常用于载体前药的制备方法

① 前体药物的载体药物

载体前体药物是指具有活性的化合物与其运输作用的载体通过共价键结合，在体内通过简单的水解作用卸掉载体，由活性化合物发挥药理作用。载体前体药物与母体化合物相比往往活性微弱或无活性。对于载体的结构，多是亲脂性，要求对生物体无害，且能及时释放活性化合物。市场上口服青霉素类药物往往采用载体前药的方式来提高生物利用度。

② 纳米药物载体的制备工艺及其原理

通常，NP的制备方法根据NP形成的原理的不同可以分为两种，即单体聚合法和聚合物分散法。

③ 前药 一般制备方法有哪些

一种具有靶向和增效的氟尿嘧啶前药，具体的说，涉及含碳链硒代的氟尿嘧啶前药。与底物相比，氟尿嘧啶前药对癌细胞抑制作用更具有靶向性，能显着提高药物疗效，并大大降低氟尿嘧啶的毒性,氟尿嘧啶前药还具有良好的亲水亲脂性，能提高底物的生物利用度。

④ T载体如何制备

用限制性内切酶制备T载体
陆哲明,柯杨△[北京大学临床肿瘤学院(北京市肿瘤防治研究所)遗传室,北京100034]
[关键词]T载体;DNA限制酶类;遗传载体;基因扩增[摘要]
目的:介绍一种制备T载体的方法。方法:用限制性内切酶XcmⅠ酶切,在两端产生T末端,制备的T载体可直接用来克隆用TaqDNA聚合酶产生带A末端的PCR产物。结果:PCR产物直接和T载体连接,用常规氯化钙法制备的感受态菌转化,对转化子提取质粒进行酶切鉴定,证明阳性率达80%。结论:制备T载体过程简单,质量稳定,产量高,并可扩增等优点。
[中图分类号]Q342[文献标识码]A[文章编号]1671 167X(2002)06 0726 03

PCR是目前体外DNA扩增最常用的方法,对PCR产物进行快速有效的克隆是开展下游许多实验所要求的。目前TA克隆是一种快速的,一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的方法。而商品化的TA克隆系统由于售价高,质量批次间不稳定且无法进行循环使用等缺点,在实际应用中,限制了T载体的广泛使用。本文介绍了一种简单、高效,可在普通实验室中制备并可反复扩增的T载体制备方法,并经PCR产物克隆,酶切鉴定,得到了非常理想的结果。
1材料与方法1
.1制备SuperpGEM Teasy载体(简称pSP Teasy载体)1
.1.1制备pSP Teasy环化载体以线性化的pGEM Teasy载体(Promega为模板,两边设计引物:
F:
HindⅢXcmⅠG
AATTCGCG
R:
HindⅢXcmⅠC
CGCGGCCGCCA
引物的5′端各插入HindⅢ和XcmⅠ位点,3′端与模板互补,在PfuDNA聚合酶的作用下扩增,扩增产物经HindⅢ酶切后,自身环化,挑选能被HindⅢ酶切的克隆即为阳性克隆,经测序进一步证实。
1.1.2制备pSP Teasy线性化载体按照标准酶切体系,用XcmⅠ(NEB)酶切,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,玻璃奶回收,测量吸光度值(D260),调整质量浓度至50mg·L-1,此载体可直接用于克隆。
3讨论PCR技术是目前体外扩增DNA最常用的方法。有时需得到克隆化的DNA以便于杂交分析、高质量测序及从复杂PCR产物中分离目的片段。常用的方法有非定向克隆和定向克隆。定向克隆需在引物5′端引入限制性内切酶位点,PCR产物经适当内切酶酶切后产生粘端,连接到相应载体。非定向克隆有两种策略,一种是平末端克隆,在klenow和T4DNA聚合酶作用下修平PCR产物末端,但连接效率仅为粘端连接的1/50,且自身环化率高[1];另一种是TA克隆。TA克隆是一种快速的,一步到位的非定向克隆法,可以把PCR产物直接插入到质粒载体。TA克隆系统利用TaqDNA聚合酶的末端转移酶活性,在扩增DNA3′末端非模板依赖地加上一个核苷酸,通常为腺苷酸[2]。这个3′A突出端被用于把PCR产物插入到插入位点有一个3′T突出端的载体。制备好的载体,其关键部分是带有3′T突出端的线性分子。目前制备3′T载体的方法是先用平末端限制性内切酶(如EcoRⅤ)酶切载体,再用TaqDNA聚合酶在仅有dTTP的情况下,72～75℃反应,在3′末端添加一个T[1,3]。但是,实际反应过程中,由于3′末端加T为非优先聚合核苷酸,仅部分的3′端可添加T,或者有少量可能添加一个以上T,造成载体在克隆过程中自身环化高,必然增加筛选阳性克隆的难度。另外,每次生产T载体产量有限(一般为1μg),不适于大规模生产,造成批次间质量差异大。即使商品化TA克隆试剂盒也存在阳性率低和质量不稳定的缺点。因其价格昂贵,并且无法进行循环使用,在普及上存在一定困难。利用限制性内切酶制备T载体利用限制性内切酶特异性强,一次酶切产量高,质量稳定,易于操作等特点。在内切酶家族中,有一类称可变酶,它们的识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的,如本文采用的XcmⅠ,它识别序列见图3a,在构建pSP Teasy载体时,利用其中间序列可变,在靠近T7启动子端,设计了XcmⅠ的识别序列见图3b,而在靠近SP6启动子端XcmⅠ的识别序列见图3c,这样在XcmⅠ酶切后,其剩余的序列如图1,在3′端分别产生T。经查NewEnglandBiolabs公司的目录,符合上述特征的酶列于表1。

我们在两个XcmⅠ之间引入HindⅢ位点有下列优点:(1)在构建pSP Teasy时提供方便;(2)经HindⅢ酶切后,可以防止载体中的XcmⅠ位点不完全酶切造成的自身环化;(3)两个XcmⅠ位点之间,提供保护的碱基,便于XcmⅠ酶切。用于克隆的PCR产物在连接前需经琼脂糖凝胶电泳,如条带锐利,则一般无需纯化即可直接用于连接;如产物有非特异扩增或引物二聚体浓度较高,最好先用低熔点胶或玻璃奶法纯化。如果扩增用具有保真功能的聚合酶,如PfuDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶或TliDNA聚合酶,由于它们有3′～5′的外切酶活性,则PCR产物为平末端,需经纯化后用TaqDNA聚合酶在dATP存在下72℃加腺苷酸尾15～30min,即可达到相同效果。插入片段(PCR产物)与载体摩尔比一般要求在3∶1～1∶3之间,但按笔者经验,摩尔比不经优化亦可产生较好克隆效果,可能与pSP Teasy在原理上无法自身环化有关。pSP T是在Promega公司pGEM Teasy载体基础上构建而成的,它具有原载体的优点[4]:(1)用T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶可正反两方向体外转录RNA;(2)载体克隆位置的两侧各有EcoRⅠ、NotⅠ和BstZⅠ等酶切位点,便于用单一酶切鉴定;(3)T7、SP6和M13等通用序列,便于测序。新的pSP Teasy不仅保留原载体所有的优点外,还具有(1)末端加有T的载体含量高,因为以往所加T为合成反应添加,不能保证每个末端均有T。而用内切酶法,利用其特异性识别酶切位点的特点,并经HindⅢ处理XcmⅠ酶切不完全的载体,则在原理上保证自身无法环化且均能产生T末端;(2)由于采用内切酶法,保证了质量的稳定性;(3)产量大,每次可产生10～20μg,而经典方法仅1～5μg;(4)方法简单,成本低廉,适合普通实验室制备。只需一步酶切,纯化后即制备完毕,步骤简单且耗时少。而传统方法需经酶切,纯化,加T,再纯化等步骤;(5)环化T载体可以扩增后循环使用。以上特有优点保证了克隆效果稳定,阳性率高。
(a)CCANNNNN NNNNTGGGGTNNNN▲NNNNNACC
(b)CCAGGTCT AGACTGGGGTCCAGATCTGACC
(c)CCAGGTCA AGACTGGGGTCCAG▲TTCTGACC

(a)RecognitionsiteofXcmⅠ;
(b)5′ endrecognitionsiteofXcmⅠ;
(c)3′ endrecognitionsiteofXcmⅠ.
图3在不同部位XcmⅠ识别序列Ⅰatdifferentsite

⑤ 片剂的制备方法有哪些各方法适用于哪些药物的制备

片剂的制备方法直接压片法、湿法制粒、干法制粒,因为湿法在国内运用最多，且大都比较纯熟。

干法制粒只用于湿法不能解决的，比如说原料对湿热不稳定、湿法无法控制其溶出等等，直接压片法国外比较提倡，因为其制备工艺较为简便。

由原药、填料、吸附剂、黏结剂、润滑剂、润湿剂、崩解剂、香料、色料等组成。先将物料粉碎、造粒，干燥，再用压片机制成片状，也有的不需造粒和干燥，直接压成片剂。

(5)常用于载体前药的制备方法扩展阅读：

片剂是在丸剂使用基础上发展起来的，它创用于十九世纪40年代，到19世纪末随着压片机械的出现和不断改进，片剂的生产和应用得到了迅速的发展。

近十几年来，片剂生产技术与机械设备方面也有较大的发展，如沸腾制粒、全粉末直接压片、半薄膜包衣、新辅料、新工艺以及生产联动化等。

中药片剂的研究和生产仅在50年代才开始，随着中药化学、药理、制剂与临床几方面的综合研究，中药片剂的品种、数量不断增加，工艺技术日益改进，片剂的质量逐渐提高。

⑥ 前药的名词解释

前药是指一些在体外活性较小或者无活性的化合物，在体内经过酶的催化或者非酶作用，释放出活性物质从而发挥其药理作用的化合物，其常常指将活性药物（原药）与某种无毒性化合物以共价键相连接而生成的新化学实体。 即前体药物。指用化学方法合成原有药物的衍生物，这种衍生物在机体内能转化成原来药物而发挥作用。因此，前...体药物又可称为生物可逆性衍生物。 前药的分类： 一类是载体前体药物（carrier-prodrug，简称载体前药）；另一类是生物前体药物（bioprecursors )。生物前体药物大部分不是人为修饰的，而是在研究作用机制时，发现其作用过程是经体内酶催化代谢而产生活性物质。如非甾体抗炎类药物舒林酸（sulindac）就是典型的生物前体药，舒林酸本身没有活性，在体内还原酶的作用下由亚砜转为硫化物形式产生抗炎活性。 前药应具备以下三个条件： （1）根据具有生物活性的药物分子性质，按治疗需要进行化学改造； （2）进入机体后，不论是否需要酶的作用，要保证恢复原来的药物分子； （3）本身不显示生物活性。 前药的特征： 原药分子的载体的联结一般是共价键；前药应无活性或低于原药的活性；前药的合成简单易行，且载体分子价廉易得；原药与载体的联结在体内经酶反应或酶促反应可以裂解；前药在体内产生原药事快速动力学过程。 前药的作用： 利用前药原理修饰先导化合物，不能增加其活性。但前药设计可以改变药物的物理化学性质，或提高药物对靶部位作用的选择性；改善药物在体内的吸收，分布，转运与代谢等药代动力学过程，或延长作用时间，或提高生物利用度；改善药物的理化性质和消除不良气味；降低药物的毒副作用；提高作用部位的特异性，有利于药物与受体或酶的相互作用；延长作用时间；发挥药物的配伍作用。 前药的制备方法： 羧酸类化合物，醇类化合物或酚类化合物形成酯；胺类化合物形成酰胺等等。

⑦ 什么是载体连接前药

就是载体连接前药
前体药物（prodrug），也称前药、药物前体、前驱药物等，是指经过生物体内转化后才具有药理作用的化合物。前体药物本身没有生物活性或活性很低，经过体内代谢后变为有活性的物质，这一过程的目的在于增加药物的生物利用度，加强靶向性，降低药物的毒性和副作用。目前前体药物分为两大类：载体前体药物(carrier-prodrug)和生物前体(bioprecursor)。此外农药中也有许多前体药物。
载体前体药物是指具有活性的化合物与其运输作用的载体通过共价键结合，在体内通过简单的水解作用卸掉载体，由活性化合物发挥药理作用。载体前体药物与母体化合物相比往往活性微弱或无活性。对于载体的结构，多是亲脂性，要求对生物体无害，且能及时释放活性化合物。市场上口服青霉素类药物往往采用载体前药的方式来提高生物利用度。