结核菌素的检测方法

‘壹’ 结核菌素试验具体如何做

旧结素（old tuberculin,OT）是从生长过结核菌的液体培养基中提炼出来的结核菌代谢产物,主要含有结核蛋白.在人群中作普查时,可用1：2000的OT稀释液0.1ml（5IU）,在左前臂屈侧作皮内注射,经48-72h测量皮肤硬结直径,如小于5mm为阴性,5-9mm为弱阳性（提示结核菌感染或非结核性分支杆菌感染）,10-19mm为阳性反应,20mm以上或局部发生水泡与坏死者为强阳性反应.

‘贰’ 结核菌素试验的实验步骤

基于Ⅳ型变态反应（见变态反应）原理的一种皮肤试验，用来检测机体有无感染过结核杆菌。凡感染过结核杆菌的机体，会产生相应的致敏淋巴细胞，具有对结核杆菌的识别能力。当再次遇到少量的结核杆菌或结核菌素时，致敏T淋巴细胞受相同抗原再次刺激会释放出多种可溶性淋巴因子，导致血管通透性增加，巨噬细胞在局部集聚，导致浸润。约在48～72小时内，局部出现红肿硬节的阳性反应。若受试者未感染过结核杆菌，则注射局部无变态反应发生。
结核菌素是结核杆菌的菌体成分，有两种，旧结核菌素（old tuberculin，OT）是柯赫（R.Koch）首先发明的。而纯蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）则是由塞伯尔（Seibert）首先制备的。结核菌素试验方法很多，常用的是芒图（Mantoux）氏法，即将OT或PPD用无菌生理盐水稀释成不同浓度，取0.1毫升注射于左前臂掌侧前1/3中央皮内（注意：左手），72（48h～96h）小时检查反应情况，应注意局部有无硬节，不可单独以红晕为标准。若注射部位有针眼大的红点或稍有红肿，硬节直径小于0.5厘米，则为阴性反应。若注射部位硬节直径超过0.5厘米，但在1.5厘米以下，为阳性反应。若注射部位反应较强烈或硬节直径超过1.5厘米以上，为强阳性反应。阳性反应表明机体对结核杆菌有变态反应，过去曾感染过结核，但不表示有病，因接种过卡介苗的人也呈阳性反应。强阳性反应则表明可能有活动性感染，应进一步检查是否有结核病。阴性反应表明无结核菌感染，但应考虑以下情况：如受试者处于原发感染早期，尚未产生变态反应，或正患严重结核病，机体已丧失反应能力，或受试者正患其他传染病，在此类情况下，均可暂时出现阴性反应。结核菌素试验可为接种卡介苗及测定免疫效果提供依据。若结核菌素试验阴性者应接种卡介苗，接种后若反应转为阳性，即表示接种已产生免疫效果。结核菌素试验还可作为婴幼儿结核病诊断的参考，测定肿瘤患者的非特异性细胞免疫功能及在未接触过卡介苗的人群中调查结核病的流行情况。

‘叁’ 简述结核菌素试验的原理、方法和结果分析

本试验是用结核菌素进行的皮肤IV型过敏变态反应试验，用以判断机体是否受到结核菌感染进行结核病流行病学调查，发现病人，协助诊断和鉴别诊断，选择卡介苗（BCG）接种对象并考核其接种效果，借以判断机体细胞免疫状态的一种常用试验。 “抗原”有两种即旧结核菌素简称旧结素（old tuberculin，OT）和结核菌纯蛋白洐化物（purified protein derivative，PPD）。OT为人型结核杆菌培养二个月后，加热杀死结核菌，将滤去死菌后含菌体自溶及培养基成分的剩余部分浓缩至原量1/10的棕色透明液体，1952年WHO将其标准化，每ml含1000mg相当10万TU（结素单位）。PPD是用化学方法从结核菌培养液中提取的结核菌蛋白，较OT更精纯，用后不产生非特异性反应（表7-2）。“方法”有皮上、皮肤划痕或点刺与皮内注射法，以后者应用最为广泛，效果准确。1、 部位，选左臂屈侧中部皮肤无瘢痕部位，如近期（2周内）已作过试验，则第2次皮试应选在第一次注射部位斜上方3~4cm处，或取右前臂。2、 局部75％酒精消毒，用1.0ml注射器、4.5号针头（针头斜面不宜太长），吸取稀释液0.1ml （5TU）皮内注射，使成6~8mm大小圆形皮丘。3、 注后48小时观察一次，72小时判读结果，测量注射局部红肿处的硬结横与纵径，取其均值为硬结直径。＜5mm为阳性，5~9mm为弱阳性（+），10~19mm为阳性（+ +），≥20mm或局部出现水泡、坏死或有淋巴炎，均为强阳性（+ + +）。“意义”阳性：①示机体受到结核杆菌感染，且已产生变态反应；②城市居民，成人绝大多数为阳性，一般意义不大；如用高倍稀释液（1/10000）1TU皮试呈强阳性，提示体内有活动性结核病灶；③3岁以下儿童，呈阳性反应（+ +），不论有无临床症状，均现为有新近感染的活动性结核，应予治疗。阳性：提示①机体未受到结核菌感染，或虽已感染但机体变态反应尚未建立（4~8周内）；如一周后，再用5TU重新皮试，利用结素的复强作用，若仍为阳性，则可除外结核菌感染。此外见于：②高龄，一般60岁以上20％、70岁以上30％、80岁以上50％为阴性；③儿童患麻疹、百日咳后，变态反应被抑制，大约3周后可渐恢复；④重症结核病，当经过治疗随病情好转，结素反应可复阳；⑤结节病（阳性率仅10％，且多为弱阳性）、淋巴瘤与其他恶性肿瘤患者；⑥接受糖皮质激素或免疫抑制剂治疗者；⑦营养不良和AIDS（acquired immune deficiency syndrome）患者。“注意事项”1、 已配制稀释液置有色瓶内。避免日光直射、4℃可保存2周。2、 玻璃及塑料对结素有明显吸附作用，抽取后务于1小时内用完，否则效价降低影响效果。3、 结素试验后可能会出现一些异常反应，应予妥善处理。局部：出现水泡、溃疡，应保持清洁，涂2％甲紫，必要时可用注射器将水泡液抽除。全身：①发热，多属热原反应与器具消毒不严有关，一般于数小时内可恢复；②厥与休克，多与精神紧张、恐惧有关，可嘱其平卧、保温，必要时皮下注射0.1％肾上腺素0.5~1.0ml；③病灶反应，注后数小时肺部病灶周围毛细血管扩张，通透性增加，侵润渗出，形成变态反应性病灶周围炎，一般不必特殊处理，2~5天可自行消退。4、有下列情况暂不宜作结素试验 发热，体温37.5℃以上；传染病恢复期，器质性心脏病、肝肾血管疾病、精神病、癫痫、细胞免疫功能缺陷、丙种球蛋白缺乏和月经期。

‘肆’ 结核菌素的试验方法有哪些

结核菌素试验方法有皮内注射法，皮上划痕法，皮上贴膏法等。

皮内注射法是临床上最常用的一种方法。

（1）皮内注射法：临床上用此方法，如同做青霉素皮试一样，将旧结核菌素稀释液（1 ∶ 1000 或1 ∶ 2000）1ml，注射于左前臂掌侧下1/3，于48 ～ 72 小时看结果，局部出现红晕且有硬结，直径超过5mm 以上者为阳性结果。如怀疑有严重活动性肺结核者，宜用1 ∶ 10000 稀释液，以防局部的过度反应以及可能的病灶反应。注射后48 ～ 72 小时看结果，阴性者用高一级浓度再试，直到1 ∶ 100稀释液为止。

（2）皮上划痕法：与上述相同部位滴旧结核菌素原液1 滴，然后，以消毒的针划破表皮，划痕不超过5mm，若划2 或3 条以上时，划痕间应有1cm 的距离，以有淋巴液渗出为度，但勿使出血，48 ～ 72小时看结果，沿线出现红肿达3mm 以上者为阳性。此种方法，因阳性率低，故不常用。

（3）敷贴试验法：将定量的结核菌素或纯蛋白衍生物（PPD），浸在1cm2 的布上，敷贴在前臂掌面1/3 处，上盖塑料薄膜固定，48小时后除去敷布，再隔48 小时看结果，阳性者局部可有3 ～ 4 个丘疹或小水泡，主要用于婴幼儿。

‘伍’ 怎么检查体内结核菌

病情分析：
常用的检查体内是否存在或提示感染过结核菌的方法是结核菌素试验
指导意见：
因为结核菌素试验的结果不能完全提示是否有结核感染，目前常用的方法是做结核抗体试验和结核探针DNA检测。如果怀疑是肺结核还可做X线检查和痰液查找结核菌检查

‘陆’ 结核病的实验室检查具体有什么呢

结核病的实验室检查有这些：

（1）结核菌细菌学检查痰涂片查抗酸杆菌是WHO推荐的肺 结核诊断方法，是全世界的结核病实验室都在使用的最基本的细菌学检 查方法。痰涂片检查不仅可以明确结核病传染源，而且十分经济，符合 我国国情。涂片的优点是简便、快速、价廉。涂片的缺点是阳性率低。 结核菌培养仍是目前诊断支气管结核病（MTB)的金标准，缺点是培养 时间长，特异性差。(2) 免疫学检测技术

① 皮肤变态反应：结核菌素或PPD实验，临床意义同前。

② 结核抗体测定：目前常用的检测方法主要有ELISA、免疫层析试 验、免疫印迹试验和蛋白芯片技术等检测血清抗体方法。

③ 结核抗原测定和循环免疫复合物（CIC)测定。

(3) 干扰素分析为体外测定结核菌抗原刺激诱发的T淋巴细胞分 泌y干扰素（IFN-y)的方法。(4) 分子生物学方法检测核酸杂交、聚合酶链式反应（PCR)可 检测样本中的结核杆菌核酸，并能鉴别耐药株。

(5) 血沉多增快，结合临床表现及X线检查可协助判断结核病的 活动性。

‘柒’ 如何查结核素

结核菌素,是用结核菌的培养液制成的一种试剂,主要成份是结核菌的新陈代谢产物.应用免疫反应的原理：对受结核菌感染或者曾接受卡介苗预防接种的机体产生特异的免疫反应.从而判断机体是否受过结核菌感染,或者判断卡介苗预防接种的效果.这种结核菌素的试验在肺结核或怀疑其他脏器的结核感染的诊断以及卫生防疫的结核病防治工作中是常用的.
现在我们常用的结核菌素有二种：旧结核菌素（OT）和结核菌素的纯蛋白衍化物（PPD）.
1,旧结核菌素,简称为旧结素（OT）是德国科学家柯赫最初采用的方法制取的结核菌素.有二个剂型：⑴旧结素原液：它每毫升含10万个结素单位.可以稀释成不同的浓度,对可疑结核病患者进行测试,作为一种辅助的诊断方法之一.旧结素原液在专门的结核病防治医院应用比较多.⑵稀释的旧结核菌素；它是由专门的生物制品制造单位将旧结素稀释成安瓿剂,一般浓度为1：2000每支2毫升.这个剂型在结核病防治机构应用较多,主要应用于儿童进行卡介苗接种时,筛选接种对象：试验阳性的说明曾经受过结核菌感染,体内已经存在这种免疫反应,或者已经接受过卡介苗的接种体内已存在免疫反应,无需再行卡介苗的接种.
2,结核菌素的纯蛋白衍生物（PPD）.使用这种试剂应严格按说明书应用,目前主要应用于结核病的流行病学调查和结核病的科学研究,在医疗机构的临床应用也在逐步开展.下面介绍一下结核菌素试验的操作方法.
试验的试剂：旧结核菌素1：2000的稀释液（它每毫升含50个结素单位）注射部位：被测试者的左（或右）腕关节以上前臂选择血管少无疤痕的部位,皮肤消毒后注射.
注射方法：采用皮内注射法,切忌注入皮下,甚至肌肉,血管内.
注射剂量：用兰芯针筒看准刻度缓缓注入0.1毫升,成皮丘,可以看见小圆形凸起的小白泡,大约在8毫米左右直径大小.接种后处理：注射完毕以后,退出针尖皮肤消毒,并做好各项登记,登记的内容为：姓名,年龄,性别,接种日期,被接种儿童家长姓名,接种部位,注射剂量（含接种试剂的浓度）,试剂的制造厂商批号等等,以及接种者单位姓名,观察反应的日期和时间.
进行结核菌素试验应注意的事项：
1,首先应该有组织,有秩序地进行（指集体试验时）建立好登记卡簿,对接受测试的对象进行详细登记,以备今后查验用.
2,对结核菌素的试剂进行查验是否合格：试剂安瓿上的品名,浓度,批号,有效期,再看看安瓿有否裂缝,内装结核菌素有否混浊,沉淀物,甚至杂质.
3,详细阅读结核菌素的使用说明书,对有试验禁忌症的儿童一律不予测试.
4,试验必须在室内进行,不要在日光直射下进行,因为：⑴结核菌素受阳光直接照射以后会降低效价,试验后可能出现假阴性反应.⑵阳光照射下测试,皮肤会增加敏感性也可能出现假阳性反应.
5,操作人员必需以高度认真负责的精神对待此项工作,任何失误会造成测试结果的偏差,如果在无菌操作上不认真,筛选测试对象不认真,那么可能造成的后果将会很严重.
6,顺便提一下结核菌素试验的结核菌素和卡介苗预防接种的疫苗千万不能搞错,存放时绝不能混在一起,必须严格分开.

‘捌’ 结核菌素试验的判断方法

我国规定以72小时为观察反应时间，48-96小时内皆可测量反应，记录方法是将测得的硬结横径毫米数×纵径毫米数表示，如有水泡、硬结、坏死和淋巴结炎时，应作记录。 硬结平均直径在5mm或5mm以上者为阳性，5-9mm为一般阳性，10-19mm为中度阳性，20mm以上局部有水泡，出血、坏死及淋巴管炎者均为强阳性。

‘玖’ 叙述结核杆菌的检验程序

结核杆菌与麻风杆菌是分枝杆菌属中的主要病原菌。
结核杆菌菌体细长略带弯曲，有分枝生长趋势。菌体含脂量高，与其抗酸特性、抵抗力特性、致病性与免疫性等都有密切关系。该菌营养要求高，生长缓慢，形成“菜花状”菌落。

一、结核杆菌检验程序
结核病人病灶中查到结核杆菌，是病原学诊断的重要依据，根据感染部位不同，可采集病人的痰、尿、粪便、脑脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序进行检验。

二、结核杆菌培养特性
1. 液体培养基（苏通氏培养基、小川培养基、血清酸性培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理（即酸碱处理，可液化标本，也可杀死杂菌，还可浓缩集菌）后接种液体培养基，35℃培养1-2周，由于表面生物，可在培养基表面表成污灰、干燥、有皱褶的菌膜。
2. 固体培养基（改良罗氏培养基、丙酮酸钠培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理后，接种固体培养基，37℃培养2-4周，在培养基表面可形成乳白或米黄色、不透明、粗糙颗粒状或节状堆聚的菌落，呈现“菜花状”。
3. 结核杆菌快速培养检测方法：无菌手续将前处理后的材料涂片，置液体培养基中，35℃恒温箱CO2培养箱内培养，3-5日后，每隔日取出一玻片，染色镜检，可快速获得结果。

三、齐~尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法
【原理】
结核杆菌对苯胺染料不易着色，若加温或延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒精处理也不易脱色，再经美兰复染，结核杆菌及其他分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸菌和细胞杂质等呈蓝色。
【材料】
1. 结核病人痰液：采取清晨第一口粘痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。
2. 抗酸染色液
3. 载物玻片、玻片夹、酒精灯、腊笔等。
【方法】
1. 无菌手续采取痰液涂片，自然干燥，火焰固定。
2. 用腊笔将涂面局部隔开，滴加石炭酸复红染液，酒精灯上加热至出现蒸气。切勿沸腾，亦不可使染液干涸。如有干涸的趋势，应及时补加染液。持续染色5-8分钟，待冷后流水漂去多余的染液。
3. 用3%盐酸酒精清脱色，脱至涂面无色为止，约1-3分钟，自来水冲洗。
4. 滴加吕氏美兰染液复杂30秒~1分钟，水洗。自然干燥或吸干后油镜检查。
【结果】
1. 结核杆菌呈现细长，略有弯曲的红色菌体，有的可表现出分枝特征，有的菌体表现有多数浓染颗粒。结核杆菌大多分散排列，亦可以见到有纵行条索状排列。
2. 涂片染色能查到结核杆菌者，一般需要每毫升痰液内含菌量至少应有500个以上，甚至需达到5万以上。故材料多进行浓缩集菌处理，以提高检出阳性率，也造成在染色标本片观察中，不一定每个视野都能看到结核杆菌。
3. 结核杆菌易发生变异，在陈旧培养基或临床治疗后标本材料中，结核杆菌往往菌体断裂，或形成非抗酸性革兰氏阳性的短杆状、球状颗粒，亦称Much颗粒。
4. 标本已经高压灭菌处理，不影响染色结果，也保证操作者的安全。

四、荧光染色法
此系用金胺荧光素染扩酸性细菌的方法，简便易行，但不具特异性。金胺染色法有多种、现列于后表，可选择使用，应用荧光显微镜检查结果。

五、结核杆菌毒力试验——动物试验法

【材料】
1. 动物：体重200~250克豚鼠2只
2. 结核杆菌培养物或结核病人检验材料（痰、尿、粪、腹水等材料经浓缩集菌）
3. 注射器及消毒用材料等。
【方法】
1. 选取结核菌素试验为阴性的豚鼠两只。
2. 吸取结核杆菌悬液或病人检材，注入豚鼠腹股沟皮下0.1ml
3. 注射后每周定期检查一次，观察豚鼠腹股沟淋巴结是否肿大，局部变硬，化脓及体重减轻、体温升高等症状。
4. 给豚鼠作结核菌素试验，是否出现阳性结果。
5. 6周后，将豚鼠进行解剖，观察淋巴结是否肿大，有无干酪性病变，肝、脾、肺等是否肿大，表面有无灰白色结节病灶，取可疑病灶进行涂片染色镜检和分离培养。若为阳性结果，可报告“动物接种后××天查到有结核菌感染”。如无症状及病变者，可报告为阴性。

六、结核杆菌浓缩集菌法（以处理痰标本为例）
【材料】
结核病人24小时痰液，细口瓶，0.02%酚红液、汽油，NaOH，无菌生理盐水等。
【方法】
(一)漂浮法：
1. 取24小时痰液15毫升，装入细口瓶内，加入2倍量0.5%NaOH摇匀，高压灭菌或煮沸20—30分钟杀菌。
2. 待冷后加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振荡20—30分钟，用生理盐水加至液面与瓶口齐，静置半小时。
3. 取瓶口表面油状物涂于载物玻片上，微微加热，干后再加，如此重复5—6次，至厚度适宜，烘干待冷，抗酸染色，油镜头检查。

(二)沉淀法：
1. 取痰液1份或2倍量4%NaOH，高压无菌或煮沸20—30分钟后，加入0.02%酚红指示剂0.1毫升，剧烈振荡混匀，亦可置37℃水浴消化30分钟。
2. 矫正PH为7.0，3000转/分离心30分钟，弃去上清液。
3. 取沉淀物涂片染色镜检。若进行分离培养和动物接种，可免去高压灭菌或煮沸的程序。

附录：抗酸染液的配制
1. 石炭酸复红液：称取碱性复红4克，溶于95%酒精100毫升中成饱和液。再取饱和液10毫升与5%石炭酸溶液90毫升混匀即成。
2. 3%盐酸酒精：取浓盐酸3毫升，95%酒 97毫升混合。
3. 吕弗勒氏碱性美兰液：称取美兰2克，溶于95%酒精100毫升中，配成饱和液，取饱和液30毫升，再加入蒸馏水100毫升及10%氢氧化钾水溶液0.1毫升即成。