肠道杆菌致病性精确的鉴别方法

1. 大肠杆菌的检验标准

细菌的分离鉴定
1、标本：肠道外感染取中段尿、血液、脓液、脑脊液等，腹泻者取粪便。
2、分离培养与鉴定：粪便标本直接接种肠道杆菌选择性培养基。血液需先经肉汤增菌，再转种血琼脂平板。其他标本可同时接种血琼脂平板和肠道杆菌选择性培养基。37℃孵育18～24小时后，观察菌落并涂片染色镜检。采用一系列生化反应进行鉴定。肠致病性大肠杆菌须先作血清学定型试验。必要时检定肠霉毒素。
泌尿系统除确定大肠杆菌外，还应计数，每毫升尿含菌量≥100，000时，才有诊断价值。
卫生细菌学检查
大肠杆菌不断随粪便排出体外，污染周围环境和水源、食品等。取样检查时，样品中大肠杆菌越多，表示样品被粪便污染越严重，也表明样品中存在肠道致病菌的可能性越大。故应对饮水、食品、饮料进行卫生细菌学检查。
1、细菌总数：检测每毫升或每克样品中所含细菌数，采用倾注培养计算。中国规定的卫生标准是每毫升饮水中细菌总数不得超过100个。
2、大肠菌数指数：指每立升中大肠菌群数，采用乳糖发酵法检测。中国的卫生标准是每1000ml饮水中不得超过3个大肠菌群；瓶装汽水、果汁等每100ml大肠菌群不得超过5个。

2. 如何进行致病性大肠杆菌的分离培养

如何进行致病性大肠杆菌的分离培养
致病性大肠杆菌的普通的大肠杆菌其实在一般培养基上的菌落形态和生化反应是完全一样的，因此目前分离致病性大肠杆菌的方法主要是通过血清凝集，简而言之就是把样品划线接种在培养基上，挑取尽可能多的大肠杆菌菌落进行血清凝集而证实之。某些方法，比如免疫磁珠集菌法可以提高分离率。
分离培养与鉴定：粪便标本直接接种肠道杆菌选择性培养基。血液需先经肉汤增菌，再转种血琼脂平板。其他标本可同时接种血琼脂平板和肠道杆菌选择性培养基。37℃孵育18～24小时后，观察菌落并涂片染色镜检。采用一系列生化反应进行鉴定。肠致病性大肠杆菌须先作血清学定型试验。必要时检定肠霉毒素。

3. 检验大肠杆菌

用伊红美蓝染液检测，大肠杆菌群落呈现深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落。有很浓郁的酸败味。

4. 肠道致病菌的分类及常用检测方法

根据可培养细菌的数量分类在肠道菌群中，可以培养到的细菌有400余种，依据其数量多少可以分为主要(优势)菌群(predominant microflora)和次要菌群(sub—dominant microflora)。

①主要(优势)菌群：指肠道菌群中数量大或种群密集度大的细菌，一般在10～10cfu/g以上，包括类杆菌属、优杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属和梭菌属等专性厌氧菌，通常属于原籍菌群。优势菌群是对宿主发挥生理功能的菌群，在很大程度上影响着整个菌群的功能，决定着菌群对宿主的生理病理意义。

②次要菌群：数量在10～10cfu/g以下，主要为需氧菌或兼性厌氧菌，如大肠杆菌和链球菌等，流动性大，有潜在致病性，大部分属于外籍菌群或过路菌群。

检测方法：

1、采样及稀释

（1）按无菌操作法将检样25g（或25mL）放于含有225mL无菌水的三角瓶中（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以8000～10000r/min的速度离心1min，做成1：10的稀释液。

（2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1Ml，注入含有9mL无菌水的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支lmL灭菌吸管，按上述操作依次作l0倍系列稀释液。

（3）根据食品的卫生要求或对检验样品污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。

2、乳糖初发酵试验

即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双倍乳糖胆盐发酵管。

lmL及1mL以下者，用单倍乳糖胆盐发酵管。每一个稀释度接种3管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

3、分离培养

将产气的发酵管分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板，置36±1℃温箱内培养18～24h，然后观察菌落形态并作革兰氏染色、镜检并作复发酵试验。

4、乳糖复发酵试验

即通常所说的证实试验，其目的在于证明经乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。

在上述选择性EMB培养基上，挑取可疑的大肠菌群菌落1～2个进行革兰染色，同时接种乳糖发酵管，置36±l℃温箱内培养24±2小时，观察产气情况。

凡乳搪发酵管产气，革兰染色为阴性反应的无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰染色为阳性，则报告为大肠菌群阴性。

(4)肠道杆菌致病性精确的鉴别方法扩展阅读：

有益菌菌群的生理功能：

如果肠内有益菌菌群占优，肠内黏膜呈现粉红色，表示肠内环境相当良好。

1、吸收水分，粪便较软，较易排泄

在胃部分解消化的食物，经由小肠吸收营养后，成为粘稠状物体送至大肠。然后再经过18小时将水分及矿物质吸收，就变成容易排泄的粪便。肠道内环境良好时，粪便的软硬适中，排便会较为顺利。

2、缓和的蠕动，能顺利将粪便排出

借由肠的蠕动，将粪便缓慢的推送至肛门。如果蠕动过快或太慢，都将影响粪便的构成，导致便秘或者腹泻。而如果肠内干净，则蠕动的速度就相当的有规律，粪便可顺利排出。

3、有助维他命的合成

比菲德氏菌等好菌能维护肌肤的健康，并具有合成有助热量产生的维他命B1、B2及B6等，以及与止血、骨骼形成有关的维他命K等之功用。健康的肠道，好菌会不断繁殖，维他命的合成也可顺利进行。

4、迅速排出有害物质

健康的肠道并非完全没有坏菌的存在，有害物质多少会产生。当然还包括，吃进体内的食品化学添加物或是无法成为营养成分的物质。只要肠内环境良好，这些物质在开始危害身体前就被排出体外。

5、避免病原菌的侵害

比菲德氏菌等好菌可以刺激并提高身体的免疫机能，而且易引起食物中毒等病原菌因具怕酸特质，所以像是含有好菌的乳酸饮料或健康食品等，都可抑制病原菌在肠内繁殖。

肠道有益菌菌群除了以上功能之外，对人体还有营养作用，如糖尿病、高血压、高血脂等。B族维生素和非必需氨基酸对人类的毛发具有重要的作用，当缺少这些营养元素，会导致头发脱落或毛发发黄、发叉，容易折断等现象。

5. 简述肠道杆菌共同生物学特点，怎样初步区别肠道致病菌与非致病菌

肠道杆菌的共同特征；
1．中等大小的G-杆菌，无芽胞，多数有鞭毛和菌毛。
2．营养要求不高。
3．生化反应活泼，肠道杆菌能分解多种糖类和蛋白质，其中致病菌一般不分解乳糖，而非致病菌大多分解乳糖，用以初步鉴别。
4．抗原构造复杂，有菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原和荚膜或包膜抗原等。
5．抵抗力不强。
6．易产生耐药性变异及毒力变异。

6. 大肠杆菌的检测方法

多管发酵法。

多管发酵法是一种检测水体中大肠杆菌的传统方法，这种方法是在44.5℃的含有荧光底物的培养基上连续培养24h，而后能产生分解荧光底物——葡萄糖醛酸酶，从而释放出荧光产物，进而使培养基在紫外光照射下产生特征荧光。此方法可被用来对原样品中的菌落数作统计学估计。

在单料或双料乳糖胆盐发酵管内发酵，分离培养试验，利用伊红美蓝培养皿分离，接着是在乳糖发酵管中进行二次发酵，最后通过芽孢染色、革兰氏染色、显微镜观察等来完成。多管发酵法对试验条件要求不高，成本低，但是检测时间较长，容易受其他条件干扰，进而影响到测定结果的精确度。

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注意事项：

1、检样时注意无菌操作。

2、稀释时采用的稀释液可以用磷酸盐缓冲液或生理盐水，接种时可采用九管法，设置三个梯度，分别为0.1g/mL、0.01g/mL、0.001g/mL，每一个稀释度的试管应充分混匀。

3、每次实验需要有阴性对照。

4、使用小倒管培养基配制时，为排净气泡，灭菌时不要把试管的盖子盖的太紧，灭菌后注意观察一下倒管中的气体是否排完全、

5、高压灭菌后等高压灭菌锅的压力表达到0，取出培养基放到冰箱冷却，效果会比较好。

7. 大肠杆菌检测方法国标是用什么方法检测的

大肠杆菌检测方法分为三种：

1、细菌分离鉴定法

分离培养与鉴定：粪便标本直接接种肠道杆菌选择性培养基。血液先经肉汤增菌，然后转种血琼脂平板。其他标本同时接种血琼脂平板和肠道杆菌选择性培养基。

37℃孵育18～24小时后，观察菌落涂片染色镜检。肠致病性大肠杆菌须先作血清学定型试验。必要的时候检定肠霉毒素。

2、卫生细菌学检查法

大肠杆菌会不断随粪便排出体外，污染周围环境水源、食品等。取样检查时，样品中大肠杆菌越多，则表示样品被粪便污染的越严重，表明样品中存在肠道致病菌的可能性也就越大。

大肠菌数指数：指每立升中大肠菌群数，采用乳糖发酵法检测。中国卫生标准是每1000ml饮水中不得超过3个大肠菌群，瓶装汽水和果汁中每100ml大肠菌群不能超过5个。

3、全自动微生物定量分析仪（TEMPO）检测法

全自动微生物定量分析（TEMPO）仪大肠杆菌群计数检测有TEMPOTC和TEMPOCC两种方法。

TEMPOTC的开发是为获得NF ISO4832标准相当性能水平。

TEMPOCC法是TEMPO仪器上根据BAM方法专门用于24h计数食品中大肠杆菌群方法。

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大肠杆菌在生物技术中的应用

这些菌株由于失去了细胞壁等重要组分，所以在自然条件下已无法生长。甚至普通的清洁剂都可以轻易地杀灭这类菌株。即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也不易导致生化危机。

生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型（例如β半乳糖苷酶缺陷型），可以更好的用于分子克隆实验。

真核基因在大肠杆菌中表达，必须有合适的表达载体(Vector),常用载体：pBV220,pET系统。

目的基因在大肠杆菌中表达的情况：

大肠杆菌更适合原核基因的表达，外源基因表达产量与单位体积产量是正相相关的，外源基因拷贝数和表达 产物产量之间存在动态平衡，单个细胞的产量又与外源基因拷贝数，基因表达效率，表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。

8. 如何鉴定大肠杆菌

1、发酵法

这种方法主要是在44.5℃下的培养基上进行大肠杆菌的培养，该培养基含有荧光底物，需要培养 24 h。然后对荧光底物进行释放，需要采用葡萄糖醛酸进行，让培养基能够在紫外光的照射下发出荧光。

采用这样的方式方法，还可以进行统计学估计原来样品中的菌落。主要步骤包括发酵、分离培养、二次发酵、显微镜观察等 。

2、滤膜法

该方法主要过程：加入 10 mL 左右的无菌水于滤器中，然后掺入一些无菌水进行清洁滤器的内壁，再进行过滤，将滤膜放在 M-FC 培养基中，两者之间不能够有气泡，然后进行密封，存放温度为 44.5℃，存放时间约 24 h，直到大肠杆菌的菌群变成蓝色或蓝绿色。

然后记录数据，估算每一单位的水溶液菌群数量，然后进行大肠杆菌量值的换算 。

(8)肠道杆菌致病性精确的鉴别方法扩展阅读：

大肠杆菌是短杆菌，两端呈钝圆形，革兰阴性。有时因环境不同，个别菌体出现近似球杆状或长丝状 ；大肠杆菌多是单一或两个存在，但不会排列呈长链形状。

大多数的大肠杆菌菌株具有荚膜或微荚膜结构，但是不能形成芽孢；多数大肠杆菌菌株生长有菌毛，其中一些菌毛是针对宿主及其他的一些组织或细胞具有黏附作用的宿主特异性菌毛 。

生化特性

大肠杆菌在常用的生化特性检测项目中，甲基红试验呈阳性，吲哚产生和乳糖发酵是阳性（个别菌株表现阴性），维-培试验是阴性，尿素酶和柠檬酸盐利用呈阴性（极个别菌株表现阳性），硝酸盐还原试验表现阳性，氧化酶表现阴性，氧化-发酵试验表现为F型

9. 肠道杆菌的鉴定依据有哪些

大肠杆菌测定
伊红美蓝平板上典型大肠杆菌菌落接种到营养琼脂平板，在(36土1)℃培养18h -24 h 。每个平板至少挑选2个菌落。挑取上述菌落纯培养物接种3.6.3生化培养基和乳糖发酵管，(36士1)0C培养24h 后观察结果。
大肠杆菌与非大肠杆苗鉴别试验方法
靛基质试验:
滴加Kovacs氏靛基质试剂0.1 m L于靛基质试验培养基中混合，静置，观察结果。
出现红色环的为反应阳性;出现黄色环的为反应阴性。
甲基 红(MR)试验:
滴加甲基红指示剂0.2 m 1于MR-VP培养基中混合，观察结果。
出现红色为阳性反应;出现黄色为阴性反应。
维 培(VP)试验:
滴加VP试剂甲液0. 2 mL于MR-VP培养基中混匀，再滴加VP试剂乙液0.1mL混匀，静置，观察结果。在15min内出现红色的为阳性反应;无颜色变化的为阴性反应。阴性结果1h后再观察一次出现红 色也为阳性反应。
西蒙氏柠檬酸盐试验:观察培养基颜色变化，出现蓝色为阳性反应;不变色为阴性反应。
大肠杆菌鉴定结果
靛基质 MR VP 西蒙氏柠檬酸盐 鉴定
＋
－ ＋
＋ －
－ —
－ 典型大肠艾希氏杆菌
非典型大肠艾希氏杆菌
＋
－ ＋
＋ －
－ ＋
＋ 典型柠檬酸盐杆菌
非典型柠檬酸盐杆菌
－
＋ －
－ －
－ ＋
＋ 典型产气肠杆菌
非典型产气肠杆菌
如出现表1以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。
结果报告
1M Vic 试 验结果为++一一、一+一一和乳糖发酵管产气者，查其EC肉汤产气管数及其稀释倍
数，对照附录B(资料性附录)中MPN检索表报告样品中大肠埃希氏杆菌MPN /a (mL)值

10. 简述大肠杆菌的诊断要点

细菌的分离鉴定
1、标本：肠道外感染取中段尿、血液、脓液、脑脊液等，腹泻者取粪便。
2、分离培养与鉴定：粪便标本直接接种肠道杆菌选择性培养基。血液需先经肉汤增菌，再转种血琼脂平板。其他标本可同时接种血琼脂平板和肠道杆菌选择性培养基。37℃孵育18～24小时后，观察菌落并涂片染色镜检。采用一系列生化反应进行鉴定。肠致病性大肠杆菌须先作血清学定型试验。必要时检定肠霉毒素。
泌尿系统除确定大肠杆菌外，还应计数，每毫升尿含菌量≥100，000时，才有诊断价值。
卫生细菌学检查
大肠杆菌不断随粪便排出体外，污染周围环境和水源、食品等。取样检查时，样品中大肠杆菌越多，表示样品被粪便污染越严重，也表明样品中存在肠道致病菌的可能性越大。故应对饮水、食品、饮料进行卫生细菌学检查。
1、细菌总数：检测每毫升或每克样品中所含细菌数，采用倾注培养计算。中国规定的卫生标准是每毫升饮水中细菌总数不得超过100个。
2、大肠菌数指数：指每立升中大肠菌群数，采用乳糖发酵法检测。中国的卫生标准是每1000ml饮水中不得超过3个大肠菌群；瓶装汽水、果汁等每100ml大肠菌群不得超过5个。