL 酸化，在340nm 处测定。
(六)乙酰丙酮和甲醛荧光法
1．原理
氨基酸与乙酰丙酮和甲醛反应，生成 N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙酰基1,4-二氢吡啶，
产生黄-绿色荧光，可用荧光分析法检测。主要反应如下：
乙酰丙酮 甲醛 氨基酸 荧光物质
2．试剂
混合试剂：取1mol/L 乙酸钠溶液10mL，加入乙酰丙酮溶液0.4mL 和30%甲醛溶液1mL，
用水稀释至30mL。
3．测定
取氨基酸液 1mL，加入混合试剂1mL，用棉花塞满试管口，避光于100℃下加热10min，
冷却，加水2mL，然后测定荧光值。
表 10-4 各种氨基酸的发射波长和检测范围
化合物（激发波长405nm） 发射波长（nm） 检测范围（mg/L）
甘氨酸 485 2～10
苯丙氨酸 490 8～40
丝氨酸 485 5～25
半胱氨酸（盐酸盐） 500 20～100
谷氨酸 485 20～100
与标准相比较求出样品中的氨基酸含量。
二、个别氨基酸的定量测定
（一）赖氨酸的测定
1．原理
用铜离子阻碍游离氨基酸的α-氨基,使赖氨酸的ε-氨基可以自由地与1-氟-2,4 二硝基
苯(FDNB)反应,生成ε-DNP-赖氨酸。经酸化和用二乙基醚提取,在波长390nm 处有吸收峰,
从而求出样品中游离赖氨酸的含量.
2．试剂
(1)氯化铜液：称28.0g 无水氯化铜，用水稀释至1000mL。
(2)磷酸三钠溶液：称68.5g 无水磷酸钠,用水稀释至1000mL。
(3)硼酸盐缓冲液（pH9.1～9.2）：称54.64g 带有10 结晶水的四硼酸钠，用水稀释至
1000mL 。
(4)磷酸铜悬浮液：搅拌情况下，把氯化铜液200mL，缓慢倒入400 mL 的磷酸三钠溶液
中，把悬浮液以2000r/min 速度离心5min ，用硼酸盐缓冲液再悬浮沉淀物，洗涤离心3 次，
把最后的沉淀物悬浮在硼酸盐缓冲液中，并用缓冲液稀释至1L。
(5)1-氟-2，4 二硝基苯(FDNB)溶液：吸取FDNB10mL 用甲醇稀释至100mL。
(6)赖氨酸-HCl 标准溶液：称取一定量赖氨酸-HCl，用水配成200mg/L 的工作标准液。
(7)100g/L 丙氨酸溶液。
3．测定
(1)称取通过40 目筛的均匀试样1.00g，置于100mL 烧瓶中。另吸取赖氨酸-HCl 标准工
作液5mL（相当1mg 赖氨酸-HCl），连同试剂空白同时进行试验。
(2)向各烧瓶中加入25mL 磷酸铜悬浮液，然后再加10%丙氨酸1.0mL,振摇15min。吸
取10%FDNB 溶液0.5mL.置于各处理烧瓶中,将烧瓶置沸水中加热15min。
(3)取出烧瓶,立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,并不断摇动使之酸化和分散均匀。
(4)烧瓶中的溶液冷却至室温,用水稀释至100mL.取约40mL 悬浮液进行离心。
(5)用25mL 二乙基醚提取上清液3 次，除去醚。并将溶液收集于有刻度试管中,于65℃
水浴中加热15min，以除去残留的醚。并记录溶液的毫升数。
(6)吸取上述各处理液10mL，分别与95%乙醇溶液10mL 混合，用滤纸过滤。
(7)用试剂空白液凋零，测定样液A390nm，与赖氨酸-HCl 标准液对照，求出样品中赖氨
酸-HCl 的含量。
本法在 0～40mg/L 赖氨酸溶液范围内呈良好线性关系。
4．说明
(1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加总氨基酸的浓度，有助于赖氨酸-HCl 浓度
具有良好的线性关系。
(2)用醚提取酸性溶液，可将所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，并把FDWB
的产物破坏，否则这些产物在390nm 处存在干扰。
（二）色氨酸的测定
1.原理
样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生
成哈尔满化合物（norharman），具有特征荧光值，可以进行定量测定。
2．试剂
(1)0.3mmol/L 三氯化铁-三氯乙酸溶液：称取三氯化铁(FeCl3•6H2O)41mg，加入10%三
氯乙酸溶液溶解并定溶至500mL。
(2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%～38%)5.5mL，加水至100mL。
(3)色氨酸标准溶液：称取10mg 色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解并定容至100mL,
置棕色瓶中备用,使用时用水稀释成1mg/L 的标准溶液.
3．测定
称取样品粉末 100～200mg 于离心管中，加入4mL 乙醚,摇匀后过夜，以3000r/min 速
度离心。将乙醚提取液移入试管内,并用乙醚洗涤残渣3 次，收集乙醚液于试管中，于40℃
水浴除去醚。残留物中加入6.25mol/L N aOH 4mL，火焰封口，于110℃水解16～24h。水
解液用4mol/L HCl 溶液调节至pH6～8 后,用水定容至50mL,过滤备用。
吸取滤液 0.2mL，加入2%甲醛0.2mL 和0.3mmol/L 三氯化铁-三氯乙酸混合液2mL，
摇匀后于100℃水浴中加热1h，取出，冷却后用水定容至10mL。在激发波长为365nm，发
射波长449nm 条件下，测定样品的荧光强度，与色氨酸标样作对照，求出样品中色氨酸含
量。
本法在 0～10mg/L 色氨酸溶液范围内呈良好线性关系。

‘玖’ 食品中氨基酸态氮测定的方法有哪些

凯氏定氮法、全自动凯氏定氮仪、液相、红外

‘拾’ 青贮饲料中氨态氮的测定方法

一、目的与原理：

1、了解掌握单指示剂与双指示剂甲醛滴定法测氨态氮总量的方法与原理：

二、单指示剂甲醛滴定法：

(一)原理：氨基酸具有酸、碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基显示酸性，又含有-NH2基显示碱性。由于这二个基的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反应式可能以下面三种形式存在。

（二）试剂

(1)40％中性甲醛溶液，以麝香草酚酞为指示剂，用1N NaOH溶液中和。

(2)0.1％麝香草酚酞乙醇溶液。

(3)0.100N氢氧化钠标准溶液。

(三)操作步骤：

称取一定量样品(约含20毫克左右的氨基酸)于烧杯中(如为固体加水50毫升)，加2-3滴指示剂，用0.1OON NaOH溶液滴定至淡蓝色。加入中性甲醛20毫升，摇匀，静置1分钟，此时蓝色应消失。再用0.1OON NaOH溶液滴定至淡蓝色。记录两次滴定所消耗的碱液毫升数，用下述公式计算

计算：

氨基酸态氮(％)=( N V×0.014×100)/W

式中：

N：NaOH标准溶液当量浓渡。

V：NaOH标准溶液消耗的总量(m1)

W：样品溶液相当样品重量(克)。

0.014：氮的毫克当量。

三、双指示剂甲醛滴定法：

(一)原理：

与单色法相同，只是在此法中使用了两种指示剂。从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂，不作介绍)相近单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液PH值作为麝香草酚酞的终点。PH值在9.2，而双指示剂是以氨基酸溶液的PH值作为中性红的终点，PH值为7.0，从理论计算看，双色滴定法较为准确。

(二)试剂：

(1)三种试剂同单指示剂法

(2)0.1％中性红(50％乙醇溶液)

(三)操作步骤：

取相同的两份样品，分别注入100毫升三角烧瓶中， 一份加入中性红指示剂2-3滴，用0.100N NaOH溶液滴定终点(由红变琥珀色)，记录用量，另一份加入麝香草酚酞3滴和中性甲醛20毫升，摇匀，以0.100NNaOH准溶液滴定至淡蓝色。按下述公式计算。

计算：

氨基酸态氮(％)=( N(V2-V1)×0.014)/W×100

式中：

V2：用麝香草酚酞为指示剂时标准碱液消耗量(毫升)

V1：用中性红作指示剂时碱液的消耗量(m1)。

N：标准碱液当量浓度。

W：样品的重量(克)。．

0.014：氮的毫克当量。

注意事项：

测定时样品的颜色较深，应加活性炭脱色之后再滴定．