基因多态性检测方法提取DNA

1. 基因检测怎么采集DNA基因样本

基因是遗传的基本单元，携带有遗传信息的DNA或RNA序列，通过复制，把遗传信息传递给下一代，指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表达。基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术，是取被检测者外周静脉血或其他组织细胞，扩增其基因信息后，通过特定设备对被检测者细胞中的DNA分子信息作检测，分析它所含有的基因类型和基因缺陷及其表达功能是否正常的一种方法，从而使人们能了解自己的基因信息，明确病因或预知身体患某种疾病的风险。
基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。

2. DNA多态的类型、特点及其应用

DNA多态的类型、特点及其应用
一
在刑事案件的侦破工作中，常常要检验血痕、精斑、唾液等现场遗留物的血型物质是哪个种属，并同嫌疑人进行对照、比较，确认异同。这种血型鉴定是法医物证检验中最常用的技术手段。
最早意义上的血型仅指血红细胞表面抗原的四种类型（A、B、AB、O）。当今血型检验的系统己经大大扩展，可以在刑事技术部门实际应用的血斑检验系统15-20个，精班检验系统5一6个（均含血型、血清型和酶型系统）。譬如，设在伦敦的国际刑警组织实验室常规检验血液项目为13项，检验精液项目为5项，因而排除嫌疑的比率明显增大。但是，各检验项目的联合排除率并不等于各项目独立排除率的简单相加，而是：P=l-l（l-P1）（l-P2）……（l-Pn）。其中，Pl、P2……Pn分别代表各独立血型系统的排除率，P为联合排除率。从理论上可以看出，尽管检验项目扩展，但最终不能达到同一认定的目的。而DNA检验技术，则解决了这个关键问题。
法医物证的DNA检验技术是本世纪80年代中期才开始研究和应用的，它借助了新兴的“分子生物学”和“遗传工程学”的理论与技术。早在19世纪60年代，奥地利遗传学家孟德尔在运用数学方法对植物遗传性状进行多年分析研究的基础上，提出了着名的孟德尔遗传定律，预言了遗传因子的存在。到20世纪40年代，美国学者艾弗里等人证明了遗传因子就是脱氧核糖核酸。1953年，美国生物学家沃森（JamsWatson）和英国物理学家克里克（FrancisCrick）发现并提出了DNA分子的双螺旋结构理论与碱基配对原则，开创了分子生物学。1989年，美国科学家用“扫描隧道显微镜”直接观察到了脱氧核糖核酸的双螺旋结构。1990年，我国青年科学家白春礼用自己研制的“扫描隧道显微镜”首次观察到人们尚未认知的三链状脱氧核糖核酸，为生命信息研究又辟新途。在60年代，经过许多科学家的共同努力，破译了遗传物质中的全部密码，使人类对遗传物质的认识进入了新的阶段；1973至1974年，美国斯坦福大学的科恩博士在实验室运用重组DNA的方法，改变了生物的遗传信息，也改变了生物的遗传性状，开创了遗传工程学。1985年，英国莱斯特大学三名遗传学家亚历克·杰费里斯（AlecJeffroys）、彼得·吉尔（PeterGil1）、戴维·沃雷特发现每个人的DNA分子中，碱基的排列都是独特的。事实上，除了同卵双生子的DNA结构有相同的可能性之外，没有任何两个人存在相同的DNA.这一重大发现立刻引起法医学界的高度重视，各国纷纷投向这一领域的研究。英国首先在移民纠纷中应用DNA检验手段确认母子亲缘关系。
二
DNA是脱氧核糖核酸的英文（DoXyriboNucleicAcid）缩写。它是在生物细胞核中普遍存在的大分子聚合物。它具有“自我复制”及“互补合成RNA（核糖核酸）”二项功能，使生物体的遗传性状得以在新生体上体现，因而被称为“遗传基因”。DNA的化学组成包括磷酸（P）、脱氧核糖（S）和四种含氮碱基：腺嘌呤脱氧核苷酸（dAmp）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGmp）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCmp）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTmp）。DNA的分子结构为两条平行但方向相反的多个核苷背酸聚合长链，围绕一个中心轴相对旋转成双螺旋状（见图一）
每条长链的外侧排列着磷（P）和脱氧核糖（S），内侧排列的四种碱基依照A=T、T=A、G=C、C=G的对应关系由氢键连接，使双链成一整体。在不同的DNA分子中，S与P的排列结构是相同的（一S一P一S一P一），但碱基的排列顺序不同。DNA分子中的碱基虽只四种，但由氢键连接的碱基对的数目少则几千，多则数万，组成极多的不同排列顺序。这就构成了DNA分子结构的多样性，从理论上解决了同一认定问题。
DNA分子的复杂结构具有三个重要特性：（1）人各不同；（2）终生不变；（3）同一人体各不同部位细胞中的DNA结构相同。法医物证检验正是利用了这些可贵特性，依据摄取的DNA结构图谱进行个体识别。这同利用指纹进行个体别的准确性相同，因而又被称为“DNA遗传指纹图谱”。
三
目前，各国专家一般采用化学方法分离DNA，再用特殊的DNA探针检验，可以获得代表每个人独特基因组的DNA图谱。其程序包括七个环节：
1、提龋先将DNA从检材细胞核中提取出来。不同检材的性质不同，提取和纯化DNA的方法也不完全相同。如对精液与阴道分泌物混合的检材：先裂解、洗涤，清除女性物质后，获得纯精子，再裂解取出DNA.
2、酶解。由特定的限制性内切酶裂解DNA分子长链。由于每个人DNA分子中碱基排列呈现多样性，所以酶切碱基后，就获得在数量和长度上体现个体差异的若干DNA片段。
3、电泳。琼脂糖凝胶是一层充满网孔的胶状物，在电泳时，其一端为正极，另一端为负极。DNA片段带负电，当将它加在凝胶负极板后，就会向正极缓慢泳动，泳动速度和距离取决于片段长度大校经过一段时间，DNA片段按长短顺序排列开来。
4、转移。经电泳展开的DNA片段通过吸印或真空转移法，转移并固定到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。
5、探针标记与杂交。所谓探针标记，就是使用专门的特殊试剂，经过特定的反应，在不破坏DNA排列结构的前提下，使DNA片段能产生放射线（同位素探针），或显色发光（非同位素探针），从而可以识别DNA片段。标记好的探针需与附着有DNA片段的转移膜温育，才能结合，这个过程叫“杂交”。杂交后清洗未结合的多余探针。
6、显影。将杂交好的膜与X光感光片重合放在暗盒内感光，再经显影、定影，即得到DNA图谱。
7、检验。将检材DNA图谱与嫌疑样本DNA图谱进行谱带比较。一般若有15条以上谱带相同，又不存在差异（不吻合谱带），则可做认定结论。但现场检材会由于各种客观原因，使DNA图谱不完整，所以用15条以上谱带完全吻合为标准是不现实的。据观察统计：每个个体平均具有的谱带数16·8条，两个不相关的个体间具有一条相同谱带的概率为0·21，具有二条相同谱带的概率为

3. 如何用dnasp分析多态性原理是什么

RAPD技术是建立在PCR技术的基础上，它用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链(一般为10个bp)作为引物，对所研究的基因组DNA进行单引物扩增。模板DNA经90—94变性 解链后在较低温度(36～37℃)下退火，这时形成的单链模板会有许多位点与引物互补配对，在 72℃下，通过链延伸，形成双链结构，完成DNA合成。重复上述过程，即可产生片段大小不等的扩增产物，通过电泳分离和显色便可得到许多不同的条带，从中 筛选出特征性条带。扩增产物片段的多态性反映了基因组DNA的多态性。如果基因组在这些区域内发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合 位点的分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。因此，通过对PCR产物的检测即可测出基因组DNA在这些区域的多态性。进行 RAPD分析时，可用引物的数量很大，虽然对每个引物而言，其检测基因组DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基 因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。

RAPD技术的优点：
①不使用同位素，减少了对工作人员健康的危害；
②可以在物种没有任何分子生物学研究 的情况下分析其DNA多态性；
③对模板 DNA的纯度要求不高；
④技术简单，无需克隆DNA探针，无需进行分子杂交；
⑤灵敏度高，可提供丰富的多态性；
⑥RAPD引物没有严格的种属界限，同一套 引物可以应用于任何一种生物的研究，因而具有广泛性、通用性。
但是，RAPD技术较易受到各种因素的影响。无论是模板的质量和浓度，短的引物序列，PCR的循环次数，基因组DNA的复杂性，技术设备等，都有可 能是RAPD技术重复性差的直接原因。目前，多从以下几个方面来提高反应的稳定性：
①操作规范，反应体系的组成要力求一致，尽可能地使RAPD反应标准 化；
②提高扩增片段的分辨率；
③将RAPD标记转化为SCAR标记后再进行常规的PCR分析，可以提高反应的稳定性及可靠性。
,

4. PCR-RFLP检测基因多态性的机理和主要实验步骤

基因多态性的产生原因是一个也可以是多个核酸序列有所差异，而不产生显性的生物结果．
造成的对于实验原理的影响是，该差异通常造成产生一个酶切位点的特性，而无差异则不具有，也可以是原来有，差异后消失．总之可以利用酶切来判断有无这种差异．
PCR的作用主要是扩充酶切原料，所以PCR的引物设计在你下一步要切割的两侧即可，PCR通常的高效扩充大约是复制100-500个BP的产物，当然随着现代技术的提高，也没有必要强行复合这个原则．
另外，由于将来切完了要电泳看，所以最好设计的时候切的位置不在中心．当然这点我觉得不是那么重要了．
PCR完跑跑电泳试试，能清晰看到就好．
然后就内切酶来切，注意避免incomplete
digest,就是最好切的时间充足BUFFER浓度要正确．
切完了跑，能看出不同的，就是有差异．
举例，原本含有GGACCC，有差异的是GGGCCC，那么原本的不能被APAI
切，有差异的能．
PCR复制，不管是啥，把这段争议的包含在里面，然后APAI切了跑．比如说复制500BP，切了以后理论是200+300
如果完全不切，只见500，那就是没差异序列存在．
如果既有500，也有200
+300，
那么就可能是一个序列有，另外一个无．当然，也可能是酶切不彻底，要避免．
如果只有200+300，那么就是两个序列都有．
最后基本上定论还是需要SEQUENCING来定．
RFLP常常是用来SCREENING一下．

5. DNA怎么提取

DNA提取主要是CTAB方法，其他的方法还有物理方式如玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。化学方式如异硫氰酸胍法、碱裂解法。生物方式：酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有；硅质材料、阴离子交换树脂等。

提取DNA总的原则:

1.保证核酸一级结构的完整性；

2.核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

3.其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；

4.其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。

例如 : 用酶法提取

DNA提取分为三个基本步骤，每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。

工具/原料: 研磨棒、研磨仪或者组织破碎仪 , 氯仿：异戊醇（24:1）或者蛋白酶 , RNA酶 , 酒精 , 冰箱

方法/步骤 :

1. 使用研磨仪、研磨棒或者使用超声破碎细胞的方法破碎细胞，加入去污剂，如sds等，除去膜脂。

2. 去除细胞内的蛋白质，包括与DNA结合的组蛋白，通过加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚／氯仿抽提等方法去除。

3. 加入RNA酶去除RNA，如实验不严密，可省略此步。

4. 沉淀DNA，需在冷乙醇或异丙醇中沉淀，放在冰箱-20℃沉淀30分钟以上，原理是DNA在醇中不可溶而黏在一起发生沉淀。

总结: DNA提取方法有下面⑦种

一.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小为100-150kb

二.甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。

三.玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。

四.异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）

五.表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

六.加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。

七.碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。

6. 要做基因多态性分析，哪种方法提取DNA要好点

1．限制性片段度态性（Restriction Fragment Length PolymorphismRFLP）：由DNA 态性致使DNA 限制酶切位点及数目发改变用限制酶切割基组所产片段数目每片段度同即所谓限制性片段度态性导致限制片段度发改变酶切位点称态性位点早用Southern Blot/RFLP检测采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合现采用PCR-RFLP进行研究基限制性片段度态性
2．单链构象态性（SSCP）：种基于单链DNA构象差别点突变检测相同度单链DNA顺序同甚至单碱基同形同构象电泳泳速度同PCR产物经变性进行单链DNA凝胶电泳靶DNA若发单碱基替换等改变现泳变位（mobility shift）用于鉴定否存突变及诊断未知突变

7. 提取基因组DNA的方法有哪些各有何优缺点

1、苯酚氯仿抽提法

优点是采用了实验室常见的试剂和药品，做起来成本比较低廉。

缺点是由于使用了苯酚、氯仿等试剂，毒性较大，长时间操作对人员健康有较大影响，而且核酸的回收率较低，损失量较大，由于操作体系大，不同实验人员操作重复性差，不利于保护RNA，很难进行微量化的操作。

2、离心柱法

离心柱法DNA提取它的优点是比传统的酚氯法提取的纯度高，有利于RNA保护，而且能进行微量操作，以其低廉的价格和相对便捷的操作，渐逐取代了传统DNA提取方法，被高校科研所等市场普遍接受。

离心柱法DNA提取的缺点是需要较多的样本，耗材多，对于珍稀样本无能为力，特别是在法医、考古等领域显得力不从心。

同时离心柱法DNA提取需要反复离心，不便于高通量、自动化操作，与现代生物学实验的高通量、自动化要求格格不入，特别是在基因诊断、疾病检测、转基因检测等领域，离心柱法DNA提取需要大量的操作人员及仪器设备。

当面对突发疫情时，更是需要有高通量的DNA提取设备与方法才能更有效准确的监测疫情、控制疫情。

3、磁珠法

磁珠法是纳米科技与生物技术的完美结合，具有其他DNA提取方法无法比拟的优势，主要体现在：

（1）能够实现自动化、高通量操作，配合96孔的核酸自动提取仪，在以往做一个样品的提取时间内可同时实现对96个样品的处理，效率直接提高96倍，满足了当前生物学高通量操作的要求，使得在大规模疫情爆发时能够进行快速筛查原因，这个优点是其他方法难以赶超的。

（2）操作简单、用时短，整个提取流程只有裂解、结合、洗涤、洗脱四步短时间内即可完成。

（3）安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害少，保护了实验人员的身体健康。

（4）磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。

（5）灵敏度高，适合法医样本等痕量DNA提取。

(7)基因多态性检测方法提取DNA扩展阅读：

磁珠法的原理是在磁珠表面修饰有对核酸有吸附作用的特定活性官能基团，通过不同的裂解液结合液洗涤液在特定的条件下能够与目的物质进行特异性结合，同时利用磁珠自身的磁性，在外磁场的作用下可以方便地实现定向移动与富集，从而达到核酸与杂质分离的目的，进而实现对目标物质的分离纯化，获得纯化核酸。

8. 我的试验是要做一个基因多个位点的多态性，先提取基因组DNA,然后PCR扩增目的片段，之后酶切

酶，是限制性内切酶。每种酶会在DNA上寻找特异的碱基排列，找到后再在特定位置进行剪切，把DNA双链剪短。跑琼脂糖电泳时就会看到，含有酶切位点的DNA变小了，而不含的维持原来大小。这种多态性检测，就是通过观察片段大小判断酶切位点碱基是否有变化。

9. 植物DNA提取中怎样检测提取到DNA质量

第一种方法是测量260/280的比例，判断是否有蛋白质的污染。在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收，A260与A280之比应在1.75-1.80之间。低于此值表明制备物中残留蛋白质成分较高或含有酚，高于此值表明有RNA的残留。

第二种方法是凝胶电泳分析，看有无断裂降解。

影响DNA提取质量的因素：

如果实验开始植物样品不经液氮处理，则提取液中的CTAB浓度需要提高到4%。

在大多数情况下，使用0.1%巯基乙醇，并不能完全抑制叶片中的氧化作用。但这种氧化作用不会影响限制性内切酶的活性。如果使用的巯基乙醇浓度高于0.1%，则会大大降低DNA提取的得率。

(9)基因多态性检测方法提取DNA扩展阅读：

DNA的提取方法：

一、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯萃取，高速离心后取上清，所得DNA大小为100-150kb

二、甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA可得DNA200kb左右。

三、玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DNA沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。

四、异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶状态）

五、表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

六、加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可用于PCR反应。

七、碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取上清，含少量DNA。