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抗生素检测方法ttc

发布时间:2025-08-25 19:25:03

① 请教检测食物含抗生素的简单方法(我是老师想做这方面实验)

牛奶中抗生素残留的几种常用检测方法
随着奶牛饲养业的发展,抗生素在预防和治疗奶牛疾病方面得到广泛的应用。生鲜牛奶中抗生素的来源主要是:第一,治疗泌乳期病牛时使用的抗生素会从奶牛体内移行到乳腺残留进入牛奶中,资料表明治疗后的奶牛,其挤出的牛奶5天内都有抗生素残留;其二,为了预防奶牛疾病并提高产量,在奶牛饲料中添加抗生素也会造成牛奶中抗生素的残留;第三,由于牧场管理不善,挤奶、储奶没有严格的卫生制度和配套的设施,人为添加或造成牛奶抗生素的污染。
牛奶中含有抗生素,不仅对人的健康造成很大的危害,而且对乳品加工企业带来经济损失(因无法生成酸奶和奶酪)。因此必须严格控制牛奶中抗生素残留,除了要做好科学饲养、精心管理;正确挤奶和预防疾病外,还要规范抗生素的使用,按国标中有关规定,用药后的奶牛5天后所产的牛奶才可作为原料乳,并且要检测其残留。世界粮农组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)、欧盟(EC)及美国的食品和药品管理局(FDA)等对食品中抗生素最大残留量都有明确的规定,我国也有鲜奶中抗生素残留量检验标准(GB4689.27—94)。
目前,鲜奶中抗生素残留的检测方法大致分为三类:生物测定法(微生物测定法、放射受体测定法)、免疫法(放射免疫法、荧光免疫法、酶联免疫法)、理化分析法(波谱法、色谱及联用技术)。下面介绍几种常用的牛奶中抗生素残留检测方法。
TTC法
TTC法是我国鲜奶中抗生素残留量检验标准(GB4689.27—94)的检测法,属生物检测法。其测定原理基于抗生素对微生物的抑制作用。如果牛奶中含有抗生素,则加入菌种(嗜热链球菌)经培育2.5~3小时后,加入TTC指示剂(三苯基四氮唑)不发生还原反应,所以样品呈无色状态;如果牛奶中不含抗生素,则样品呈红色.这样实验后样品颜色不变的为阳性,样品染成红色的为阴性。
TTC法的具体操作步骤:
1.菌液制备:将单菌种(嗜热链球菌)以脱脂乳为培养基,在36±1℃培养箱中培养15小时后,再以脱脂乳以至于1:1稀释待用;
2.取待检样液9mL,在80℃水浴加热5分钟后冷却到37℃以下,加活菌液1mL,在36℃±1℃水浴2小时,加入4%的TTC指示剂0.3mL, 36℃±1℃水浴培养30分钟;
3.若样液颜色不变为阳性,呈红色为阴性;若阳性的样液,再置于水浴中培养30分钟,不显色的为阳性,呈红色为阴性.
TTC法测定各种抗生素的灵敏度为:青霉素:4ppb,链霉素:500ppb,庆大霉素:400ppb,卡那霉素:5000ppb.它具有费用低,易开展的优点;缺点是耗时长,要求操作人员需有一定专业知识且实验过程中菌液的制备、水浴过程控制都要求严格遵守操作规程,否则易出现假阳性,以致出现检验结果的不稳定性。
Delvotest? sp法(戴尔沃检测法)
该法最早在香港传到广东的,其使用是基于20世纪80年代初香港要求广东出口的生奶必须“无抗”且要求采用Delvotest法检测。该方法也是生物测定法,其试剂是由荷兰DSM公司生产并由AOAC认证。原理是利用微生物—嗜热芽胞菌在64℃条件下培养2.5~3小时后会产酸,酸引起指示剂BCP(溴甲酚紫)变为黄色;若牛奶样品中不含抗生素,培养后样品呈黄色,如样品中含有抗生素, 嗜热芽胞菌生长受到抑制而无法产酸,指示剂将不变色.
Delvotest? sp 法的操作步骤:
1.以无菌操作将一片营养药片夹放入小试管内;
2.用微量移液管将0.1mL牛奶样品注入小试管内;
3.把小试管放入已预热至64℃的水浴箱或恒温器中培养;
4).定时3小时取出观察颜色变化.如果底部2/3的固体介质是黄色,则为阴性, 如果底部2/3的固体介质是紫色,则为阳性.
Delvotest? sp 法具有广谱性,可检测到?-内酰胺类抗生素在内的更多抗生素,如磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、氯霉素等,其中对青霉素和磺胺类抗生素特别灵敏. 其灵敏度为:青霉素:3ppb,链霉素:300ppb,庆大霉素:400ppb,卡那霉素:2500ppb。Delvotest? sp 法集操作方便,严格实用,容易判断,结果可靠,费用适中等优点;但也易出现假阳性,实验证明:当牛奶样品中添加微生物防腐剂(如乳酸链球菌素—Nisn)或样品中有足够的洗涤剂残留时,便可影响嗜热芽胞菌生长而使实验为阳性。
Snap?法
该方法是酶联免疫法,由美国IDEXX公司生产其检测分析仪及其试剂盒,均获得AOAC认证,它利用了竟争酶联免疫技术。其基本原理是用特异性抗体将固相载体激活,加入含待测抗原的溶液和一定量的酶标记抗原在45℃±5℃共同保温,使样品内的抗生素与内置抗生素标志物竟争与固定的抗体结合,然后进行洗涤和显色,内置抗生素标志物与固定的抗体结合形成的复合体,通过酶的作用分解可形成有色物质,通过测定色度并与参照物对照,就可以确定结果是阳性或阴性。
Snap?法操作步骤:
1.加入乳样于样品管中,摇匀,加热样品和检测板5分钟;
2.加入乳样于样品孔中,当激活圆环开始退却时,按Snap键;
3.反应4分钟,由Snap?读数仪读取并打印结果.检测读数小于1.05时判为阴性,大于1.05时判为阳性.
Snap?法是一种将酶化学反应的敏感性和抗原抗体免疫反应的特异性相结合的方法,其敏感性和特异性好,检测的灵敏度以普遍使用的?-内酰胺类计:青霉素:5ppb,阿莫西林:10ppb,氨苄西林:10ppb,头孢西林:8ppb.其他抗生素如四环素等的检测,则需购买相应的试剂来检测. Snap?法检测结果快速准确, 9分钟内即可检测出牛奶中?-内酰胺类、四环素类、磺胺类等抗生素的残留含量,且有半定量的读数,可监控牧场用药的情况;检测仪器稳定性良好,结果重现性高,整个检测过程简单方便;但需购置专用仪器和试剂,成本较高。
高效液相色谱检测法
它是一种理化检测方法,是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应来测定其含量.检测的过程采用了气相色谱理论,通过高压液相和高灵敏度的检测器,分离速度快、效率高和操作自动化。一般要经过样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤,能检测抗生素的具体含量,敏感性较高,但检测程序复杂,费用较高,需购买色谱仪等检测设备,不适合小型检验室。
传统的抗生素检测方法不少,有的操作烦琐,有的实验条件要求高,有的检验时间太长;这些不仅会给乳制品生产企业造成经济上和时间上的损失,而且检测结果常常会被原辅材料和人为操作等因素所影响.鉴于牛奶中抗生素残留是涉及人类健康的公共卫生问题,乳品企业及牧场应重视和加强检测工作,应用一些简单、快速和准确性高的方法来监控产品的质量,保证消费者的健康。
http://szddi.com/foodonline/newsdetail.asp?id=15933

反应原理
本产品主要是利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的基本原理来进行的。在整个反应当中,样品中氯霉素含量越多,反应呈色就越淡。反之,样品中氯霉素含量越少,则呈色越深。
试剂盒组成
1、微量测试孔:每条8孔,每板12条
2、氯霉素标准溶液:
0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35 ppb、4.05 ppb,1.5ml/瓶
3、10倍浓缩萃取稀释液:一瓶,30ml/瓶
4、10倍浓缩洗涤液:一瓶,30 ml /瓶
5、氯霉素酶标记物: 一瓶,8 ml/瓶
6、底物溶液:一瓶,12 ml/瓶
7、反应终止液:一瓶,13 ml/瓶
使用说明
A、注意事项
1、使用前先将氯霉素标准溶液6瓶,浓缩萃取稀释液,浓缩洗涤液,酶标记物,底物溶液及微量测试孔条置于室温下,回温30分钟。
2、原倍萃取稀释液及洗涤液配制
用蒸馏水将10倍浓缩萃取稀释液及浓缩洗涤液分别以1: 9的比例稀释(即1mL浓缩液+9mL蒸馏水),即可作为样品萃取稀释液与微孔板清洗液。
3、回温后,取出所需微量测试孔条,将剩余板条立即放回铝箔袋中用胶带封好,置于4oC保存。
B、样品制备
1.待测物为生乳,则依以下方法进行处理 (5倍稀释)
取100ul待测生乳加入400ul萃取稀释液,振荡混合后备用。
2.待测物为蜂蜜,则依以下方法进行处理
a.取2g蜂蜜、4ml蒸馏水与2ml 乙酸乙酯置入离心管中,震荡约5分钟,使其充分混合均匀。
b.离心10分钟(3000rpm),取0.5ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中,于50℃下氮气吹干(温度请勿超过50oC)。
c.加入0.5ml萃取稀释液,震荡约10秒钟后备用。
3. 待测物为血清、则依以下方法进行处理
a.抽取待检动物血液,离心或静置取其较透明之上层液(血清层)使用,注意不要有溶血。
b.将3ml血清加入离心管中,再加入6ml乙酸乙酯,震荡混合约30秒。
c.离心10分钟(3000rpm),取2ml上层液(乙酸乙酯)至玻璃管中,于50oC下氮气吹干。
d.于此玻璃管中加入正己烷2ml,先将残余物完全溶解后,再加入1 ml萃取稀释液,震荡约30秒钟。
e. 离心10分钟(3000 rpm),用吸管吸去上层液(正己烷) 及中间乳化层部分,弃掉。再吸取下层液(水层)备用。
f.若有乳化现象,请先将大部分上层液(正己烷)取出后,再将玻璃管置入80oC水中,隔水加热约5~10分钟,可改善乳化情形。
4. 待测物为鸡肉或鱼、虾,则依以下方法进行处理
a.将3克样品剪碎后放入50 ml离心管中,再加入6ml乙酸乙酯,并以均质机均质约1分钟,再震荡约30秒。
b.离心10分钟(3000rpm),取2ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中,于50oC下氮气吹干。
c.于此玻璃管中加入正己烷2 ml,先将残余物完全溶解后(若未能完全溶解,可能会导致回收率降低),再加入1 ml萃取稀释液,震荡约30秒钟。
d.离心10分钟(3000 rpm),用吸管吸去上层液(正己烷) 及中间乳化层部分,弃掉。再吸取下层液(水层)备用。
e.若有乳化现象,请先将大部分上层液(正己烷)取出后,再将玻璃管置入80oC水中,隔水加热约5~10分钟,可改善乳化情形。待测物为血清、则依以下方法进行处理
5.待测物为内脏(肝、心等),则依以下方法进行处理(5倍稀释)
同上述步骤a~d,但下层液吸出后,再以萃取稀释液稀释5倍(即下层液50ul加萃取稀释液200ml)。
6.待测物为饲料,则依以下方法进行处理(10倍稀释)
同上述步骤a~d,但下层液吸出后,再以萃取稀释液稀释10倍(即下层液30ul加萃取稀释液270ml)。
C、操作步骤
本产品的酶标记物与氯霉素标准溶液均直接使用,无需再稀释。
1、于适当微孔中分别加入100mL标准溶液(0,0.05,0.15,0.45,1.35和4.05ppb)。
2、在另外的微孔中加入100mL 已完成前处理的样品溶液。
3、再于每一微孔中另再加入50mL酶标记物。
4、轻敲盘子四周,使其充分混合后于室温下避光静置温育1小时。
5、将微孔中的反应液甩掉,再将洗液加满每一微孔后甩掉,重复洗3次。
6、最后一次甩掉后,在吸水纸上拍干。
7、于每一微孔中加入底物溶液100mL后,轻敲盘子四周,使其充分混合。
8、于室温下避光静置温育20分钟。
9、于每一微孔中加入100mL反应终止液。
10、用酶标仪于波长450nm下判读。
D、判定
1. 计算B/B0值。用样品或标准液吸光度值(B)除以零标准吸光度值(B0)再乘以100%。
2. 以B/B0值为纵坐标,以标样浓度的对数值为横坐标,做标准半对数曲线。
3. 根据每个样品的B/B0值就可从曲线上读出相对应样品的浓度。
4. 由于样品经过了预先稀释,因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。
E、标准曲线

F、灵敏度
氯霉素试剂检测盒的平均检测下限为 0.05ppb,此浓度之吸光值与阴性标准溶液(0ppb)之吸光值有明显的差异。
G、 特异性
针对以下抗生素进行交叉反应之测试,结果如下:
Chloramphenicol =100%
Chloramphenicol(free base) <0.1%
Gentamycin <0.1%
Tetracycline <0.1%
Penicillin G <0.1%
Sulfamethazine <0.1%
H、再现性
针对氯霉素检测试剂盒精密度测试,重复6次,所得不同浓度标准溶液的吸光值变异系数(%CV)如图2所示,显示氯霉素试剂盒有很高的再现性:

I、回收率
生乳(添加1.0ppb)104~117%
蜂蜜(添加0.3ppb)90~110%
虾及鱼肉(添加0.5ppb)95~110%
鸡肉(添加0.5ppb) 90~120%
血清(添加0.5ppb)100~120%
内脏(添加1.0ppb) 100~120%
饲料(添加2.0ppb)80~110%

氯霉素检测试剂盒
简介
氯霉素(Chloramphenicol)是一种广谱抗生素。由于其具有效果好以及价格低廉等优点,目前已被普遍应用于各类家禽、家畜、水产品及蜂制品的各种传染性疾病的治疗。然而氯霉素有其严重的副作用,它会抑制人体骨髓的造血功能,从而引起再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症。目前,我国已禁止其使用。
我公司采用国内外先进的工艺与技术,研发出氯霉素ELISA检测试剂盒,简化了样品处理方式,使用简便,省时省力省钱,整个操作过程不到90分钟。本产品检测范围广(鸡肉、鱼、虾、蟹、牛奶、血清、肌肉、组织、饲料与蜂蜜等),回收率为80%-120%,灵敏度可达到0.05ppb,是各类企业及各级政府检测机构的理想产品。
简单
1. 样品提取方便快捷。
2. 90分钟得到结果。
3. 只需基本的实验室设备。
4. 操作人员只需最基本的实验知识。
准确
1. 结果重现性高。
2. 精确至0.05ppb。
3. 与其它抗体的交叉反应率极低。
技术支持
我们为用户提供最方便、快捷、周到的服务。
产品规格
包装:每包96孔
灵敏度: 0.05ppb
测试区间:0.05ppb-4.05ppb
检测时间:80分钟(提取后)
储存条件:2-8℃

http://www.practical-bio.com.cn/htm/procts_05.htm

② 乳品最好的抗生素检测方法是什么啊,急求!!

目前,鲜奶中抗生素残留的检测方法大致分为三类:生物测定法、免疫法、理化分析法。下面介绍几种常用的牛奶中抗生素检测方法。
(1)TTC法属生物检测法:
如果牛奶中含有抗生素,则加入菌种(嗜热链球菌)经培育2.5~3小时后,加入TTC指示剂(三苯基四氮唑)不发生还原反应,所以样品呈无色状态;如果牛奶中不含抗生素,则样品呈红色.
(2)戴尔沃检测法:
该法也是生物测定法,是利用微生物—嗜热芽胞菌在64℃条件下培养2.5~3小时后会产酸,酸引起指示剂BCP(溴甲酚紫)变为黄色;若牛奶样品中不含抗生素,培养后样品呈黄色,如样品中含有抗生素, 指示剂将不变色.
(3)Snap法
检测结果快速准确, 9分钟内即可检测出牛奶中B-内酰胺类、四环素类、磺胺类等抗生素的残留含量,且有半定量的读数,可监控牧场用药的情况;检测仪器稳定性良好,结果重现性高,整个检测过程简单方便;但需购置专用仪器和试剂,成本较高。
(4)高效液相色谱检测法
它是一种理化检测方法,一般要经过样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤,能检测抗生素的具体含量,敏感性较高,但检测程序复杂,费用较高,需购买色谱仪等检测设备,不适合小型检验室。
(5)纳米胶体金层析法
该方法是基于竞争法胶体金免疫层析技术,将检测液加入试纸卡上的样品孔,检测液中的抗生素与金标垫上的金标抗体结合形成复合物,若抗生素在检测液中浓度低于100ng/mL,未结合的金标抗体流到T区时,被固定在膜上的抗生素BSA偶联物结合,逐渐凝集成一条可见的T线;若抗生素浓度高于100ng/mL,金标抗体全部形成复合物,不会再与T线处抗生素BSA偶联物结合形成可见T线。未固定的复合物流过T区被C区的二抗捕获并形成可见的C线。C线出现则表明免疫层析发生,即试纸有效.结果解释
阴性:C线显色,T线肉眼可见,无论颜色深浅均判为阴性。
阳性:C线显色,T线不显色,判为阳性。
无效:C线不显色,无论T线是否显色,该试纸均判为无效。
保存和稳定性
4-30℃阴凉干燥处保存,不可冷冻,避免阳光直晒,生产日期起18个月内有效。
纳米胶体金层析法适用于样品的初筛,检测时间短,出结果速度快,且能在常温下保存18个月之久,操作简单,无需任何专业的技术,没有检测环境的需求不管是奶农还是奶站工作人员还是专业的检测人员,都可以方便使用。

对比的话最后这个方法好些(纳米胶体金层析法), 抗生素检测卡只需要9分钟就搞定价格还算不错给你个网址看看:
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我再补充一下,我可不是做广告啊!希望我的回答能对你有所帮助!

③ 微生物生长的常用检测方法

一、生长量测定法

1.1体积测量法:又称测菌丝浓度法。

通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是,取一定量的待测培养液(如10毫升)放在有刻度的离心管中,设定一定的离心时间(如5分钟)和转速(如5000rpm),离心后,倒出上清夜,测出上清夜体积为v,则菌丝浓度为(10-v)/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放,简便,快速,但需要设定一致的处理条件,否则偏差很大,由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物,结果会有一定偏差。

1.2称干重法:

可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10-20%。在离心法中,将一定体积待测培养液倒入离心管中,设定一定的离心时间和转速,进行离心,并用清水离心洗涤1-5次,进行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干,或采用红外线烘干,也可在80℃或40℃下真空干燥,干燥后称重。如用过滤法,丝状真菌可用滤纸过滤,细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤,过滤后用少量水洗涤,在40℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐,通常获取的微生物产品为菌体时,常采用这种方法,如活性干酵母(activitydryyeast,ADY),一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。

1.3比浊法:

微生物的生长引起培养物混浊度的增高。通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值,判断微生物的生长状况。对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪时,可采用一种特制的有侧臂的三角烧瓶。将侧臂插入光电比色计的比色座孔中,即可随时测定其生长情况,而不必取菌液。该法主要用于发酵工业菌体生长监测。如我所使用UNICO公司的紫外-可见分光光度计,在波长600nm处用比色管定时测定发酵液的吸光光度值OD600,以此监控E.Coli的生长及诱导时间。

1.4菌丝长度测量法:

对于丝状真菌和一些放线菌,可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度,或是利用一只一端开口并带有刻度的细玻璃管,到入合适

的培养基,卧放,在开口的一端接种微生物,一段时间后记录其菌丝生长长度,借此衡量丝状微生物的生长

二、微生物计数法

2.1血球计数板法:

血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片,玻片上有四条沟和两条嵴,中央有一短横沟和两个平台,两嵴的表比两平台的表面高0.1mm,每个平台上刻有不同规格的格网,中央0.1mm2面积上刻有400个小方格。通过油镜观察,统计一定大格内微生物的数量,即可算出1毫升菌液中所含的菌体数。这种方法简便,直观,快捷,但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数,并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。

2.2染色计数法:

为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数,而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足,人们发明了染色计数法。借助不同的染料对菌体进行适当的染色,可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。如酵母活细胞计数可用美蓝染色液,染色后在显微镜下观察,活细胞为无色,而死细胞为蓝色。

2.3比例计数法:

将已知颗粒(如霉菌孢子或红细胞)浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合,在显微镜视野中数出各自的数目,即可得未知菌液的'细胞浓度。这种计数方法比较粗放。并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。

2.4液体稀释法:

对未知菌样做连续十倍系列稀释,根据估计数,从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样,接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中,经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数,然后查最大或然数表MPN(mostprobablynumber)得出菌样的含菌数,根据样品稀释倍数计算出活菌含量。该法常用于食品中微生物的检测,例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。

2.5平板菌落计数法:

这是一种最常用的活菌计数法。将待测菌液进行梯度稀释,取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合,或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。保温培养后,用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度,即可算出原菌液的含菌数。一般以直径9cm的平板上出现50-500个菌落为宜。但方法比较麻烦,操作者需有熟练的技术。平板菌落计数法不仅可以得出菌液中活菌的含菌数,而且同时将菌液中的细菌进行了一次分离培养,获得了单克隆。

2.6试剂纸法:

在平板计数法的基础上,发展了小型商品化产品以供快速计数用。形式有小型厚滤纸片,琼脂片等。在滤纸和琼脂片中吸有合适的培养基,其中加入活性指示剂2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,无色)待蘸取测试菌液后置密封包装袋中培养。短期培养后在滤纸上出现一定密度的玫瑰色微小菌落与标准纸色板上图谱比较即可估算出样品的含菌量。试剂纸法计数快捷准确,相比而言避免了平板计数法的人为操作误差。

2.7膜过滤法:

用特殊的滤膜过滤一定体积的含菌样品,经丫叮橙染色,在紫外显微镜下观察细胞的荧光,活细胞会发橙色荧光,而死细胞则发绿色荧光。

2.8生理指标法:

微生物的生长伴随着一系列生理指标发生变化,例如酸碱度,发酵液中的含氮量,含糖量,产气量等,与生长量相平行的生理指标很多,它们可作为生长测定的相对值。

2.9测定含氮量:

大多数细菌的含氮量为干重的12.5%,酵母为7.5%,霉菌为6.0%。根据含氮量×6.25,即可测定粗蛋白的含量。含氮量的测定方法有很多,如用硫酸,过氯酸,碘酸,磷酸等消化法和Dumas测N2气法。Dumas测N2气法是将样品与CuO混合,在CO2气流中加热后产生氮气,收集在呼吸计中,用KOH吸去CO2后即可测出N2的量。

2.10测定含碳量:

将少量(干重0.2-2.0mg)生物材料混入1毫升水或无机缓冲液中,用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在1000C下加热30分钟后冷却。加水稀释至5毫升,在580nm的波长下读取吸光光度值,即可推算出生长量。需用试剂做空白对照,用标准样品做标准曲线。

2.11还原糖测定法:

还原糖通常是指单糖或寡糖,可以被微生物直接利用,通过还原糖的测定可间接反映微生物的生长状况,常用于大规模工业发酵生产上微生物生长的常规监测。方法是,离心发酵液,取上清液,加入斐林试剂,沸水浴煮沸3分钟,取出加少许盐酸酸化,加入Na2S2O3临近终点时加入淀粉溶液,继续加Na2S2O3至终点,查表读出还原糖的含量。

2.12氨基氮的测定:

方法是,离心发酵液,取上清液,加入甲基红和盐酸作指示剂,加入0.02N的NaOH调色至颜色刚刚褪去,加入底物18%的中性甲醛,反应数刻,加入0.02N的使之变色,根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量,可间接反映微生物的生长状况。

2.13其他生理物质的测定:

P,DNA,RNA,ATP,NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及产酸,产气,产CO2(用标记葡萄糖做基质),耗氧,黏度,产热等指标,都可用于生长量的测定。也可以根据反应前后的基质浓度变化,最终产气量,微生物活性三方面的测定反映微生物的生长。如我所在BMP-2的发酵生产上,随时监测溶氧量的变化和酸碱度的变化,判断细菌的长势。

拓展:微生物的现代定义

肉眼难以看清,需要借助光学显微镜或电子显微镜才能观察到的一切微小生物的总称。微生物包括细菌、病毒、真菌和少数藻类等。(但有些微生物是肉眼可以看见的,像属于真菌的蘑菇、灵芝等。)病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”,但是它的生存必须依赖于活细胞。根据存在的不同环境分为空间微生物、海洋微生物等,按照细胞结构分类分为原核微生物和真核微生物。

微生物的主要特征

体小面大

一个体积恒定的物体,被切割的越小,其相对表面积越大。微生物体积很小,如一个典型的球菌,其体积约1mm,可是其表面积却很大。这个特征也是赋予微生物其他如代谢快等特性的基础。

吸多转快

微生物通常具有极其高效的生物化学转化能力。据研究,乳糖菌在1个小时之内能够分解其自身重量1000-10000倍的乳糖,产朊假丝酵母菌的蛋白合成能力是大豆蛋白合成能力的100倍。

生长繁殖快

相比于大型动物,微生物具有极高的生长繁殖速度。大肠杆菌能够在12.5-20分钟内繁殖1次。不妨计算一下,1个大肠杆菌假设20分钟分裂1次,1小时3次,1昼夜24小时分裂24×3=72次,大概可产生4722366500万亿个(2的72次方),这是非常巨大的数字。但事实上,由于各种条件的限制,如营养缺失、竞争加剧、生存环境恶化等原因,微生物无法完全达到这种指数级增长。 已知大多数微生物生长的最佳pH范围为7.0 (6.6~7.5)附近,部分则低于4.0。

微生物的这一特性使其在工业上有广泛的应用,如发酵、单细胞蛋白等。微生物是人类不可或缺的好朋友。

适应强 易变异

分布广 种类多

微生物对我们生活的影响

微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50%是由病毒引起。微生物导致人类疾病的历史,也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面,人类取得了长足的进展,但是新现和再现的微生物感染还是不断发生,像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力,使许多菌株发生变异,导致耐药性的产生,人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异,最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异,这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。

微生物千姿百态,有些是腐败性的,即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然有些微生物是有益的,它们可用来生产如奶酪,面包,泡菜,啤酒和葡萄酒。微生物非常小,必须通过显微镜放大约1000 倍才能看到。比如中等大小的细菌,1000个叠加在一起只有句号那么大。

微生物能够致病,能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂,但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素,这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广泛应用于工业发酵,生产乙醇、食品及各种酶制剂等;一部分微生物能够降解塑料、处理废水废气等等,并且可再生资源的潜力极大,称为环保微生物;还有一些能在极端环境中生存的微生物,例如:高温、低温、高盐、高碱以及高辐射等普通生命体不能生存的环境,依然存在着一部分微生物等等。看上去,我们发现的微生物已经很多,但实际上由于培养方式等技术手段的限制,人类现今发现的微生物还只占自然界中存在的微生物的很少一部分。

微生物间的相互作用机制也相当奥妙。例如健康人肠道中即有大量细菌存在,称为正常菌群,其中包含的细菌种类高达上百种。在肠道环境中这些细菌相互依存,互惠共生。食物、有毒物质甚至药物的分解与吸收,菌群在这些过程中发挥的作用,以及细菌之间的相互作用机制还不明了。一旦菌群失调,就会引起腹泻。

随着医学研究进入分子水平,人们对基因、遗传物质等专业术语也日渐熟悉。人们认识到,是遗传信息决定了生物体具有的生命特征,包括外部形态以及从事的生命活动等等,而生物体的基因组正是这些遗传信息的携带者。因此阐明生物体基因组携带的遗传信息,将大大有助于揭示生命的起源和奥秘。

工业微生物涉及食品、制药、冶金、采矿、石油、皮革、轻化工等多种行业。通过微生物发酵途径生产抗生素、丁醇、维生素C以及一些风味食品的制备等;某些特殊微生物酶参与皮革脱毛、冶金、采油采矿等生产过程,甚至直接作为洗衣粉等的添加剂;另外还有一些微生物的代谢产物可以作为天然的微生物杀虫剂广泛应用于农业生产。通过对枯草芽孢杆菌的基因组研究,发现了一系列与抗生素及重要工业用酶的产生相关的基因。乳酸杆菌作为一种重要的微生态调节剂参与食品发酵过程,对其进行的基因组学研究将有利于找到关键的功能基因,然后对菌株加以改造,使其更适于工业化的生产过程。国内维生素C两步发酵法生产过程中的关键菌株氧化葡萄糖酸杆菌的基因组研究,将在基因组测序完成的前提下找到与维生素C生产相关的重要代谢功能基因,经基因工程改造,实现新的工程菌株的构建,简化生产步骤,降低生产成本,继而实现经济效益的大幅度提升。对工业微生物开展的基因组研究,不断发现新的特殊酶基因及重要代谢过程和代谢产物生成相关的功能基因,并将其应用于生产以及传统工业、工艺的改造,同时推动现代生物技术的迅速发展。

经济作物柑橘的致病菌是国际上第一个发表了全序列的植物致病微生物。还有一些在分类学、生理学和经济价值上非常重要的农业微生物,例如:胡萝卜欧文氏菌、植物致病性假单胞菌以及中国正在开展的黄单胞菌的研究等正在进行之中。日前植物固氮根瘤菌的全序列也刚刚测定完成。借鉴已经较为成熟的从人类病原微生物的基因组学信息筛选治疗性药物的方案,可以尝试性地应用到植物病原体上。特别像柑橘的致病菌这种需要昆虫媒介才能完成生活周期的种类,除了杀虫剂能阻断其生活周期以外,只能通过遗传学研究找到毒力相关因子,寻找抗性靶位以发展更有效的控制对策。固氮菌全部遗传信息的解析对于开发利用其固氮关键基因提高农作物的产量和质量也具有重要的意义。[10]

在极端环境下能够生长的微生物称为极端微生物,又称嗜极菌。嗜极菌对极端环境具有很强的适应性,极端微生物基因组的研究有助于从分子水平研究极限条件下微生物的适应性,加深对生命本质的认识。

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