肝素生物检测方法

Ⅰ 正常人血浆中肝素的浓度是多少

血浆肝素水平的监测，现以凝固试验应用较多，如凝血酶时间、部分凝血活酶时间等〔1～3〕，这些方法均是以一段时间范围衡量肝素的抗凝活性，无法精确定量测定。最近有高效液相色谱法分离测定血中游离肝素含量的报道〔4〕。本文介绍用高效毛细管电泳法(HPCE)测定血浆中肝素含量，能直接定量测定，且与凝血酶法〔3〕测定结果进行对照，含量抗凝效果一致。本文
方法快速、方便、灵敏度高，能直接进行大剂量检测，且不受纤维蛋白降解产物(FDP)等其它因素的影响。与高效液相色谱法相比具有操作简便、自动进样等优点。

1 研究对象

正常人5名，体外循环10例(肝素钠，按360～500U/kg给药)，血液透析23
例(10例肝素钠、5例小剂量肝素钠、3例大剂量肝素钠分别按65、10.5、120U/kg
给药；5例肝素钙按50U/kg给药)以上均为一次性给药，给药后30min采血。

2 仪器与试剂

Bio-Focus 3000 Capillary Electrophoresis System(美国Bio—RAD公司)；未涂渍
毛细管(30cm×50μm，河北永年光导纤维厂)；肝素钠水溶液(250000U/L，上海
生物制药厂产品)，肝素钙水溶液(500000U/L，云南生化制药有限公司产品)。
以上2种肝素抗凝活性用美国药典(USP)的标准肝素钠(350000U/L)校正。与厂家
标示量相符。SDS(Bio—RAD，USA)电泳纯级，乙腈为色谱纯级，硼砂、氢氧化
钠均为国产分析纯级。

3 实验方法

3.1 血样处理 研究对象静脉采血2mL(109m mol/L的枸橼酸钠1∶9抗凝)，离心，
分离出血浆约1.0mL(3000g×15min)，加入乙腈(血浆与乙腈比例为2∶3)混匀，
充分混合后放置1min，待蛋白沉淀后再次离心(3000g×15min)，取上清液，仪器
自动进样。未经乙腈处理的血浆可保存，但不超过一周，不允许反复冻融。

3.2 对照品溶液的配制 精确取250000U/L的肝素钠、500000U/L的肝素钙各
10μL混合作为对照液，用双蒸水稀释成500μL。

3.3 电泳条件 25m mol/L SDS、pH8.5、25m mol/L硼砂电泳缓冲液，配制方
法及毛细管的处理方法按文献〔5〕。毛细管温度20℃，电压20kV，检测波长270nm，
自动压力进样55.16kPa。计算采用外标法，用样本与标准的峰面积比求得肝素含量。

4 结果

4.1 电泳图 肝素钠与肝素钙相对迁移时间均为2.58min，峰型对称，分离良好，
达到基线分离。正常人未检出肝素，见图1。含肝素钙血浆标本色谱图与肝素钠类似。

a.肝素钠 b.血浆中杂峰

4.2 线性范围与最低检测限 用双蒸水将250000U/L的肝素钠、500000U/L的
肝素钙水溶液分别稀释成0.1、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0(×103)U/L。
以所使用的肝素作相对标准，测得肝素量与峰扫描积分面积之间呈线性关系，回
归方程为：
Y＝131253.1X-13895.6 r＝0.9988

本实验条件下最低检测限为25U/L，S/N为2，肝素含量在80～7000U/L之间线
性关系良好。

4.3 回收率测定 取正常人血浆1mL 3份，分别加入250、1000、5000U/L肝素钠，
按上述方法测出峰面积与双蒸水稀释的标准积分面积对应，计算绝对回收率，每
份检测3次，得平均回收率分别为95.6％、97.5％、98.7％，RSD分别为6.2％、5.4％、
3.5％。

4.4 重复性测定 用2份浓度为500、2500U/L肝素钠测定20次，并作连续监测，
其批内RSD分别为3.24％、1.48％；批间RSD分别为4.48％、2.74％。

4.5 对研究对象含肝素血样用凝血酶法〔3〕和HPCE法分别进行测定，结果见表1。
两法结果近似，P＞0.05

两种方法测定血浆肝素含量比较(U/L，X±S)

组别 例数(n) 凝血酶法 HPCE
体外循环 10 5100±510 5230±490
血液透析
肝素钠 10 290±100 300±120
肝素钙 5 200±100 215±110
小剂量抗凝 5 100±20 110±30
大剂量抗凝 3 5345±1023 6043±60

Ⅱ 肝素化定义是什么

肝素化是指利用肝素这种生物活性物质进行的一系列生化反应过程。以下是关于肝素化的详细解释：

1. 肝素的基本性质：

   • 肝素是一种由葡萄糖胺组成的天然高分子化合物，主要存在于哺乳动物的肝脏内。
   • 肝素具有多种生物活性功能，主要包括促进抗凝和抑制血栓形成。

2. 肝素化的过程：

   • 肝素化涉及将肝素应用于特定的生物或医学领域，如血液透析、心脏手术等，以实现抗凝和防止血栓形成的治疗效果。

3. 肝素的医学应用：

   • 肝素主要通过注射方式给药，用于治疗各种血液高凝状态及预防血栓形成。
   • 肝素还可以与其他药物结合使用，用于治疗深静脉血栓、肺栓塞等疾病。
   • 在实验室研究中，肝素也常用于生物材料表面的肝素化修饰，以提高材料的抗凝血性能。

4. 肝素化的意义：

   • 肝素化在医学领域具有重要意义，可以有效预防和治疗血栓形成相关的疾病。
   • 随着对肝素研究的深入，其在再生医学、组织工程等领域的应用也在逐步拓展。

Ⅲ 高中生物中出现的各种试剂

高中生物实验中使用的试剂整理如下：

必修一 分子与细胞：
- 斐林试剂：检测生物组织中的糖类。
- 苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ：检测生物组织中的脂肪。
- 碘液：检测淀粉，结果为蓝色。
- 双缩脲试剂：检测蛋白质，含有至少2个肽键。
- 无水乙醇：提取色素。
- 体积分数为95%的酒精溶液：解离，与盐酸混合使用。
- 体积分数为70%的酒精溶液：杀死小动物，消毒。
- 甲基绿吡罗红（混合）染色剂：观察DNA和RNA在细胞中的分布。
- 盐酸8%：解离，作用于甲基绿吡罗红染色剂实验。
- 蔗糖溶液：使细胞失水。
- FeCl3溶液：催化过氧化氢分解。
- 澄清石灰水：检测二氧化碳，遇二氧化碳变浑浊。
- 溴麝香草酚蓝水溶液：检测二氧化碳，遇二氧化碳由蓝变绿再变黄。
- 重铬酸钾溶液：检测酒精，配制方法为溶于95%~97%的浓硫酸中。
- 层析液：分离色素，配制方法为20份石油醚、2份丙酮和1份苯混合。
- NaOH溶液：酚酞与NaOH相遇，呈紫红色。
- 龙胆紫溶液：将染色体染色，配制方法为溶解在2%醋酸溶液中。
- 醋酸洋红溶液：同龙胆紫溶液，用于染色。

必修二 遗传与进化：
- 卡诺氏液：固定细胞形态，用于低温诱导植物染色体数目变化。

必修三 稳态与环境：
- 台盼蓝：将死细胞染色。
- 酚红指示剂：检测pH，用于鉴别能够分解尿素的细菌。

选修一 生物技术实践：
- 洗洁精：消毒。
- 次氯酸钠溶液：消毒，用于外植体的处理。
- 甘油：用于甘油管藏。
- 酚红指示剂：检测pH，用于实验。
- 洗涤剂：瓦解细胞膜。
- 二苯胺：鉴定DNA，使用方法未提供。
- 酚类物质：用于农杆菌侵染单子叶植物伤口。
- Ca2+溶液：使大肠杆菌处于感受态。
- 聚乙二醇（PEG）：诱导细胞融合。
- 肝素：诱导精子获能。
- 钙离子载体A23187溶液：同肝素，用于诱导精子获能。

Ⅳ 肝素如何提取制作的

一、酶解-树脂法酶解

取100kg新鲜肠黏膜(总固体5%-7%)，加苯酚200ml
(0.2%)，如气温低时可不加。在搅拌下加入绞碎胰0.5-1kg(0.5%-1%)。

用
300-400g/L(30%-40%)NaOH溶液调节pH8.5-9，升温至40-45℃，保温2-3h。pH8,再加5kg粗食盐(5%)升温至90℃左右,用6mol/L
HCl调节pH 6.5左右,停止搅拌,保温20min,以布袋过滤,得酶解滤液。

二、盐解-树脂法

提取
取新鲜猪肠黏膜投入反应锅中，按30g/L(3%)加入氯化钠，NaOH调节pH9，逐步升温至50-55℃。保温2h，继续升温至95℃，维持10min，冷却50℃以下，用30目双层纱布过滤,收集滤液。

猪肠粘膜[NaCl;；NaOH]→[pH9；50-55℃]滤液吸附、洗涤、洗脱、沉淀
取冷却50℃以下的滤液，加入714型(强碱性)Cl-型树脂(新树脂用量为2%),搅拌8h后静置过夜。

三、CTAB*提取法

(*十六烷基三甲基溴化胺为长链季铵盐)提取、络合
按猪肠黏膜液(V)：Na2SO4(m)：硫酸铝(m):CTAB(V)=1:0.15:0.04:0.001的配料比投料。

取新鲜猪小肠黏膜投入反应罐中，搅拌下加入硫酸钠，溶解后，用碱液调节pH11-11.5，升温50℃，保温搅拌2h。再加硫酸铝，溶解后，用氢氧化钠调节pH7.5-8，升温至95℃,保温10min。

(4)肝素生物检测方法扩展阅读：

肝素的检测：

1、APTT

APTT依然是作为监测UFH的选择之一。它是非常简单，快速和便宜的项目。然而，却难以标准化。APTT检测需要整个凝血瀑布中的所有蛋白都是完整的，从而可以准确测量肝素水平。

2、硫酸鱼精蛋白中和试验

该试验是基于UFH，一个高度负电荷的分子，被硫酸鱼精蛋白，一个正电荷的蛋白，中和的原理。配备不同浓度的硫酸鱼精蛋白加入血浆中，再加入凝血酶，测量凝固时间。将凝血酶凝固时间恢复至正常的硫酸鱼精蛋白浓度就被认为是肝素的浓度。

3、抗Xa活性检测

发色底物法检测肝素抗Xa活性的原理都是一样的：标本中的肝素与AT形成复合物，抑制过量添加的Xa因子。剩余的Xa因子活性的测量，通过其与特异的底物作用，释放出pNA来进行。

参考资料来源：网络—肝素