酶内杂质可采用的检测方法

1. 酶的分离和纯化方法是什么

酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。

首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。

酶分离纯化的最终目的是获得单一纯净的酶，因此，容许在不破坏“目的酶”的限度内，使用各种手段;酶与底物和抑制剂的结合常使其理化性质和稳定性发生改变，这种特性已被用于酶的分离纯化。

由于酶及其来源的多样性及与之共存的高分子物质的复杂性，目前还很难找到一种通用的方法以适用于一切酶的纯化。为了使一种酶达到高度纯化，往往需要多种方法协同作用，通过酶活性的跟踪检测确定最佳流程。

(1)酶内杂质可采用的检测方法扩展阅读：

酶的本性是蛋白质，凡可用于蛋白质分离纯化的方法都同样适用于酶，但酶易失活，故分离纯化需在低温(4℃)、温和pH(4<pH>10)等条件下进行。

与蛋白质类似，酶易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，因此操作中应尽量减少泡沫形成，此外重金属易使酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏。

在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称是分离纯化。

2. 酶活力测定的方式方法有哪些

测定酶活力，可用物理法，化学法或酶分析法等方法。常用的方法有：第一，在适当的条件下，把酶和底物混合，测定生成一定量产物所需的时间，此即终点法。第二，将酶和底物混合后隔一定时间，间断地或连续地测定反应的连续变化，如吸收度的增加或减少。
第三，将酶与底物混合后，让其反应一定时间，然后停止反应，定量测定底物减少或产物生成的量。后两种方法称为动力学法或反应速率法：按取样及检测的方式可称为取样测定法或连续测定法。
（1）定时法：（两点法）

通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。其中t1往往取反应开始的时间。

酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，通过加入强酸、强碱、蛋白医学教育网整理沉淀剂等，使反应完全停止（也叫中止反应法）。加入试剂进入化学反应呈色测出底物和产物的变化。

该法最基本的一点是停止反应后才测定底物或物的变化。

优点：简单易行，对试剂要求不高。

缺点：难保证测定结果的真实性。

难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。随着保温时间的延续，酶变性失活加速。

（2）连续监测法：

又称为动力学法或速率法、连续反应法。

在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。

连续监测法根据连续测得的数据，可选择线性期的底物或产物变化速率用于计算酶活力。

因此连续监测法测定酶活性比定时法更准确。

实际工作中，采用工具酶的酶偶联法已经成为医学教育网整理应用最广、最频繁测酶活性浓度的方法。

（3）平衡法：

通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。

3. 酶联免疫吸附测定的方法类型和操作步骤

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。该法适于测定细胞培养上清、血清、血浆及组织液中的样本，干扰小可以测到每毫升纳克水平的细胞因子（或受体）的水平。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2）用脱脂奶粉或BSA进行封闭。洗涤除去多余的脱脂奶粉或BSA。
（3）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
（4）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
（5）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显着提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：
（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：
（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。
（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。
（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。
（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。
亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。
ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色.

4. 溶菌酶含量的测定方法

那要看你用什么方法测定dna和rna：
（1）紫外吸收法也就是测量od（260）和od（280）的吸收值，这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点，因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收。
（2）荧光法，用picogreen荧光染料，测定dna，rna浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量dna和rna，并且受其它杂质的影响不大，缺点要有专门的荧光检测仪器，试剂比较昂贵。
纯化dna可以买试剂盒，主要有膜吸附法，磁珠分离法，都很方便。

5. 酶联免疫检测的几种方法及其原理

（1）酶联免疫吸附试验（enzyme
linked
immunosorbent
assay,ELISA）：是将抗原或抗体吸附在固相载体表面。使抗原抗体反应在固相载体表面进行。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。
（2）夹心法（sandwich
assay）:将已知的特异抗体包装在固相载体（塑料板凹孔或纸片上），加入待检标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。
间接法（indirecr
ELISA）常用于检查特异抗体。先将已知特异抗原包被固相载体，加入待检标本（可能含有相应抗体），再加入酶标抗Ig的抗全（即第二抗体），经加底物显色后，根据颜色的光密度计算出标本中抗体的含量。
（3）BAS-ELISA：近年来对酶免设分析法的改进是使用生物素-亲合素-过氧化物酶复合物作为指示剂，组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。一个亲合素（avidin）分子可以结合4个生物素分子（biotin）。结合非常稳定。亲合素和生物素都可与抗全、酶、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲合素。因此大提高检测的敏感度。目前应用生物-酶标亲合素系统（biotinavidin
system-
ELISA,BAS-ELISA），它是通过生物素标记抗体连接免疫反应系统，同时借助生物素化酶或酶标亲合素引入酶与底物反应系统。

6. 淀粉酶的测定方法有哪些

植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解成麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性最强。植物中有α–淀粉酶和β–淀粉酶，其活性因植物的生长发育时期不同而有所变化。通过本实验掌握淀粉酶的提取和测定方法。
原理：
α–淀粉酶和β–淀粉酶，各有其一定的特性，如β–淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α–淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。通常提取液中同时有两种淀粉酶存在，测定时，可根据它们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可测出另一酶的活性。将提取液加热到70℃维持15 min以钝化β–淀粉酶，便可测定α–淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6之醋酸在0℃加以处理，钝化α–淀粉酶，以求出β–淀粉酶的活性。
淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5–二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原生成3–氨基–5–硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。