单抗产量检测方法

Ⅰ 单克隆抗体的制备技术路线和关键点

动物的选择与免疫

1．动物的选择 纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。

2．免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。

初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）

↓3周后

第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）

↓3周后

第三次免疫 剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）

↓2～3周

加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）

↓3天后

取脾融合

目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。

（2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。

初次免疫 1×107/0.5ml ip

↓2～3周后

第二次免疫 1×107/0.5ml ip

↓3周后

加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv

↓

取脾融合

细胞融合

1．细胞融合前准备

（1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。

表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系

名 称
来 源
耐 受 药 物
Ig链

H L

P3/X63-Ag8(X63)
BALB/C骨髓瘤MOPC-21
8-氮鸟嘌呤
r1 K

P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)
P3/X63-Ag8
8-氮鸟嘌呤
－ －

P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)
P3/X63-Ag8
8-氮鸟嘌呤
－ K（不分泌型）

P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)
（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤
8-氮鸟嘌呤
－ －

SP2/0-Ag14(SP2/0)
（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤
8-氮鸟嘌呤
－ －

F0
BALB/C骨髓瘤
8-氮鸟嘌呤
－ －

S194/5.XXO.BU.1
P3/X63-Ag8
5-溴脱氧尿嘧啶核苷
－ －

MPC11-45.6TG1.7
BALB/C骨髓瘤MPC-11
6-巯鸟嘌呤
r2b K

210.RCY3.Ag1.2.3
LOU大鼠骨髓瘤R210
8-氮鸟嘌呤
－ K

GM15006TG-A12
人骨髓瘤GM1500
6-巯鸟嘌呤
r1 K

U-266AR
人骨髓瘤U-266
8-氮鸟嘌呤
ε λ

骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。

（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节 需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。

2．细胞融合的步骤

（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。

与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周

↓

拉颈 处死，浸泡在75%酒精内，3～5min

↓

用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

↓

用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管）

↓

反复冲洗，吸出冲洗液

↓

冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min

↓

用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml

↓

加入96孔板，100μl/孔

↓

放入37。c CO2孵箱培养

（2）制备免疫脾细胞

最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死

↓

无菌取脾脏，培养液洗 一次

↓

脾脏研碎，过不锈钢筛网

↓

离心，细胞用培养液洗2次

↓

计数

↓

取108脾淋巴细胞悬液备用

（3）制备骨髓瘤细胞

取对数生长骨髓瘤细胞离心

↓

用无血清培养液洗2次

↓

计数，取得×107细胞备用

（4）融合

①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。

②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。

③加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

④离心，800rpm, 6min。

⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。

⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。

⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。

选择杂交瘤细胞及抗体检测

1．HAT选择杂交瘤细胞 脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。

在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。

2．抗体的检测 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。

常用的方法有：（1）放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测。（3）免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测。（4）其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。

杂交瘤的克隆化

杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

克隆化的方法很多，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。

1．有限稀释法克隆

（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。

2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。

（3）调整细胞为3～10个细胞/ml。

（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。

（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。

（6）8～9天可见 细胞克隆形成，及时检测抗体活性。

（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。

（8）每个克隆应尽快冻存。

2．软琼脂培养法克隆

（1）软琼脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍浓缩的RPMI1640。

①1%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。

②0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。

（2）用上述0.5%琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。

（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。

（4）1ml 0.5%琼脂液（42℃预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。

（5）混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

（6）4～5天 后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。

（7）检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。

杂交瘤细胞的冻存与复苏

1．杂交瘤细胞的冻存 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。

杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓿冻存。

细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。

冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

2．细胞复苏方法 将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。

单克隆抗体的大量生产

大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

（1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为10～60μg/ml,如果大量生产，费用较高。

（2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

①实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆 抗体的含量可达到1～10mg/ml。但采血量有限。

②腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水块、量多。

单克隆抗体的鉴定

对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的，应做下述几个方面的鉴定：

1．抗体特异性的鉴定 除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。②制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。

2．McAb的Ig类与亚类的鉴定 一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定。在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3%），更有利于沉淀线的形成。

3．McAb中和活性的鉴定 用动物或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如，如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

4．McAb识别抗原表位的鉴定 用竞争结合试验，测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。

5．McAb亲合力的鉴定 用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲合力。

参考：http://www.foodmate.net/topic/163/3/34067.html

Ⅱ 如何找到高灵敏度的抗体

抗体的灵敏度跟很多因素相关，例如抗体本身的亲和力就不太高，免疫的好坏，或者放久了降解等等因素。
仅就单抗和多抗来说，单抗的特异性较高，但是不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单抗，单抗的反应强度也不如多抗。多抗的亲和力比较好，但是特异性比较差。如果用几株单抗组成单抗的复合体，那么就可以得到特异性好，亲和力高（灵敏度高）的抗体。

Ⅲ 单克隆抗体技术的程序

(1) 抗原制备。制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应 根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化 或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与 免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。
(2) 免疫动物的选择。根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来 源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一 般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。
(3) 免疫程序的确定。免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交 瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免 疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注 射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。 在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗 体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆 母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。 （1）杂交瘤细胞的冻存。在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防 止实验室可能发生的意外事故，如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难，通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子，以 免遭到不测。在杂交瘤细胞建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。
（2）杂交瘤细胞的复苏。杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的-5℃—0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。 ⑴ 单克隆性的确定 包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。
⑵ 单抗理化特性的鉴定。从实用意义上说，单抗对温度和PH变化的敏感性以及单抗的亲合力都是理化特性鉴定的主要项目，它们可为单抗的使用和保存提供重要依据。
⑶ 单抗与相应抗原的反应性测定。单抗与相应抗原的反应性决定于它所识别的抗原表位，确定单抗针对的表位在抗原结构上的位置，是单抗特性鉴定的关键环节，同时，进一步分析这类表位的差别， 可正确评价单抗的特异性和交叉反应性。

Ⅳ 你好！单抗制备中抗体检测除了elisa还可以用wb检测吗！我们是想做检测试剂盒用的！

抗体检测要看你做什么，以及做的是定性或定量。取两对半乙肝，现在基本上做的是乙肝大三阳对（加上前SI抗原），这是一个质的，主要是为了检测这三组全负，抗体和乙肝病毒携带者。全人口负，一般是尽快推荐的疫苗接种，因为这些人的机会感染了该病毒，超过一大群人的抗体。有抗体的人群中，一组人是比较安全的，但如果有与血液，并在对乙肝病毒携带者的一些点接触，最好是做抗 - HBs的定量检测。如果抗体滴度低，那么我们就应该注意了，你可以去争取防疫站助推器。如果你是携带病毒的人口（包括治疗感染者），全科医生会做一个定量的HBV DNA，病毒复制和感染窗口期，那么，很可能会涉及到他们的器官，引起器质性病变的肝脏。还检查肝功能也可用于进一步检测乙肝病毒的肝受累存在或不存在。当检查一般空腹抽，检查肝功能在一起。以上就是我认为暂时的，可能是不完整的，但大概意思是这样的。
乙型肝炎是重新我国发病率很高，所以我们应该引起重视。因为到目前为止一直没能找到治愈乙肝，它只能部分地负。这些虚假广告说彻底治愈乙肝是没有意义的。

Ⅳ 单克隆抗体的纯化方法有哪些

单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique) 1975英科家MilsteinKohler所发明并获1984诺贝尔医奖 1984 德G. J. F.Kohler、阿根廷C. Milstein[3]丹麦科家N. K. Jerne由于发展单克隆抗体技术完善极微量蛋白质检测技术享诺贝尔理医奖 其原理: B淋巴细胞能够产抗体 体外能进行限裂; 瘤细胞虽体外进行限传代 能产抗体两种细胞融合杂交瘤细胞具两种亲本细胞特性免疫反应类疾病具抵抗力重要素物体受抗原刺激产抗体抗体特异性取决于抗原决定簇各种抗原具抗原决定簇免疫物所产抗体实种抗体混合物用种传统制备抗体效率低、产量限且物抗体注入体产严重敏反应外要些同抗体极困难近单克隆抗体技术现免疫领域重突破

Ⅵ 单克隆抗体时体内培养与体外培养各自的优缺点

（1） 动物体内生产单抗的方法
迄今为止,通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法.
优点：该法操作简便、经济.
缺点：腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig）,因此在很多情况下要提纯后才能使用,而且还有污染动物病毒的危险,故而最好用SPF级小鼠.
（2） 体外培养生产单抗的方法
优点：单克隆抗体的浓缩和纯化比较方便.
缺点：需要特殊设备.而且这种方法制备的单抗量极为有限,不适用于单抗的大规模生产.要想在体外大量制备单抗,就必须进行杂交瘤细胞的大量（高密度）培养.单位体积内细胞数量越多,细胞存活时间越长,单抗的浓度就越高,产量就越大.

Ⅶ 高中生物单克隆抗体实验总结

考试是检测学生学习效果的重要手段和方法，考前需要做好各方面的知识储备。下面是我为大家整理的高中生物单克隆抗体实验总结，希望对大家有所帮助!

高中生物单克隆抗体实验总结

(一)动物的选择

目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。就品系而言以Balb/c小白鼠应用最广，由于所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。

大白鼠也可，能产生较多量的单抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠-大鼠，小鼠-人以及人-人杂交瘤技术。

(二)免疫

一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。

免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单抗体的关键之一。

正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.0×107~5.0×107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了进步得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。

B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人以为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，固然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般以为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。

1.可溶性抗原(蛋白质) 以1mg/ml～5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔3～5周再同样注射一次，10天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉(尾静脉)给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，3～4天后，杀死小鼠取脾做融适用。

2.颗粒性抗原 如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以1%浓度每只皮下注射0.2ml，每周2次，共免疫5～8次，取脾前3天，再免疫一次即可。有人以为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。

单抗技术是主要由抗原制备，免疫动物，细胞融合，筛选杂交瘤细胞，克隆化培养，单克隆抗体的大量制备与鉴定等一系列实验组成的实验系统，其核心部分是细胞融合。细胞融合是单克隆抗体技术的中心环节，基本步骤是将脾细胞和骨髓瘤细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。

实验原理:B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂;而骨髓瘤细胞可以在体外无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后，用一特殊选择培养基(HAT)阻断正常细胞或自体融合细胞的DNA合成通路，而杂交瘤细胞可利用补救通路合成DNA得以生存，且既能产生抗体，又能无限增殖，并以此生产抗体的技术。

实验方法

材料：Balb/c小鼠，SP2/0骨髓瘤细胞，50%PEG，不完全培养液，HAT培养液，75%酒精，剪刀，镊子，纱布，离心管，网筛，大小瓶 皿，直头滴管，弯头滴管，瓶塞，培养瓶盖，离心管盖，烧杯(加入37℃水)，泡沫板，大头针，96孔培养板，计时器，显微镜，计数板等。

单克隆抗体技术方法：

显微镜下观察血片或骨髓片，找出异常细胞。

(1)饲养细胞的制备

1.常用Balb/c小鼠，拉颈处死，浸泡于75%酒精内，3～5min。

2.用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，剪一小口，用滴管注入5～6ml不完全培养液(严禁刺破肠管)。

3.反复冲洗，将冲洗液吸入15ml离心管，1000rpm5min离心，用完全培养液混悬，调整细胞密度。

(2)SP2/0骨髓瘤细胞的制备

1.选取状态良好、处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞。

2.弃去原瓶中培养上清，用不完全培养液冲洗三遍。

3.再以不完全培养液对细胞进行充分吹打，得到的细胞悬液移入15ml离心管。

4.细胞计数。

(3)脾细胞的制备

1.3天前加强免疫的小鼠，摘眼球取血后，拉颈处死，75%酒精浸泡3～5min。

2.将小鼠固定于泡沫板上，打开腹腔，取出脾脏，用不完全培养液反复冲洗。

3.在平皿中的网筛中，用镊子夹取脾脏进行反复研磨，边磨边滴加不完全培养液，直到脾细胞单个化，将细胞悬液转入15ml离心管中。

4.细胞计数。根据两种细胞计数结果，调整悬液用量，配平之后(SP2/0细胞与脾细胞数量比值在1：5～1：10之间)，以1000rpm5min离心。

5.弃上清，每管加入5ml不完全培养液，吹打混匀后合并于同一15ml离心管中，再次以1000rpm5min。

6.离心，弃上清，用滴管吸净残留液体。

(4)细胞融合

1.前面步骤所得到的细胞沉淀，轻弹离心管管底，使其呈糊状。

2.在37℃水浴中，轻轻振荡，一边缓缓加入1mlPEG，边加边摇，PEG于1min内加完。

3.加完PEG之后，将悬液在37℃水浴中静置1min。

4.继续在37℃水浴中，边摇边加入不完全培养液2ml，于2min内加完。

5.慢慢加入不完全培养液，800rpm，8min。

6.弃上清，加入含1%HAT、20%FCS的培养液，轻轻混匀。

(5)在96孔细胞培养板中加入饲养细胞上清，1滴/孔;之后加入融合细胞悬液，1滴/孔。

(6)镜下观察96孔板中细胞情况，CO2孵箱中培养。

Ⅷ 如何提高单抗小鼠腹水产量

1、单抗的大规模制备
目前大量制备单抗的方法主要有两大系统，一是动物体内生产法，这是国内外实验室所广泛采用；另一是体外培养法。
（1）动物体内生产单抗的方法
迄今为止，通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法，鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首选BALB/c小鼠。本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig），因此在很多情况下要提纯后才能使用，而且还有污染动物病毒的危险，故而最好用SPF级小鼠。
（2）体外培养生产单抗的方法
总体上讲，杂交瘤细胞系并不是严格的贴壁依赖细胞（anchoragedependentcell，ADC），因此既可以进行单层细胞培养，又可以进行悬浮培养。杂交瘤细胞的单层细胞培养法是各个实验室最常用的手段，即将杂交瘤细胞加入培养瓶中，以含10-15%小牛血清的培养基培养，细胞浓度以1×106-2×106/ml为佳，然后收集培养上清，其中单抗含量约10-50ug/ml。显然，这种方法制备的单抗量极为有限，无疑是不适用于单抗的大规模生产。要想在体外大量制备单抗，就必须进行杂交瘤细胞的大量（高密度）培养。单位体积内细胞数量越多，细胞存活时间越长，单抗的浓度就越高，产量就越大。