提取核酸的常用技术原理及方法试题

⑴ RNA的提取方法步骤及原理.

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:

Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。

Trizol作用原理:

在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。

水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

(1)提取核酸的常用技术原理及方法试题扩展阅读

与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。

RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。

在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。

⑵ 核酸提取仪的主要步骤及方法

1. 环境温度：5℃～40℃；环境相对湿度；电压：50%~80%范围：100～240Vac，50/60 Hz。
2. 将仪器放在水平实验台上。
3. 放置仪器时应保证仪器周围10cm内无障碍物；多台仪器同时使用时，每台仪器之间的距离应不小于50cm。
4. 仪器主机通电之前，必须先用六角扳手取下磁棒架固定螺丝，否则通电运行将会损坏仪器。
5. 96孔板和磁力棒套的安装必须与对应的卡槽完全契合。
6. 请勿将该仪器安放在过度潮湿、高温或阳光直射等温度变化剧烈的区域，这可能会影响仪器的性能。
7. 请勿和其它大功率器件如离心机、空调等共用同一电源插座以免电源电压波动影响系统运行。
8. 请将适配器连接到仪器，把适配器与电源插座相连，并打开仪器开关。
9. 请勿在有潜在有害液体或气体的环境中操作该仪器。
10. 本仪器详细操作步骤，请参阅以下的说明。
1.5注意事项
1. 仪器应放在湿度低、灰尘少并远离水源的地方，室内应通风良好，仪器后方勿紧靠墙壁或堆放其他物品，以免影响散热。
2. 实验运行过程中禁止直接关闭电源开关。如果需要提前停止实验，请先在触屏软件上点击停止运行并确认后再关闭电源。
3. 裂解孔、洗涤孔和洗脱孔的样本体积应在50μL-1000μL，避免体积过多，溢出孔位。
4. 机器运行及测试进行时，请勿触摸加热条，以免烫伤。
5. 紫外灯开启灭菌时，请勿直视紫外光。
6. 移动仪器之前，请先切断电源，再用螺钉固定磁棒架。
7. 仪器长期不使用时，请拔掉插头，并用软布或塑料袋覆盖仪器，以防止灰尘进入。
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⑶ 核酸含量的测定方法及原理都有哪些

核酸定量常用方法及原理如下：
1、光吸收法：核酸中碱基共轭结构在近紫外光波长260nm处有最大吸收，吸收强度与核酸浓度成正比，因此可以用于核酸定量。
2、定P法：核酸中P含量约为9.5%，因此可以通过测定样品中的有机P量来进行核酸定量。
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。
核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA）。

⑷ 核酸检测的原理是什么

核酸检测其实是检测受测者体内是否有新冠病毒的核酸（RNA）。每种病毒的核酸内部都含有核糖核苷酸，不同的病毒所含的核糖核苷酸数量和排列顺序不同，使得每种病毒都具有特异性。

新冠病毒的核酸也是独特的，核酸检测就是对新冠病毒的核酸进行特异性检测。在进行核酸检测之前，需要采集受测者的痰液、咽拭子、肺泡灌洗液、血液等样本，对这些样本进行检测，就可以发现受测者的呼吸道感染了什么病菌。新冠病毒核酸检测常用的是咽拭子样本检测，将样本裂解提纯，从中提取出可能存在的新冠病毒核酸，检测的准备工作就做好了。

新冠病毒核酸检测主要用荧光定量RT-PCR技术，这种技术是荧光定量PCR技术与RT-PCR技术的结合。在检测过程中，先采用RT-PCR技术将新冠病毒的核酸（RNA）逆转录为对应的脱氧核糖核酸（DNA）；再采用荧光定量PCR技术，将得到的DNA进行大量复制，同时，使用特异性探针对复制得到的DNA进行检测，打上标记。

如果存在新冠病毒核酸，仪器就可以检测到荧光信号，而且，随着DNA的不断复制，荧光信号不断增强，这样就间接检测到了新冠病毒的存在。

核酸检测为阳性不一定是确诊

核酸检测结果呈阳性，就可以确认受测者上呼吸道存在病毒核酸，但并不能直接确诊为新冠肺炎患者。在核酸检测为阳性的情况下，还要综合流行病学史对受测者进行进一步的诊断，如果受测者还有发热、咽痛、咳嗽、乏力等症状，以及与已确诊的感染者有接触史等，就可以诊断为确诊病例。

如果受测者没有任何相关症状，一般诊断为无症状感染者。无症状感染者也有传染性，而且一些无症状感染者后来也开始出现症状，变成了确诊患者。

以上内容参考 潇湘晨报—核酸检测的原理到底是什么？为什么会出现假阴性？

⑸ 核酸提取仪原理

1. 根据仪器型号大小不同划分 [1] 
1) 自动液体工作站
自动液体工作站是功能非常强大的设备，液体分液、吸液等自动完成，甚至能通过整合扩增、检测等功能，实现标本提取、扩增、检测全自动化。提取核酸只是其功能的一个应用，不太适合常规实验室提取核酸，一般都应用在单一类标本并且一次提取标本量非常大(至少96个，一般几百个)的实验需求上。自动工作站的平台建立及平台的运作，需要比较大的资金。
2) 小型自动核酸提取仪
小型的自动化仪器是通过运行结构的特殊性来达到自动提取核酸的目的，可以在任何实验室得到应用。
2. 根据提取原理不同划分
1) 采用离心柱法的仪器
离心柱法核酸提取仪主要采用离心机和自动移液装置相结合的方法，通量一般在1-12个样本，操作时间和手工提取差不多，并不能提高实际工作效率，且价格昂贵，不同型号仪器的耗材也不能通用，仅适合经费充足的大型实验室使用。
2) 采用磁珠法的仪器
以磁珠为载体，利用磁珠在高盐低PH值下吸附核酸，在低盐高PH值下与核酸分离的原理，再通过移动磁珠或转移液体来实现核酸的整个提取纯化过程。由于其原理的独特性，所以可设计成很多种通量，既可以单管提取，也可以提取8-96个样本，且其操作简单快捷，提取96个样本仅需30-45min，大大提高了实验效率，且成本低廉，因而可以在不同实验室使用，是目前市场上的主流仪器。

磁珠法核酸提取仪的基本原理
磁珠法核酸提取仪一般分为抽吸法和磁棒法两种 [2]  ：
1. 抽吸法，也叫移液法，是通过固定磁珠、转移液体来实现核酸的提取，一般通过操作系统控制机械臂来实现转移。提取过程如下:
1) 裂解：在样品中加入裂解液，通过机械运动及加热实现反应液的混匀及充分反应，细胞裂解，释放核酸。
2) 吸附：在样品裂解液中加入磁珠，充分混匀，利用磁珠在高盐低PH值下对核酸具有很强亲和力的特点，吸附核酸，在外加磁场作用下，磁珠与溶液分离，利用吸头将液体移出弃至废液槽，吸头弃掉。
3) 洗涤：撤去外加磁场，换用新吸头加入洗涤缓冲液，充分混匀，去除杂质，在外加磁场作用下，将液体移出。
4) 洗脱：撤去外加磁场，换用新吸头加入洗脱缓冲液，充分混匀，结合的核酸即与磁珠分离，从而得到纯化的核酸。

⑹ DNA提取的步骤及原理

酚-氯仿法提取人外周血基因组DNA的基本原理是什么？
答：蛋白质对DNA制品的污染常常影响到以后的DNA操作过程，因此需要把蛋白质除去。一般采用苯酚/氯仿抽提的方法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚/氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相。
取ACD抗凝血2~3ml，置于15ml的离心管内----加灭菌生理盐水至10ml，颠倒混匀，3000rpm，离心10min-----弃上清，重复步骤2两至三次，直至上清呈无色或微红色----加压积红细胞5.5倍的溶血试剂，混匀，放置-20℃冷溶10min后移至4℃，30min，直至溶液由红色悬液变成红棕色清亮溶液-----3000rpm，离心15min，倒扣离心管于滤纸，使管壁液体流尽-----依次加入STE 450 ml，用枪头吹打混匀后，加入蛋白酶K至终浓度100mg/ml，然后加入10% SDS 25 ml，混匀后移至1.5ml EP管，放置于37℃水浴过夜或56℃，3h----加入等体积饱和酚（约500ml），漩涡振荡器上混匀至溶液呈乳滴状，13000rpm，离心5min。------取上清，加入500μl酚/氯仿（等体积配制混合液），漩涡振荡混匀，13000rpm，离心10min。---------取上清，加入500μl氯仿/异戊醇（24：1混合），漩涡振荡混匀，13000rpm，离心10min。-------取上清，加入50μl物NaAc（1/10体积），混匀后再加入1ml 冰冻的无水乙醇，颠倒轻摇，即可见絮状的DNA沉淀，13000rpm，离心10~20秒，得到DNA沉淀。------------DNA沉淀用70%乙醇洗2~3遍。--------待乙醇挥发后，DNA沉淀用100μl TE缓冲液溶解，核酸蛋白测定仪分析DNA浓度和纯度，-20℃保存备用。

⑺ DNA的提取如何进行以及最常见的方法

提取DNA主要有SDS和CTAB法，其实提取效果的好坏主要看提取的对象是什么样的材料，在提取之前一定要好好分析材料的特性，然后在设计实验步骤。
一）CTAB法
CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7
mol/L
NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3
mol/L
NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。
（二）SDS法
利用高浓度的SDS，在较高温度（55—65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀（最常用的是加入5M的KAc于冰上保温，在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
以下是在提取热带水果DNA时设计的两种不同方法步骤，对比起来CTAB法好，在禾本科植物效果差不多！
1、
CTAB法
1）
在所需量的CTAB抽提液中加入2－巯基乙醇，使终浓度达2％（v/v）。将此溶液预热至65℃。
对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的2－ME/CTAB抽提液。
2）
用液氮（－196℃）或干冰（－78℃）冷却粉碎器/匀浆器，将0.5
g植物组织粉碎成细粉，然后将组织转移到2.0
ml离心管。
3）
加入800
µl预热的2－Me/CTAB，混合使之充分湿润，于65℃温育20
min，不时颠倒混匀。
4）
待冷至室温后，加入800
µl氯仿/异戊醇（24：1），颠倒混匀至溶液呈乳浊状----但不要振荡。25℃，10000
rpm离心10
min。
5）
上清（~700
µl）转移至另一干净的离心管中，加入5
µl
RNaseA贮液，37℃温育30
min。
6）
加入700
µl氯仿/异戊醇，颠倒混匀，25℃，10000
rpm离心10
min。
7）
上清（~600
µl）转移至另一干净的1.5
ml离心管中，加入600
µl异丙醇，颠倒混匀，室温或-20℃放置20
min。
8）
25℃，12000
rpm，离心10
min，收集沉淀。
9）
去上清，加1
ml70%乙醇洗涤沉淀两次。（25℃，12000
rpm，离心10
min）
10）凉干DNA，溶于50
µl
ddH2O，4℃保存备用。
2、
SDS法
①
将0.3
g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2
ml离心管中。
②
加入1.2
ml预热至65℃的提取缓冲液（其中加入3
μl
β—巯基乙醇，增加DNA的稳定性），置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。。
③
加入0.45
ml
5M的醋酸钾，混匀，冰浴20分钟，在10000
rpm离心20
min。需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，上清液转入另一离心管中。
④
加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000
rpm离心15
min。
⑤
转移上清液到另一新离心管中，加5
μl
RNaseA贮液，37℃温育30
min。
⑥
加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000
rpm离心15
min。
⑦
转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30分钟沉淀核酸。
⑧
25℃，12000
rpm，离心10
min，收集沉淀。
⑨
弃上清，70％乙醇洗两次。
⑩
凉干DNA，溶于50
µl
ddH2O，4℃保存备用。

⑻ 核酸的提取方法有几种

DNA的提取方法有7种：酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃棒缠绕法、异丙醇沉淀法、表面活性剂快速制备法、加热法快速制备、碱变性快速制备。核酸是一类生物聚合物，是所有已知生命形式必不可少的组成物质。核酸是脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的总称。
脱氧核糖核酸（英文DeoxyriboNucleicAcid，缩写为DNA）是生物细胞内含有的四种生物大分子之一核酸的一种。DNA携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。

⑼ 核酸含量的测定方法及原理都有哪些

核酸检测的主要原理其实是反转录和聚合酶链式扩增反应。也叫做RT-PCR。目前对新型冠状病毒进行的核酸检测也主要采用此种方式。简单来说就是采取患者鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便，检测人员通过。核酸提取试剂盒提取患者标本里边儿的核酸，然后把提取到的核酸放进检测试剂中进行复制扩增。然后再根据检测结果进行判断如果是阴性代表没有感染，如果是阳性代表有感染。目前对新型冠状病毒核酸检测会存在假阴性的可能，所以可以选择多次测量。如果连续两次核酸检测为阴性，同时没有临床症状可以排除感染，并且对已经感染了新型冠状病毒肺炎的患者，如果连续两次检测核酸为阴性，注意间隔时间必须大于一天，同时临床症状缓解，影像学好转也可以解除隔离。