乙肝检测方法夹心法

Ⅰ 乙肝诊断标准

乙型病毒性肝炎的诊断标准及处理原则GB 15990—1995
前 言
乙型病毒性肝炎(简称乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染病。本病在我国广泛流行，人群感染率高，是危害人民健康最严重的常见传染病之一。

本标准的附录A和附录B都是标准的附录。
本标准由中华人民共和国卫生部提出。
本标准起草单位：北京地坛医院、北京佑安医院、北京医科大学传染病教研组。
本标准主要起草人：林秀玉、徐道振、王勤环。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病监督管理办公室负责解释。

1 范围
本标准规定了乙型病毒性肝炎(简称乙肝)的诊断标准及处理原则。
本标准适用于各级医疗机构作为对乙肝患者的诊断及处理依据。
2 引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB 15982—1995 医院消毒卫生标准
3 乙型病毒性肝炎的诊断标准及处理原则
3.1 诊断原则
根据流行病学、临床症状、体征、实验室检查和/或肝活体组织检查等手段，进行综合分析，动态观察予以诊断。
3.2 诊断标准
3.2.1 急性肝炎
3.2.1.1 急性无黄疸型肝炎
a)流行病学资料：半年内接受过血及血制品或曾有其他医源性感染，生活中的密切接触，尤其是性接触而未采用避孕套者。
b)症状：指近期出现的无其他原因可解释的持续一周以上的明显乏力和消化道症状。
c)体征：主要指肝脏肿大，伴有触痛或叩痛。
d)肝功能检查：谷丙转氨酶(ALT)明显增高。
e)HBV标记物检测：符合急性乙肝的病原学标志，详见附录A(标准的附录)中A2。
f)病理组织学特点：如鉴别诊断需要，有条件者可作肝活检，详见附录B。
在以上各项中病原学指标、症状和肝功能异常为必备条件，流行病学资料和体征为参考条件。
疑似病例：符合以上诸条中b)＋d)。
确诊病例：疑似病例＋e)。
3.2.1.2 急性黄疸型肝炎
a)同3.2.1.1.a)。
b)指近期出现无其他原因可解释的，持续一周以上的明显乏力、消化道症状及尿黄。
c)体征：皮肤巩膜黄染、肝肿大，伴有触痛或叩痛。
d)肝功能检查：ALT升高，血清胆红素(Bil)大于17.1μ mol/L(大于1mg/dL)和/或尿胆红素阳性并排除其他疾病所致的黄疸。
e)HBV标记物检测：符合急性乙肝的病原学指标，详见附录A(标准的附录)中A2。
f)病理组织学特点：如鉴别诊断需要，有条件者可以做肝活检，详见附录B。
疑似病例：b)＋c)＋d)。
确诊病例：疑似病例＋e)。
3.2.1.3 慢性迁延型肝炎(简称慢迁肝)
a)急性乙肝病程超过半年尚未痊愈者，如无急性乙肝史，肝炎病程超过半年未愈者，病情较轻不足以诊断慢性活动性肝炎者。
b)肝功能检查，ALT持续或间歇异常。
c)HBV标记物检测：符合慢性乙肝的病原学指标。详见附录A(标准的附录)中A3。
d)肝脏病理组织学特点：详见附录B。
疑似病例：a)＋b)＋c)。
确诊病例：疑似病例＋d)或c)＋d)。
3.2.1.4 慢性活动型肝炎(简称慢活肝)
a)有明显的肝炎症状。
b)体征：可有肝病面容、肝掌、蜘蛛痣、脾肿大或黄疸等(排除其他原因)。
c)肝功能检查：ALT反复和/或持续升高，血浆白蛋白降低，A/G蛋白比例失常，γ－球蛋白升高和/或胆红素长期或反复异常。
d)HBV标记物检测：符合慢性乙型肝炎的病原学指标，见附录A(标准的附录)中A3。
e)肝脏病理组织学特点：详见附录B。临床上慢活肝轻型与慢迁肝很难区别，确诊须借助于病理组织学特征与临床表现相结合加以鉴别。
疑似病例：a)＋b)＋c)＋d)。
确诊病例：疑似病例＋e)或d)＋e)。
3.2.1.5 重型肝炎
a)急性重型
1)既往无乙肝病史。以急性黄疸型肝炎起病，并在起病后10天内迅速出现精神神经症状(Ⅱ°以上的肝性脑病)，而排除其他原因引起者。此外并有黄疸迅速加深，严重的消化道症状。
2)体征：肝浊音界迅速缩小等。
3)肝功能异常，特别是凝血酶原时间延长，凝血酶原活动度低于40％。
4)HBV标记物检测：符合急性乙肝的病原学指标。见附录A(标准的附录)中A2。但HBsAg可阴性而早期出现抗－HBs阳性和抗－HBe阳性。
5)肝脏病理组织学特点：有条件者可作肝活检，详见附录B。
疑似病例：1)＋2)＋3)。
确诊病例：疑似病例＋4)或疑似病例＋4)＋5)。
b)亚急性重型
1)以急性黄疸型肝炎起病，病程在10天以上8周以内，出现意识障碍(Ⅱ°以上的肝性脑病)。同时黄疸迅速升高，并有出血倾向。
2)实验室检查：肝功能全面损害，血清胆红素大于171μ mol/L或每天上升大于17.1μ mol/L，胆固醇降低，凝血酶原活动度小于40％。
3)HBV标记物检测：符合急性乙肝的病原学指标。详见附录A(标准的附录)中A2。
4)肝脏病理组织学特点：详见附录B。
疑似病例：1)＋2)。
确诊病例：疑似病例＋3)或疑似病例＋3)＋4)。
c)慢性重型
在慢活肝或乙肝后肝硬化基础上发生，临床表现和肝功能变化基本上同亚急性重型肝炎。
3.2.1.6 淤胆型肝炎
a)急性黄疸型肝炎起病，黄疸持续2～4个月或更长。
b)临床表现为肝内梗阻性黄疸，并能除外其他原因所致的肝内外梗阻性黄疸。
c)实验室检查：血清胆红素升高，以直接胆红素为主，碱性磷酸酶、γ－GT、胆固醇明显升高。
d)HBV标记物检测：符合急性乙肝的病原学指标。详见附录A(标准的附录)中A2。
e)肝脏病理组织学特点：必要时可以做肝活检，详见附录B。
疑似病例：a)＋b)＋c)。
确诊病例：疑似病例十d)或疑似病例＋d)＋e)。
3.2.1.7 乙型肝炎后肝硬化
a)肝硬化活动期
1)具有慢活肝的临床表现。有门脉高压征及显着脾肿大和脾功能亢进(除其他原因引起的门脉高压)。
2)实验室检查：ALT升高，血清胆红素升高，血清白蛋白降低，A/G比例倒置，γ－球蛋白增高。血小板、白血球减少。
3)肝脏病理组织学特点：必要时做，详见附录B。
b)肝硬化静止期：同肝硬化活动期，但ALT持续正常。
4 乙型肝炎的处理原则
4.1 执行新生儿乙肝疫苗计划免疫。做好产前检查，特别是HBsAg阳性并伴有HBeAg阳性的母亲所生的婴儿，用乙肝疫苗联合乙肝高效价免疫球蛋白注射，以阻断母婴垂直传播。具体方案按有关规定执行。
4.2 献血员的筛选
献血员必须做到每次献血前检测血清转氨酶(ALT)、以敏感的方法(ELISA)检测HBsAg。两项中任何一项阳性均不得献血。
4.3 认真做好卫生宣传教育，提高全民对HBV感染防治的常识；做好婚前检查，对阳性的配偶及其他暴露于HBV的高危人群也应进行乙肝疫苗接种。
4.4 防止医源性传播
各级医疗卫生单位，应严格实行一人一针一管，各种医疗卫生用品及器械，应遵照GB 15982有关规定执行。
4.5 慢性HBsAg携带者的管理与随访
血液HBsAg阳性但无症状体征，各项肝功能正常，经半年随访无变化者为慢性HBsAg携带者。
4.5.1 不能献血，可以照常工作和学习。
4.5.2 注意个人卫生和经期卫生、行业卫生、所用的剃须刀、修面用具、牙刷、盥洗用品等应单独使用。
5 乙型肝炎的治疗原则
乙型肝炎临床表现多样，应根据不同类型，不同病期区别对待。
5.1 休息
急性乙肝早期应卧床休息。慢性乙肝应适当休息，病情好转注意动静结合，恢复期逐渐增加活动，但要避免过劳。
5.2 饮食
急性乙肝急性期宜进易消化，含丰富维生素的清淡饮食。慢性乙肝病情反复不愈，宜进高蛋白饮食。
5.3 药物治疗
5.3.1 急性乙肝
大多呈自限性经过，各地应因地制宜，就地取材，选用中西药物进行以对症、退黄利胆为主的治疗。
5.3.2 慢性肝炎
临床表现复杂，应根据病人的具体情况采取抗病毒，调整免疫，保护肝细胞，防止肝纤维化，改善肝功能，改善肝脏微循环等疗法。药物种类繁多，可酌情同时选用1～2种，疗程不少于三个月。
5.3.3 重型肝炎
病情凶险，应加强护理，进行监护，密切观察病情变化，在积极支持疗法的基础上，采取阻断肝细胞进行性坏死，促进肝细胞再生，改善肝脏功能，预防和治疗各种并发症(如肝性脑病、脑水肿、出血、肾功能不全、继发感染、电解质紊乱、腹水等)的综合措施，以防止病情恶化，提高治愈率。

附录A
(标准的附录)
病原学检查方法

A1 乙型病毒性肝炎病原学诊断标准
本标准要求以ELISA法检测HBV标志物，要求使用符合质控标准的试剂盒。具体操作步骤如下：
HBsAg
ELISA双抗体夹心法操作步骤：
1.抗-HBs纯品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃过夜。
2.洗液洗4次。
3.加待检血清，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
4.洗液洗4次。
5.加抗-HBs酶标记物，每孔0.1mL，放37℃2h或43℃ 1h。
6.洗液洗4～5次，拍干。
7.加底物，每孔0.1mL，置室温避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL终止反应。
8.结果判断：
目测：
阳性为显色；阴性为无色。
应用酶标仪测读OD值：
标本OD值大于等于2.1倍阴性对照OD值为阳性。
标本OD值小于2.1倍阴性对照OD值为阴性。
抗－HBs
ELISA双抗原夹心法操作步骤：
1.HBsAg纯品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃过夜。
2.洗液洗板4次。
3.加待检血清，每孔0.1mL，37℃ 2h或43℃ 1h。
4.洗液洗板4次。
5.加HBsAg酶标记物，每孔0.1mL，37℃2h或43℃1h。
6.洗液洗板4～5次，拍干。
7.加底物，每孔0.1mL，置室温避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL终止反应。
8.结果判断：
目测：
阳性为显色；阴性为无色。
应用酶标仪测读OD值：
标本OD值大于等于2.1倍阴性对照OD值为阳性。
标本OD值小于2.1倍阴性对照OD值为阴性。
HBeAg
ELISA双抗体夹心法操作步骤：
1.抗-HBe纯品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃过夜。
2.洗液洗4次。
3.加待检血清，每孔0.1mL，37℃ 2h或43℃ 1h。
4.洗液洗4次。
5.加抗－HBe酶标记物，每孔0.1mL，37℃ 2h或43℃ 1h。
6.洗液洗4～5次，拍干。
7.加底物，每孔0.1mL，置室温避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL终止反应。
8.结果判断：
目测：
阳性为有色；阴性为无色。
应用酶标仪测读OD值：
标本OD值大于等于2.1倍阴性对照OD值为阳性。
标本OD值小于2.1倍阴性对照OD值为阴性。
抗－HBe
ELISA中和法检测步骤：
1.抗－HBe纯品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4C过夜。
2.洗液洗4次。
3.每孔加待查标本0.05mL，加中和试剂0.05mL(HBeAg)于中和板内，置37℃ 2h或43℃ 1h。
4.加HBeAg纯品，每孔0.1mL，置37℃ 2h或43℃ 1h。
5.洗液洗4次。
6.加抗－HBe酶标记物和待检血清，每孔各0.1mL，置37℃ 2h或43℃ 1h。
7.洗液洗4～5次，拍干。
8.加底物，每孔0.1mL，室温避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL终止反应。 9.结果判断：
目测：
阳性为无色；阴性为显色。
应用酶标仪测读OD值，计算抑制率：

抑制率大于等于50％为阳性。
抑制率小于50％为阴性。
抗－HBc
ELISA竞争法检测步骤：
1.HBcAg纯品包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃过夜。
2.洗液洗4次。
3.加待检血清和抗－HBc酶标记物，每孔各0.05mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
4.洗液洗4～5次，拍干。
5.加底物，每孔0.1mL，室温避光15～30min，加2mol/L硫酸30μL终止反应。
6.结果判定：
目测：
阳性为无色；阴性为显色。
应用酶标仪测读OD值：
标本OD值大于等于2.1倍阳性对照OD值为阴性。
标本OD值小于2.1倍阳性对照OD值为阳性。
分光光度计测OD值(492nm)
抑制率大于等于50％为阳性(＋)。
抑制率小于50％为阴性(－)。

抗－HBc IgM
1.抗μ血清包被聚苯乙烯板孔，每孔0.1mL，4℃过夜。
2.洗液洗4次。
3.加待检血清，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
4.洗液洗4次。
5.加HBeAg，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
6.洗液洗4次。
7.加抗-HBc酶标记抗体，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
8.洗液洗4次，拍干。
9.加底物，每孔0.1mL，置室温避光15～30min，加2mol/L硫酸30min终止反应。
10.结果判定：
目测：
阳性为显色；阴性为无色。
应用酶标仪测读OD值：
标本OD值大于等于2.1倍阴性对照OD值为阳性。
标本OD值小于2.1倍阴性对照OD值为阴性。
抗－HBc IgG
1.抗γ血清包被聚苯乙烯板孔，每孔0.lmL，4℃过夜。
2.洗液洗4次。
3.加待检血清，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
4.洗液洗4次，拍干。
5.加HBcAg，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
6.洗液洗4次，拍干。
7.加抗-HBc酶标记抗体，每孔0.1mL，放37℃ 2h或43℃ 1h。
8.洗液洗4次，拍干。
9.加底物，每孔0.1mL，置室温避光15～30min，加2mol/L硫酸30min终止反应。
10.结果判定：
目测：
阳性为显色；阴性为无色。
应用酶标仪测读OD值：
标本OD值大于等于2.1倍阴性对照OD值为阳性。
标本OD值小于2.1倍阴性对照OD值为阴性。
HBV 感染的标记物判定标准
(1)血清HBsAg阳性。
(2)血清HBV DNA阳性(斑点杂交法)，或HBV DNA多聚酶阳性，或HBeAg阳性(单独HBeAg阳性，需要作中和试验，以排除假阳性)，血清抗-HBc IgG阳性(单独阳性，需要作中和试验，排除假阳性)。
(3)肝内HBcAg阳性和(或)HBsAg阳性，或HBV DNA阳性。
有以上任何一项阳性者可诊断为HBV感染。
A2 急性HBV感染标记物诊断标准
(1)病程中HBsAg由阳性转为阴性，或HBsAg由阳性转为阴性且出现抗-HBs阳转。
(2)抗－HBC IgM滴度高水平，而抗－HBc IgG阴性或低水平。
A3 慢性HBV感染标记物诊断标准
抗-HBc IgM滴度不高或阴性，但血清HBsAg或HBV DNA任何一项阳性病程持续半年以上。

附录B
(标准的附录)
病毒性肝炎病理组织学的诊断标准

B1 病毒性肝炎的基本组织学改变
B1.1 炎症改变：主要浸润细胞如淋巴细胞、单核细胞、浆细胞和组织细胞。
B1.1.1 间质内炎症：炎症细胞存在于汇管区或新形成的纤维间隔区，大量淋巴细胞浸润。有时可形成淋巴滤泡。
B1.1.2 实质内炎症：坏死灶内可见多少不等的炎症细胞，并可见淋巴细胞和肝细胞密切接触，甚至进入肝细胞内。
B1.2 坏死性改变
B1.2.1 单个肝细胞坏死：细胞呈凝固性坏死，最后形成嗜酸性小体。
B1.2.2 灶性坏死：小群肝细胞呈溶解性坏死，有单核及淋巴细胞浸润，伴有或不伴有网织支架的塌陷，随之枯否氏细胞增生，并吞并细胞碎片。
B1.2.3 碎屑状坏死：肝细胞坏死发生肝实质和间质交界处，当坏死发生于汇管区，同时伴有界板破坏，称为门脉周围碎屑状坏死。若坏死发生于新形成的间隔和肝实质交界面，则称为间隔周围碎屑状坏死。在坏死灶内肝细胞呈碎片状或相互解离，炎症细胞可侵入肝细胞内，并可见肝细胞被淋巴细胞包围而相互分离。这种被隔离而存活的肝细胞有时形成腺样结构，被胶元纤维所包绕。
B1.2.4 桥形坏死：两个碎屑状坏死灶相互融合，或碎屑状坏死灶和小叶中央坏死灶相融合，则称为桥形坏死。
B1.2.5 多小叶坏死：坏死范围累及多个小叶。
B1.3 其他肝实质的改变
B1.3.1 肝细胞水肿，疏松，气球样变及嗜酸性变。
B1.3.2 肝细胞内及毛细胆管内瘀胆。
B1.3.3 肝细胞再生，表现为肝细胞及胞核大小不一，出现双核及多核细胞和双层肝细胞索形成。
B1.3.4 毛玻璃细胞：胞浆内有淡染的均质性结构，呈弥漫型，包涵体型或膜型分布多见于慢性肝炎及
HBsAg携带者。
B1.4 胆管改变：小胆管再生，偶见胆管上皮肿胀及气球样变。
B1.5 纤维化及间隔形成
B1.5.1 主动性间隔：由于碎屑状坏死后，纤维组织增生并向小叶内伸入，呈楔形，伴多量炎症细胞的浸润。
B1.5.2 被动性间隔：由于肝细胞坏死，网织支架塌陷纤维化而形成，炎症浸润很轻微，间隔和肝实质界限较清楚。
B2 病毒性肝炎组织学诊断标准
B2.1 急性肝炎
B2.1.1 急性黄疸型肝炎：肝细胞肿胀，气球样变，胞浆染色变浅，胞核浓缩，嗜酸性变性，嗜酸小体形成，胞核空泡变性，或核溶解，肝细胞灶性坏死与再生。汇管区有大单核与淋巴细胞浸润。肝血窦壁Kuf－fer细胞增生。
B2.1.2 急性无黄疸型肝炎：病变与急性黄疸型相似，但程度较轻。
B2.2 慢性肝炎
B2.2.1 慢性迁延性肝炎分三类：
a)慢性小叶性肝炎
主要是肝小叶内的炎症和肝细胞的变性及坏死，门脉区的改变不明显。
b)慢性间隔性肝炎
小叶内炎性反应及变性坏死轻微。汇管区有纤维细胞向小叶内伸展形成间隔，间隔内炎症细胞很少，不形成假小叶。
c)慢性门脉性肝炎
肝实质变性及坏死病变较轻。有少数点状坏死。偶见嗜酸性体，门脉区有多量炎性细胞浸润，致使门脉区增大，但并无界板破坏或碎屑样坏死。
B2.2.2 慢性活动性肝炎
碎屑状坏死为主要特征，小叶内病变，包括点状和(或)灶性坏死，甚或灶性融合性坏死，以及变性和炎症反应。
慢性活动性肝炎分三类：
a)轻型慢性活动性肝炎
符合本型基本特征，但病变较轻。
b)中型慢性活动性肝炎
有广泛的碎屑状坏死及主动性间隔形成，肝实质变性及坏死严重，可见桥形坏死及被动性间隔形成，但多数小叶结构仍可辨认。
C)重型慢性活动性肝炎
桥形坏死范围更广泛，可累及多数小叶并破坏小叶完整性。
B2.3 淤胆型肝炎
病理组织学与急性黄疸型肝炎相似，并有毛细胆管内胆栓形成，该细胞内胆色素滞留，肝细胞内出现小点状颗粒，汇管区有小胆管扩张及中性白细胞浸润等。
B2.4 肝硬化
B2.4.1 活动性肝硬化
肝硬化同时伴有碎屑状坏死，碎屑状坏死可以存在于汇管区周围及纤维间隔和肝实质交界处，肝细胞有变性坏死及炎性反应。
B2.4.2 静止性肝硬化
假小叶周围的纤维间隔内炎症细胞很少，间质和实质界线很清楚。
B2.5 重型肝炎
B2.5.1 急性重型肝炎
a)急性水肿性重型肝炎
严重的弥漫性肝细胞肿胀，胞膜明显，胞浆淡染或近似透明，细胞相互挤压呈多边形、类似植物细胞。小叶结构紊乱，小叶中有多数大小不等的坏死灶，肿胀的肝细胞间有明显的毛细胆管淤胆。
b)急性坏死性重型肝炎
有广泛的肝细胞坏死，该处的肝细胞消失，遗留网织支架。肝窦充血，有中性、单核、淋巴细胞及大量吞噬细胞浸润，部分残存的网状结构中可见小胆管淤胆。
B2.5.2 亚急性重型肝炎
可见新旧不等的大片坏死和桥形坏死，网织支架塌陷，有明显汇管区集中现象，可见大量增生的胆管和淤胆，残存的肝细胞增生成团，呈假小叶样结构。
B2.5.3 慢性重型肝炎
在慢性肝病变的背景上，有大块或亚大块坏死者(即慢性陈旧性病变，如慢活肝、肝硬化病变的背景有新鲜大块或亚大块坏死)。

Ⅱ 如何检测体内是否存在抗体拜托了各位 谢谢

1. HBsAg (乙肝表面抗原) 原理：采用ELISA 双抗体夹心法。双抗体夹心法用于检测相对分子质量较大的蛋白质抗原。先将已知特异性抗体包被于固相载体上，加待测样本，若 其中有相应的抗原，则抗原和抗体特异性结合洗板后加入酶标记特异性抗体，使在固相上形成包被抗原抗体复合物洗板:加酶底物及色原呈色。双抗原夹心法则是利用包被抗原和标记抗原检测样本中的特异性抗体。抗原或抗 体水平与所测吸光度(A) 值呈正相关。 将纯化的抗HBs包被固相载体，加入待测样品，括其中含有HBsAg ，则与载体上的抗HBs 结合，再加入辣根过氧化物酶( HRP) 标记的抗HBs 抗体，加酶底物/色原显色。显色程度与 HBsAg 含量成正比。 2.HBsAb （乙肝表面抗体） 原理：采用ELISA 双抗原夹心法。反应板上包被纯化HBsAg ，待测样品中抗HBs与之反应，再加HRP-HBsAg 形成夹心，加酶底物/色原悔液显色。 3.HBeAg 和HbeAb 原理：检测HBeAg 和抗HBe 分别用ELISA 双抗体夹心法和Elisa竞争法。 4.HbcAb 原理：Elisa竞争法。用于检测待检样本中未知抗原或抗体。测抗原时用已知抗体包被固相载体，然后同步加入含有待测抗原的样本和酶标记抗原，使待测抗原与酶标记抗原竞争结合在固相载体上的抗体；洗板加酶底物及色原!让包。待iYlIJ 悔液抗原量越多，则被结合的酶标记抗原量越少，呈色越浅。呈色深浅与待测抗原的量成反比。测未知抗体时用已知抗原包被固相载体，同步加入含有待测抗体的标本和酶标记特异抗体，二者竞争结合固相载体t 的抗原.待测抗体量越多，酶标记抗体与固相抗原结合的最就越少，呈色就越浅。待测抗体的水平与呈色程度成反比。

Ⅲ 酶联免疫法的检测方法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
二、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
三、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
四、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显着提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
⑴将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
⑵加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
⑶加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
⑷加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：
⑴将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
⑵待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。
⑶加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。一般情况，是通过方波伏安法，检测培养体系的峰电流，通过峰电流与抗原抗体的线性关系来最终确定体系的最终检测目标的浓度。
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：
⑴将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。
⑵加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
⑶加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。
⑷加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
⑸加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。
亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。 在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物等。完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：
⑴已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；⑵酶标记的抗原或抗体（结合物）；
⑶酶的底物；
⑷阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；
⑸酶联物（结合物）及标本的稀释液；
⑹洗涤液；
⑺酶反应终止液。