天然蛋白纯度检测方法开发

‘壹’ 蛋白质纯度的测定方法有哪些在线等答案

超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量.
含量测定方法很多：
凯氏定氮：灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％，干扰少，费时8小时
双缩脲法（Biuret法）：灵敏度低1～20mg，中速20~30分钟
紫外吸收法：较为灵敏50～100mg，快速5～10分钟
Folin－酚试剂法（Lowry法）：灵敏度高 ～5mg，40～60分钟，操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化
考马斯亮蓝法(Bradford法)：灵敏度最高1～5mg，5～15分钟，常用

分子量测定：
SDS-PAGE：还原SDS测定结果比较接IC-MS，价格适中，常用
高效凝胶过滤色谱：标准蛋白质和待测蛋白质形状一致时，准确高，差别越大越不准确
电喷雾离子化质谱：最准确

等电点测定：在不同pH条件下测量蛋白质的电泳迁移率，然后用迁移率对pH作图，对应于迁移率为零的pH就是蛋白质的等电点。

‘贰’ 说明常用蛋白质测定方法的原理,并对各种方法加以比较

1、凯氏定氮法

准备4个50mL凯氏烧瓶并标号，想1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品，另外两个烧瓶作为对照，在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物，再加入浓硫酸，将4个烧瓶放到消化架上进行消化。

消化完毕后进行蒸馏，全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量，直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点，结算出蛋白质含量。

2、双缩脲法

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，硫铵不干扰显色， Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。

利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线，将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合，并只加入硫酸钠不含血清的试管作对照，将两支试管加入等量的双缩脲试剂，混合后于37℃环境中放置10分钟，在540nm波长进行比色，以对照管调零，读取吸光度值，标准曲线上直接查出蛋白质含量。

3、酚试剂法

取6支试管标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量加入蒸馏水补足而保持一致，混合均匀，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

4、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

5、考马斯亮蓝法

Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。

标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。

将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，出现沉淀，过滤除去。

每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min。根据标准曲线计算待测样本的浓度。

‘叁’ 鉴定蛋白质纯化产品的纯度，有哪些常用方法

常用色谱法，通过标准品对照图谱进行，分析包括分子筛(大小)、亲和层析（特异性结合）、离子交换（带电性）、疏水（水溶性）；或是沉淀法，包括等电点沉淀、差速离子心沉淀、盐析沉淀、亲和沉淀；透析超滤法；电泳法。这些法说不上常不常用 ，都是根据要分析的蛋白性质决定的。

‘肆’ 常用的蛋白质含量测定方法有哪些

①凯氏定氮法
原理：蛋白质平均含氮量为16%。当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
②双缩脲法
原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 (数mg)，且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰，但 准确度 较高，不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+， Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
灵敏度较高(约 0.1 mg)，但较麻烦，也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。 步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：
蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）
⑤色素结合法（Bradford 法）
直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当 CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。当样本中的蛋白质越多，吸到蛋白质上的CBG也多，蓝色也会增强。因此，蓝色的呈色强度，是与样本中的蛋白质量成正比。
间接测定法：蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素，以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4’-二羧-2,2’-二喹啉）法与Lowry法相似，主要差别在碱性溶液中，蛋白质使Cu2+转变Cu+后，进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色，在波长562 nm有强的吸收。
它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。灵敏度Lowry法相似。
本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度，较不受干扰，但会受还原糖 及EDTA的干扰。
⑦胶体金测定法
胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，呈洋红色，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合。
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色，颜色的改变与蛋白质有定量关系，可用于蛋白质的定量测定。
⑧其他方法
有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团，如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团，可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 (如镉)，则可追踪该金属。

‘伍’ 如何用HPLC进行蛋白质纯度检测及含量测定或测相对分子量

首先，蛋白质的测定一般用凝胶渗透色谱
分子量测定：用hplc测定几个分子量已知的蛋白质，绘制分子量与调整保留时间相对应的标准曲线，然后再在相同条件下测未知蛋白的保留时间，用标准曲线对照即可的未知蛋白的分子量；
含量测定：用蛋白质标样配制一系列不同浓度的蛋白质溶液，绘制蛋白质浓度与峰高/峰面积相关的标准曲线，再在相同条件下测位置样品的峰高/峰面积，即可得未知样品的浓度；
纯度测定：保证待测样品中所有组份均出峰的情况下，用目标蛋白的峰面积/峰高除以所有峰峰面积/峰高的总和即可的目标蛋白的纯度。

‘陆’ 蛋白质的定量测定方法

一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：

NH2 CH2 COOH+3H2 SO4 ――2CO2 +3SO2 +4H2O+NH3 (1)

2NH3 +H2 SO4 ――(NH4 )2 SO4 (2)

(NH4 )2 SO4 +2NaOH――2H2 O+Na2 SO4 +2NH3 (3)

反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白

氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。

二、双缩脲法（biuret法）

（一）实验原理

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材

1.试剂：

（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NaOH配制。

（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4•5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

2.器材：

可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

（三）操作方法

1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

2、样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

三、folin―酚试剂法（lowry法）

（一）实验原理

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin―酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin―酚试剂中的磷钼酸盐―磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

folin―酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠―氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠―氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

进行测定时，加folin―酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定，但上述还原反应只在ph=10的情况下发生，故当folin一酚试剂加到碱性的铜―蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸―磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

‘柒’ 如何用高效液相色谱（HPLC）进行蛋白质的纯度检测及含量测定或者测分子量

寻找钙蛋白质的标样配置不同浓度京HPLC分析后作一条工作曲线，然后取待测样品测试，根据工作曲线可以求出样品中该蛋白质的真实含量，从而计算出纯度/含量；至于分子量，需要用凝胶渗透色谱（GPC）进行测定。

‘捌’ 蛋白质纯度鉴定的方法有哪些

电泳,
蛋白质电泳 现在常用就是 SDS 聚丙乙烯酰胺凝胶电泳
特点
1）灵敏度高
2）测定快速、简便
3）干扰物质少
液相色谱
高效液相色谱是完全可以纯化蛋白质并且进行蛋白质纯度鉴定的
但建议还是使用蛋白质电泳 最主流 最有效的方法

‘玖’ 蛋白质纯度的测定方法有哪些在线等答案

超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量.
含量测定方法很多：
凯氏定氮：灵敏度低，适用于0.2~
1.0mg氮，误差为
±2％，干扰少，费时8小时
双缩脲法（Biuret法）：灵敏度低1～20mg，中速20~30分钟
紫外吸收法：较为灵敏50～100mg，快速5～10分钟
Folin－酚试剂法（Lowry法）：灵敏度高
～5mg，40～60分钟，操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化
考马斯亮蓝法(Bradford法)：灵敏度最高1～5mg，5～15分钟，常用
分子量测定：
SDS-PAGE：还原SDS测定结果比较接IC-MS，价格适中，常用
高效凝胶过滤色谱：标准蛋白质和待测蛋白质形状一致时，准确高，差别越大越不准确
电喷雾离子化质谱：最准确
等电点测定：在不同pH条件下测量蛋白质的电泳迁移率，然后用迁移率对pH作图，对应于迁移率为零的pH就是蛋白质的等电点。

‘拾’ 蛋白质纯度鉴定最好的两种方法

SDS 聚丙乙烯酰胺凝胶电泳（算是相对较好的）

考马斯亮兰法双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度