rna融合基因检测方法

A. RNA的测序原理及方法！^~^

细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类，不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白，DNA等杂质，最终获得高纯度RNA产物的过程。

RNA 提取流程
1. 样品处理
从各种不同来源样品（如细菌、酵母、血液、动物组织、植物组织和培养细胞）,或同一来源样品的不同组织（如植物幼嫩叶片、成熟根、茎等）中提取高质量的RNA，因细胞结构及所含的成分不同，样品预处理的方式也各有差异。
样品的要求：
最好使用新鲜的样品或取样后立即在低温（-20℃或-70℃）冷冻保存的样品，避免反复冻融，因为这会导致提取的RNA降解和提取量下降。
样品预处理方式：
植物材料-液氮研磨
动物材料-匀浆、液氮研磨
细菌-溶菌酶破壁
酵母-液氮研磨、玻璃珠处理、混合酶破壁
2. 细胞裂解
异硫氰酸胍/苯酚法（TRIZOL）
这是一种传统的RNA提取方法，适用于大部分动植物材料，但对于次生代谢产物较多的植物材料提取RNA效果较差。异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离，并将RNA释放到溶液中，采用酸性酚-氯仿混合液抽提，低PH值的酚将使RNA进入水相，而蛋白质和DNA仍留在有机相，从而可以完成RNA的提取工作。
该法应用非常广泛，适用于包括动物组织、微生物、培养细胞等在内的各类动物性材料，同时还适用于次生代谢物较少的植物性材料，如幼苗、幼叶等。该法主要应用在动物组织和培养细胞的RNA提取中。
胍盐/ β- 巯基乙醇法：
适用于各种不同动物材料和次生代谢物少的植物材料。
在这种方法中，胍盐使细胞充分裂解，β-巯基乙醇作为蛋白的变性剂在实验全程中可以抑制RNaseA的活性，保护RNA不被降解。
我公司的“GREEN ”系列总RNA 提取试剂盒是基于这种方法开发的产品，分别适用于各类不同的材料。此系列产品的具体实验步骤和适用范围在实验技术手册中有详细介绍，实验者可根据自己的需要进行选择。
其它方法：
有些植物材料多糖多酚含量较高，如植物果实，番茄的叶子等，有些植物木质化程度较高，如根茎等组织。针对这类材料本公司推出了一种全新的植物总RNA提取试剂，该试剂特别适合于从富含多糖、多酚、淀粉的材料中提取纯度高、完整性好的总RNA，有关的具体步骤将在分论中详细介绍，实验者可根据自己的需要进行选择。

3. RNA 纯化及获得
纯化要求
RNA样品中不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染。排除DNA分子的污染。
纯化方法及沉淀
方法一：有机溶剂抽提法
氯仿抽提
在使用RNA提取试剂进行RNA提取时，常使用氯仿进行抽提，以去除蔗糖、蛋白等杂质，并促进水相与有机相的分离，从而达到纯化RNA的方法。在本公司的提取RNA的产品中，与TRIzol同型试剂法及其衍生试剂盒。
沉淀
氯仿抽提RNA后，一般采用了异丙醇或乙醇来沉淀水相RNA。加入0.6倍水相体积的异丙醇或与水相等体积的异丙醇，室温沉淀20-30分钟，高速离心，可获得RNA沉淀。
洗涤沉淀
加入无RNase的75%乙醇，将RNA沉淀振荡悬浮，使RNA沉淀中的盐离子被充分溶解。然后再离心10-30分钟。再次沉淀RNA。离心后，小心倒掉上清（注意不要倒出RNA沉淀），随后快速离心1-2秒，将残留在管壁上的乙醇手机到管底后，用小枪头吸净，超静台中风干1-2分钟（注意不要晾得太干，否则RNA沉淀不易溶解）。
溶解沉淀
加入适量RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。
方法二：硅基质吸附法
随着实验方法的改进，现已发展出一种采用吸附材料纯化核酸的方法。目前较常见的有：硅基质吸附材料、阴离子交换树脂和磁珠等。硅基质吸附材料因其具有可特异吸附核酸，使用方便、快捷、不使用有毒溶剂如苯酚、氯仿等优点，成为核酸纯化的首选。
本公司生产的总RNA提取试剂盒（ZP403-ZP407）和GREENspin系列总RNA提取试剂盒即采用硅基质吸附达到RNA分离纯化目的，通过专一结合RNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，使样品在高盐条件下与硅胶膜特异结合，而蛋白、有机溶剂等杂质不能结合到膜上而被洗脱，盐类则被含有乙醇的漂洗液洗涤，最后用RNase-free ddH2O将RNA从硅胶膜上洗脱下来。

B. 小分子RNA的检测方法

实时荧光定量PCR技术是1996年由美国Applied biosystems公司推出在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。该技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA (或cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA (或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。
目前市场上miRNA qPCR检测方法主要有以下两种：1. 两步法； 2.三步加尾法。两种方法的主要差别在于qPCR之前的cDNA制备过程（如图）。其中两步法是通过独特设计的茎环结构引物进行反转录将miRNA反转录成cDNA。而三步法则是给miRNA序列加polyA尾，之后再利用反转录过程将miRNA反转录成cDNA并加上独特设计的尾部序列。

两步法的优势在于特异性很高，但是最新的研究报道显示在编辑过程中，miRNA 的3’序列的多样化现象(Heterogeneity)，这种现象的发生使得目前市场上qPCR两步检测法的准确性受到影响（如图）。而三步法则不受这一现象的影响，而且随着科学家们的不断摸索创新，三步法的特异性如今已经可以和两步法媲美。更重要的是低廉的价格也是三步检测法越来越受到广大研发人员喜爱的重要原因。

C. 基因检测方法有哪些

基因是遗传的基本单元，携带有遗传信息的DNA或RNA序列，通过复制，把遗传信息传递给下一代，指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表达。基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术，是取被检测者外周静脉血或其他组织细胞，扩增其基因信息后，通过特定设备对被检测者细胞中的DNA分子信息作检测，分析它所含有的基因类型和基因缺陷及其表达功能是否正常的一种方法，从而使人们能了解自己的基因信息，明确病因或预知身体患某种疾病的风险。
基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗传性疾病的突变基因。应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。
一般有三种基因检测方法：生化检测、染色体分析和DNA分析。
1.生化检测
生化检测是通过化学手段，检测血液、尿液、羊水或羊膜细胞样本，检查相关蛋白质或物质是否存在，确定是否存在基因缺陷。用于诊断某种基因缺陷，这种缺陷是因某种维持身体正常功能的蛋白质不均衡导致的，通常是检测测试蛋白质含量。还可用于诊断苯丙酮尿症等。
2.染色体分析
染色体分析直接检测染色体数目及结构的异常，而不是检查某条染色体上某个基因的突变或异常。通常用来诊断胎儿的异常。
常见的染色体异常是多一条染色体，检测用的细胞来自血液样本，若是胎儿，则通过羊膜穿刺或绒毛膜绒毛取样获得细胞。将之染色，让染色体凸显出来，然后用高倍显微镜观察是否有异常。
3.DNA分析
DNA分析主要用于识别单个基因异常引发的遗传性疾病，如亨廷顿病等。DNA分析的细胞来自血液或胎儿细胞。
基因检测可以分为以下五类：
1.基因筛检
主要是针对特定团体或全体人群进行检测。大多数通过产前或新生儿的基因检测以达到筛检的目的。
2.生殖性基因检测
在进行体外人工授精阶段可运用，筛检出胚胎是否带有基因变异，避免胎儿患有遗传性疾病。
3.诊断性检测
多数用来协助临床用药指导。
4.基因携带检测
基因携带者如果与某些特殊基因相结合，可能会导致下一代患基因疾病，通过基因携带者的检测可筛检出此种可能，作为基因携带者婚前检查、生育时的参考。
5.症状出现前的检测
检测目的是了解健康良好者是否带有某种突变基因，而此基因与特定疾病的发生有密切的联系。
临床意义
1.用于疾病的诊断
如对结核杆菌感染的诊断，以前主要依靠痰、粪便或血液培养，整个检验流程需要在两周以上，采用基因诊断的方法，不仅敏感性大大提高，而且在短时间内就能得到结果。
2.了解自身是否有家族性疾病的致病基因，预测患病风险
资料证实10%～15%的癌症与遗传有关，糖尿病、心脑血管疾病等多种疾病都与遗传因素有关。如具有癌症或多基因遗传病（如老年痴呆、高血压、糖尿病等）的人可找出致病的遗传基因，就能够有针对性地调整生活方式，预防或者延缓疾病的发生。
3.正确选择药物，避免滥用药物和药物不良反应
由于个体遗传基因上的差异，不同的人对外来物质产生的反应也会有所不同，因此部分患者使用正常剂量的药物时，可能会出现药物过敏、红肿发疹的现象。根据基因检测的结果，可制定特定的治疗方案，从而科学地指导使用药物，避免药物毒副反应。