高通基因检测方法

① 研究蛋白质之间相互作用的实验方法有哪些

白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。x0dx0ax0dx0a一、酵母双杂交系统x0dx0a酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。x0dx0ax0dx0a二、噬茵体展示技术x0dx0a在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还茄手袜具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。x0dx0a三、等离子共振技术x0dx0a表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。x0dx0a四、荧光能量转移技术x0dx0a荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及颤激供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。x0dx0a五、抗体与蛋白质阵列技术x0dx0a蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。x0dx0a六薯知、免疫共沉淀技术 x0dx0a免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用[/url]的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。x0dx0a七、pull-down技术x0dx0a蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀（Co-IP） 、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。

② DNA序列是怎么测量出来的

大致过程也是先把 DNA 切成短序列模板，然后把这些短序列都放固定到要成像的 chip 上，每个短序列都是一个 polony，就是说在 chip 占据一个位置，在这个位置上固定的是一批通过 PCR 复制的这段序列的克隆。
然后就跟传统方法一样，配对生长，每长一个核苷酸，就成像一次，在图像上看就是无数的小点，每个小点对应一个 polony，回头通过分析就是这个 polony 对应序列的一个核酸（其实具体的技术还很不同，这么说太粗了）。这样生长下去，就能把每个 polony 的序列给测出来了。
好处当然是因为高通量，所以一下子就把一个基因组就测了（理论上）。缺点是，每个序列长度都短：长 polony 时，每一步都会因为种种问题，有些序列模板长不下去了，信号也会变弱。最后得到的序列长度相对传统方法就短一些。
短的问题是，它很难作 de novo 的测序，就是说，因为短序列之间的交叠太少，就无法从短序列合成出全部基因组（事实上，就是传统的 sanger 法，在染色体末端，因为有大量的重复序列，也是无法很好的测出的，所以人类基因组推出时，这段是没有的）。所以只能拿旧方法测出的全基因组作参考序列，把短序列对上去（alignment）。这样，也是越长，对得越准，出现不确定结果的可能越小。
类似的问题是，测序终归是要看这序列与已知序列的异同，就要面对有很多不同，短序列对很多基因变异的检测能力会下降，比如染色体的倍增这样的。
另外的问题是 coverage，就是说用这种高通路方法，生成的以亿计的 polony，看上去看多，但可能还是会错过部分基因组，而在某些部分有很多的短序列覆盖。早期的方法，好像是能覆盖 80％，也就叫全基因组测序了。