检测嵌合程度的方法

㈠ 分子细胞遗传学方法检测嵌合体最敏感的方法为

单核苷酸多态性（SNPs）是指染色体的某个位点上存在单个碱基的变化 在人群的频率超过1% 包括单碱基的转换 置换 以及单碱基的插入/缺失等 它是人类可遗传变异中最常见的一种 作为新型的遗传标记 与RFLP STR 相比 SNP的位点极其丰富 据估计在人类基因组中大约每千个核苷酸就有一个以上的SNP 因此整个人类基因组中共有300万以上的SNP[ll] SNPs一般为两个等位基因 且转换与颠换的比例约为2:1。虽然相对于STR来说 SNPs 只有两个等位基因 单位点提供的信息相对较少 但在染色体上分布密度大 足以弥补这种缺点 而且由于SNP是二等位多态性 检测时只需一个“+/-”或“全/无”的方式 易于自动化批量检测

较之VNTR、STR等二代遗传标记技术 SNP具有显而易见的优势 SNP整体的高多态性 利于选择高信息性的合适位点 基于SNP的分型手段多样 特异性高 方便获得更灵敏的结果 SNP是二态的 能充分地反映个体间的遗传差异 易于通过供受者分型来评估嵌合状态 进行自动化批量检测

2.2.2 定量PCR检测嵌合体

随着检测技术的发展 嵌合体的检测逐渐从定性分析演变为定量测定 而对嵌合体的定量检测中 目前广泛应用的是PCR法 采用PCR可使分析敏感性提高 Bader和Kreyenberg[12]提出 PCR对较少细胞检测的敏感性约1% 而且一些研究也成功地将多重PCR系统应用于法医学的嵌合体分析[13] 实时定量PCR已广泛应用于嵌合体研究[17] 这种方法使较少细胞检测的敏感性增加 即使0.1%～0.01%的细胞也能被检测到 而且加快了分析时间 试验结果可在几小时内获得[13]

实时荧光定量PCR技术是将荧光能量传递技术应用于PCR中的一种核酸定量技术 是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现定量功能的 它不仅具有普通PCR的高效灵敏性而且由于荧光探针的应用 可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化获得定量结果 所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性 克服了常规PCR的许多缺点 荧光定量PCR具有封管操作 无须后处理 避免产物污染 不受PCR平台效应影响 定量准确 范围广 探针特异性高 光谱分析仪直接读取结果 增加了灵敏性和客观性等优势 使其成为定量追踪嵌合体变化的敏感 可靠的检测方法

通过对STR-PCR和SNP实时PCR检测嵌合体进行比较发现 SNP-PCR可在疾病复发前检测出CC 明显早于STR-PCR法 而且SNP实时PCR检测嵌合体的敏感性达0.1% 远远高于STR-PCR说明 SNP-PCR的敏感性 准确性 及特异性均比STR-PCR高 证实了实时SNP-PCR是检测allo-SCT后造血细胞植人和微小残留病变相对经济 敏感和快速的检测方法

㈡ 二胎产前怎么检测dmd嵌合型突变

假肥大性肌营养不良（DMD），是最常见的一类进行性肌营养不良症。本病的发生是由于编码dystrophin的DMD基因的突变所引起， 有约 1/3 病例为散发，没有家族史，是由基因突变造成。本病主要为男性发病，在已生育过 DMD患者的家庭中，可通过 产前诊断 ，选择女性胎儿，降低DMD的发生风险。如果...能应用基因诊断方法，对所怀男胎排除DMD基因的突变，仍可生育正常男胎。到孕妇所在的地区的省级医院的产前诊断中心可进行点突变检测。具体操作为：于妊娠18-26周进行羊水穿刺，也可以于妊娠11-14周进行绒毛穿刺，一般产前诊断中心DMD点突变检测费用为4000元上下，20-30个工作日出结果（请以你在的医院为准）。

㈢ 如何检测转基因植物嵌合体

嵌合体是不能遗传的，转基因鼠是可以遗传的，一般做转基因或条件性敲除，首先得到的是嵌合体，也就是你转的东西没到生殖细胞里，然后才能筛选得到真正的转基因鼠。

㈣ 存在染色体嵌合现象的胚胎是否能够移植

存在染色体嵌合现象的胚胎是否能够移植
染色体不分离现象如发生在受精卵卵裂过程中或胚胎发育早期的细胞分裂过程中， 将造成一个胚胎中的部分细胞发生染色体数 目畸变， 可产生同时具有两种或两种以上不同染色体核型细胞系的个体，称嵌合体。
嵌合体核型常用的的诊断方法是直接对细胞染色体核型进行分析。F I S H的原理与普通的 D NA杂交技术相同， 是 利用荧光标记的探针与染色体结合， 然后在荧光显
微镜下检查目标染色体， 优点为：①快速检测大量细胞， 可发现一些其他方法检查中漏检的细胞系。②可检测不能行有丝分裂甚至石蜡切片中的细胞。⑧可更准确地定位到基因， 而不是染色体区带。
我认为你可以考虑采用“植入前遗传学诊断”（PGD）的技术

㈤ 转基因鸡的培育

通过显微注射生产转基因鸡
（l）单细胞受精卵显微注射法。人们发现，当外源DNA注射到海胆、斑马鱼和爪蟾等脊椎动物受精卵细胞质中，当卵快速分裂时，外源DNA能暂时停留染色体外复制，并可低频率地结合到染色体基因组中。得益于上述研究的启示，在体外将外源基因注射到单细胞受精卵细胞质中，经过体外培养后，成功地产生了转基因鸡。但是，此种方法取到一个受精卵需要一只母鸡，若操作失败，一个细胞的损失就相当于一只母鸡的损失，成本较高，并且受精卵体外孵化条件也很复杂，操作难度较大。
（2）受精卵原核注射法。在国内，李赞东等将脂质体包装后的质粒pMiwz（含有报告基因LacZ）注入囊胚期胚盘中，转基因获得成功，并证明囊胚期注射外源基因可以获得转染的原生殖细胞（PGCs），并能够传给下一代。在国外，Jamie love等将带有目的基因质粒DNA注射入鸡受精卵的胚胎中，体外培养12h后发现近一半存活，40%胚胎中含有质粒DNA，有6%相当于每一个细胞含有1个拷贝的外源基因，7只存活至性成熟雏鸡中的一只将3.4%外源基因传递给其后代。此种方法可以得到转基因嵌合体鸡，但转基因细胞的嵌合部位和嵌合程度不容易确定。
鸡卵原始胚细胞的弹道转染
该技术最初应用于植物细胞的转基因操作，其中包括两大组成部分：离子加速系统和离子包装系统。此种方法效率较高，并且由于用的是不同大小的钨离子，而且胚胎新月区下主要是卵黄蛋白，所以不必考虑投射弹的速度和穿入的深度（白占涛等，2000）。但是，由于此方法导入的DNA很难整合到鸡的基因组中，故遗传稳定性和传代性不强。
逆转录病毒载体法
此法是利用病毒正常生命周期特征来感染家禽，从而导入外源并达到整合的目的。现在使用的病毒载体有两类：复制完全型和复制缺陷型（高波，2000）。复制完全型逆转录病毒包含全部结构基因能自我复制，并能重复感染细胞。而复制缺陷型逆转录病毒缺乏部分或全部结构基因，不能自我复制，需在辅助细胞中繁殖。反转录载体法的整合效率比电穿孔和脂质体转染法要高，但是由于基因片段大小的限制和获得高滴度病毒有困难，所以目前主要停留在实验室阶段，还未广泛应用于商业生产（刘向萍，2003）。
精子载体法
这种方法利用精卵结合的正常生理过程来完成外源基因的导入，具有简便易行，对卵原核无损伤等特点，但对精子的损伤是十分棘手的问题，并且整合度也不高。
（1）脂质体介导精子载体法。在国内，杜立新等曾对此方法作过探讨，其大体实验步骤包括：脂质体-DNA复合的制备，mDm-His法获能精子的人工授精、转基因鸡的检测。发现的问题是精子活力下降、外源基因表达率随胚胎发育而降低等问题。
（2）精子细胞电穿孔法。电穿孔法是促进DNA与动物精子结合的一种重要方法。它利用高压电场使精子质膜产生暂时性孔洞，从而使外源DNA比较容易地进入细胞内。钟家玉研究发现，先让精子脱水再水化或者对浸浴在外源基因中的精子进行电脉冲，得出的阳性率都比仅仅将外源基因和精子混合大得多。先脱水再置于低渗液，精子会吸入低渗液，而正是这一过程使阳性率大大提高，外源基因非常可能随着低渗液进入精子。
胚胎干细胞原生殖细胞操作法
胚胎干细胞（ES）是从早期胚胎的内细胞团经体外培养建立起来的多能细胞系。当ES被注入X期囊胚后可参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成，通常利用反转录病毒载体、电击法等将外源基因导入ES细胞中，将有功能的转入基因整合到ES细胞基因组内的非必需基因位点上，经筛选、培养，而后用于转基因鸡生产。

㈥ 无创dna能检查出异位和嵌合吗

近看见坛子里讨论无创DNA产前检测的JM很多,有的姐妹甚至觉得这项技术是万能的,任何遗传疾病都能检测出来,其实大家的期望有点高了,下面我就聊聊自己怀孕时一些医生

㈦ 造血干细胞移植后，检测嵌合率的方法有哪些实验

后者是比前者更科学的一种称呼方式 实际上造血干细胞移植的方式有3种骨髓外周血脐带血大陆地区的造血干细胞资料库（也就是以前说的骨髓库）实际是采用外周血采集法采集造血干细胞的骨髓采集法是亲属间捐献采用的

㈧ 我想知道“多物种非人兽混合胚胎”发育后会出现什么现象新个体是否会融合多物种的特征

你所说的就是生命科学研究上的嵌合体

嵌合体研究进展
1 嵌合体的概念
嵌合体(Chimera)一词源于希腊文,古希腊神话中用它
代表羊头、狮身、蛇尾这样一些由不同种类的动物所拼凑成
的怪物,这意味着人们改造自然的愿望。20世纪60年代中
期,在高等哺乳动物上得到了由两个或两个以上不同遗传性
状组成的胚胎发育成的个体,这种个体的组织器官是由基因
型不同的细胞群所组成,故称之为嵌合体。有的学者用非自
主表型(Allophene)一词代表这种个体,意指不同的表型是由
于有不同基因型的缘故。为了方便起见,Ford(1969)把在发
育的很早期,如卵裂期甚至受精卵期所形成的嵌合体,称为
原发性嵌合体(Primary Chimera);把在发育的晚期,如胚层
已分化,或器官开始形成后通过组织移植或嫁接等方法所形
成的部分组织或器官的嵌合,称为次生型嵌合体(Secondary
himera)。通常所说的嵌合体指原发性嵌合体,即人工地将
两个或两个以上具有不同遗传性状的早期胚胎,或者把具有
特种遗传性状的细胞和早期胚胎聚合或显微注射所产生的
嵌合体〔1〕。嵌合胚内不同来源的细胞相互调节、相互作用以
至共同完成胚胎发育。由于嵌合体能携带适当的遗传标记
并能在个体发育中表现出来,因而它成为研究所有动物个体
发育最为理想的实验材料和遗传研究模型。
2 嵌合体研究概况
2.1 小鼠嵌合体的研究进展
嵌合体研究至今已有80多年的历史。1942年,Nicholas
和Hall就曾试图用不同品系的大鼠,将其早期分裂球进行聚
合制作嵌合体,结果只得到一个死胎,未能证明为嵌合体。
之后,Tarkowski(1961,1963)〔2〕将具有不同毛色和葡萄糖磷
酸异构酶(Glucose Phosphate Isomerase,GPI)迁移率不同的两
种小鼠的胚胎,在卵裂的不同时期,如8-细胞期、16-细胞
期,甚至桑葚胚进行聚集,成功地制作了世界上第一只嵌合
体小鼠。通过毛色和同工酶的测定,证明这些嵌合体的各种
组织中都有来自两种胚胎的细胞。至此以后,嵌合体技术受
到了国内外哺乳动物发育生物学工作者们的极大重视。
Gardner在1968年又创建了囊胚注射法,并用这种方法
成功地获得嵌合体,因此法具有许多优点,可将不同类型的
细胞直接注射到囊胚腔内,所以成为目前获得嵌合体的主要
研究手段〔3〕。1981年,Evans和Kaufman〔4〕及Martin〔5〕首次
报道了从正常小鼠胚胎中分离建立了胚胎多能干细胞系,简
称ES细胞(Embryonic Stem Cells)。由于这种细胞来源于正
常胚胎,在细胞形态、生化特性、细胞表面抗原组成、体内外
分化能力等方面与分离的胚胎内细胞团(Inner Cell Mass,
ICM)十分相似,多数具有完整二倍体核型,可以有较高的频
率形成嵌合体。1984年,Bradley等〔6~8〕通过囊胚注射法获
得了首例小鼠ES细胞种系嵌合体,种系嵌合体的获得是实
现ES细胞介导的转基因途径的决定步骤。ES细胞种系分
化能力的保持是决定种系嵌合的前提条件,尽管可通过体内
外分化实验及全能性细胞分子标记推测ES细胞系是否具有
多方向的发育潜能,但嵌合体的制作及种系嵌合体的获得则
是判定ES细胞系是否具有种系分化能力的唯一方法。
Robertson等〔9〕及Gossler等〔10〕在1986年,分别以
PSVmos-1neo和pSVtkneoβ融合基因转化小鼠ES细胞
并成功实现种系传递,宣告了ES细胞途径的诞生。与原核
注射及逆转录病毒感染等其他转基因途径相比,ES细胞途
*为通讯作者。
径的优点在于ES细胞可在体外连续培养并保持发育全能
性,使得目的突变的筛选可在细胞水平而非个体水平进行。
尤为重要的是,利用基因组同源序列及合适的选择标记基因
可构建基因打靶(gene targeting)载体转化ES细胞获得小概
率的同源重组事件,进而经由种系嵌合体得到内源基因定位
致变(knock—out)或外源基因定点整合(knock—in)的突变品
系,这是迄今为止任何其他转基因途径所无法实现的。
1987年,Thomas和Capecchi将基因定位整合技术与ES
细胞途径相结合,首次获得了内源基因(Hprt)定位失活的转
基因小鼠。随后,人们以同样的方法成功地定位改变了一系
列的内源基因,例如:通过ES细胞对MT基因和对tPA基因
的研究,在分子和个体水平上使人们对这些基因有了更深的
了解,同时,也充分显示了ES细胞途径的潜力所在。宋震涛
等〔11〕在1993年,用囊胚注射法将小鼠胚胎多能干细胞—
CCE细胞注射到发育3.5 d的昆明和C57BL/6J小鼠受体囊
胚腔内,经假孕鼠借腹怀胎,获3只CCE细胞毛色嵌合鼠。
实验共注射胚胎654个,经培养其恢复成活率73.8%,胚胎
移植后,假母受孕率及产仔率分别为32.9%和53%。在所
获3只嵌合鼠中,2只为CCE—昆明毛色嵌合鼠,1只为
CCE—C57BL/6J毛色嵌合鼠,这是国内首次利用胚胎多能
干细胞获得嵌合鼠。同年,Wood等人报道了用ES细胞
R—1进行囊胚注射,注射后移胚631个,出生250只(40%),
嵌合体95只(15%)。Stewart等(1994)〔12〕按照Resnick〔13〕
的方法从7枚9dpc129/SV系小鼠胚胎PGCs分离并建立了
3个EG细胞系。待其观察到干细胞克隆时,将其转移到无
bFGF的PMEF上维持培养。对传至4代的EG细胞系做核
型分析及嵌合体实验,3个细胞系核型分别为40∶XY(EG1)、
40∶XX(EG3)、39∶XO(EG2)。将PGCs注射C57BL/6J小鼠
囊胚99枚,出生仔鼠62只,其中20只为皮毛嵌合体,嵌合
面积10%~90%,嵌合体正常。12只(5♀7♂)嵌合体小鼠
与C57BL/6J小鼠交配,出生539只后代,其中6只(4♀2♂)
嵌合体小鼠的169只后代为刺鼠型,证明这6只小鼠为生殖
系嵌合体。研究结果证实EG细胞与ES细胞同样具有形成
功能性配子和实现生殖系嵌合,产生嵌合体的能力。
1996年,吴白燕等〔14〕用北京大学生命科学学院所建立
的ES细胞系MESPU13通过囊胚显微注射到C57BL/6J小
鼠的囊胚中构建嵌合体小鼠。在注射了2~9个ES细胞的
136个囊胚中,127个囊胚(93%)经过3 h的培养后重新出现
囊胚腔。当把119个恢复的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫时,
获得63只(52.9%)出生鼠。在59只存活到可以判定毛色
阶段的小鼠中,有21只(35.6%)被判定为嵌合鼠,显示了该
ES细胞系具有较高的嵌合能力。同年,何维等〔15〕采用源于
Swiss小鼠远交群的昆明品系小鼠囊胚成功建成了三个远交
系小鼠ES细胞系,核型正常率均达到70%以上,自第八代
起分批冻存。复苏后,培养至第12代,消化成单细胞,通过
囊胚显微注射,将其注射到615品系小鼠胚胎获得嵌合体,
这是首例用远交系小鼠胚胎干细胞系培育成功嵌合体小鼠。
在1999年,陈伟胜等〔16〕选用近交系C57BL/6J及远交系
KMW和ICR为受体胚胎提供者,分别通过囊胚注射法和
8—细胞期桑葚胚注射法进行了嵌合体构建实验。共获得嵌
合体81只,经毛色分析确定在进行测交的42只嵌合体中有
19只是种系传递者,为国内小鼠ES细胞种系嵌合体的首例
报道。通过对小鼠ES细胞囊胚注射后形成嵌合体,进一步
培育出整合于生殖系的小鼠品系。囊胚注射法制作嵌合体
这一套技术路线在制备基因剔除小鼠时已成功运用,该技
的优点是可以对每个单克隆细胞进行分析,并由此培育出
克隆细胞发育出来的小鼠。由于首先在ES细胞水平进行
操作,获得表达目的基因的单克隆细胞,经囊胚显微注射得
到表达目的基因的嵌合体小鼠,再由此培育出纯系小鼠,所
以在整个过程中ES细胞的分化潜能直接关系到小鼠的正常
发育。姚玉成等(2001)〔17〕为了探讨小鼠ES细胞参与早期
胚胎发育的潜能,以neo基因作为目的基因进行了ES细胞
的转染,经G418的筛选,获得表达neo基因的单克隆细胞,
然后进行囊胚注射60枚受体小鼠囊胚,恢复培养后移植到5
只假孕小鼠,得到了携带有neo基因的嵌合体小鼠,通过对
嵌合体小鼠各组织PCR分析发现,neo基因可以在皮肤、肝
脏、血液等多种组织中存在。
除了种内嵌合体,小鼠种间嵌合体早已有成功的报道。
虽然大小鼠嵌合胚、田鼠和小鼠嵌合胚能成功地附植,但没
有成活的嵌合体出生。Rossant用ICM注入法,首次获得了
小鼠种间嵌合体(Mus musculus←→Mus caroli)。在嵌合体内
没有发现细胞系之间的选择性排斥关系。用GPI酶分析,显
示骨骼肌中有杂交的GPI酶,说明两种不同来源的成肌细胞
融合为正常功能的肌纤维。正常小鼠胚胎与多倍体胚胎、雌
核发育胚胎所制作的聚合胚也分别被用来进行了大量嵌合
体的研究〔18~20〕:正常胚胎在细胞松弛素B作用下,染色体
加倍形成三倍体或四倍体胚胎。这种多倍体胚胎发育迟缓、
组织畸形,即使出生也不能存活。与正常胚胎嵌合后,3n或
n细胞虽参与各种组织形成,但仍影响正常胚胎发育。Lu
1980)和Azuma(1991)分别获得了成活的4n←→2n、3n←→
n嵌合小鼠,并具有正常生殖能力,繁殖实验证明,所有的后
代均为2n细胞来源。这种多倍体胚胎嵌合体在研究性染色
体及剂量补偿作用、多倍染色体对个体发育的影响方面具有
重要价值,是研究染色体功能、基因平衡、基因定位的良好模
型。单性生殖胚胎(Parthenogenetic Embryo)是将受精卵中
的雄原核或雌原核挑去,在用细胞松弛素B使其染色体加
倍,从而得到正常胚胎数目的染色体。由于XY型为致死
型,因而这种加倍后的胚胎皆为XX型。这种雌核发育胚胎
在附植后很快死亡。Stevens(1978)〔18〕将1枚正常受精的小
鼠胚胎与2枚孤雌发育的桑葚胚,去除透明带后在Whitten
氏液中聚合培养,形成3胚聚合的胚胎;将55枚3胚聚合胚
移植至6只假孕雌鼠,产出两窝共7只仔鼠,经检测其中1
雌性和1雄性仔鼠为嵌合体。证明源于孤雌胚的细胞能存
活并参与形成正常的器官。雌核发育胚胎能广泛形成嵌合
体各种组织。但成活个体在体型上均小于正常小鼠。与多
倍体胚胎不同,雌核发育胚胎能参与嵌合体生殖系形成,并
产生有功能的卵子。Market等( 1978 )〔21〕和Petters
1980)〔22〕还得到了由3个或4个胚胎聚合而成的6个双亲
和8个双亲的小鼠嵌合体及其后代,不过这种6个以上双亲
的嵌合小鼠,选择遗传标记更加困难。这类嵌合体对研究
巨型”胚胎的生长和调节等具有一定的价值。
上述研究结果表明,虽然迄今还没有完全由孤雌胚发育
而成的后代,但因孤雌胚细胞可参与形成各种组织包括生殖
细胞,故可能通过缺少父源遗传结构的生殖系仅将母源的遗
传信息传给后代。换句话说,通过嵌合体技术可能产生孤雌
发育的个体。因此,有必要深入研究。
2.2 其它哺乳动物嵌合体的研究进展
由于家畜胚胎的发育特点,体外培养条件与小鼠相比差
异较大,有关家畜嵌合体方面的报道比较少。
.2.1 羊:Pighills曾首先尝试用桑葚胚聚合法制作嵌合体
绵羊。最初用ICM注入法制作嵌合体的成功率不及3%。
utler(1985)发现ICM注入法同样得到较高比例的嵌合体绵
羊。且在制作聚合胚时发现,当细胞数量比正常胚胎多时则
易形成嵌合体,而细胞数量少于正常胚胎时则产生嵌合体的
比例明显下降,其原因可能是细胞数量多时,参与ICM的机
会增加。1998年有人成功地报道了把从山羊胎儿采取的原
始生殖细胞在STO细胞上继代培养,这些细胞从形态特征,
对AKP阳性的反应及在体外分化成各种细胞的全能性来
看,确定是山羊EG细胞。但是,关于嵌合体形成没有得到
验证。嵌合体显示对两个细胞系的免疫耐受性,这同样适用
于种间嵌合体,因而种间嵌合体成为母体与胎儿免疫识别机
制及研究妊娠失败的良好模型。Fehilly(1984)分别用聚合法
和注射法制作绵山羊嵌合胚,然后移植到与受体胚泡同种的
假孕受体,结果绵羊和山羊能分别产下正常的种间嵌合体。
尽管雌性绵山羊等嵌合体能生产正常绵羊胎儿,但却不能怀
孕山羊和杂交种胎儿。其失败的原因可能是一种母体的细
胞毒性抗体对种特异性抗原的反应引起的。
2.2.2 牛:牛嵌合体的报道也有几例。最初用ICM注入法
制作种间嵌合体(Bos indicus←→Bos taurus),尽管没有产生
外观可见的嵌合牛,但生化检测表明内脏器官存在嵌合
性〔23〕。Brem(1984)〔24〕获得一头嵌合牛,此牛是由4个半胚
组成的聚合胚发育而成的,与绵羊嵌合体的发现相同,可能
聚合胚中细胞数量越多时,不同细胞系参与形成ICM的机
率相应提高。Picard(1990)〔25〕将8 d ICM与5.5 d桑葚胚聚
合后得到5头嵌合牛,说明8 d ICM仍能参入嵌合牛中ICM
的形成,同时发现10 d的ICM与5.5 d胚胎能形成聚合胚,
但不能参与成体发育。Cibelli〔26〕利用转基因技术得到了生
殖系嵌合牛,在1998年,用显微注射法把将囊胚建立的细胞
系导入基因后的基因转移细胞系注入受体胚,制作了转基因
嵌合体牛。另外,基因导入后的胎儿成纤维细胞,注入去核
的卵母细胞,所形成的囊胚建立起的转基因细胞系,同样具
有形成嵌合体的能力。结果表明,判定这些细胞株为牛ES
细胞。但是,牛生殖系制作嵌合体未见报道。
2.2.3 猪:在1990~1991年猪ES细胞的建立有许多报道,
但是,所有形式的判定标准,形态特征,未能测出在体外的分
化能力,胚体形成或者细胞标记物腊丁18(细胞分化标记
物),没做获得的细胞嵌合体形成能力的实验。在1992年,
Kashiwazeki采用ICM注入法将白化品系ICM注入褐色被
毛受体囊胚中,产生了2头嵌合猪。Mueller等(1999)自30
个25~28 dpc WAPhGH转基因猪胎儿生殖嵴分离PGCs,将
其注射到209枚6日龄猪囊胚,重组胚移入11头受体猪,用
转基因标志作PCR试验,分析49个胎儿和8头仔猪PGCs
是否参与嵌合,检测结果32个胎儿呈现5/12种组织嵌合,8
头仔猪为皮肤基因转染,其中4头表现皮色嵌合。
3 嵌合体的制作方法
迄今为止,制作嵌合体的方法有两种,即聚合法和囊胚
注射法,可根据实验目的而选用。
3.1 聚合法〔27~34〕
聚合法是用胚梁将除去透明带的两枚8细胞至桑葚期
胚胎或来自两个胚胎的分裂球与ES细胞聚合在一起,称为
聚合法。聚合法适用于同种,发育阶段处于同步或者差距不
大的胚胎。其方法是在2个8细胞胚胎中间夹几个ES细
胞;1993年,Wood等〔27〕人报告了一种简单、有效的产生嵌合
鼠(包括种系嵌合鼠)的方法,该方法仅需要将ES细胞同8
细胞时期的胚胎进行简单的共培养即可完成。1997年,何维
等〔28〕以MC15为供体ES细胞,用KMW品系小鼠8细胞期
的胚胎为受体胚胎,采用聚合法共植入8细胞期胚胎35个,
产仔18只,产仔率51.4%,获得嵌合鼠2只。用聚合法制作
嵌合体,操作简便,不需要特殊的仪器设备,是制作嵌合胚和
嵌合体动物的有效方法。
3.2 囊胚注射法〔25~44〕
囊胚注射法技术难度较大,但适用范围较广,可用于种
·3·《上海畜牧兽医通讯》 2008年第3期
或种间,供体和受体的发育阶段可同步,也可以是不同步
,它还适用于不能去透明带的动物,如兔等。该法是将几
个ES细胞(一般5~15个左右)注入囊胚腔中。但囊胚注射
法需要购买昂贵的仪器,而且技术难度较大,需要一定的时
间才能掌握。
4 嵌合体鉴定〔45〕
嵌合体鉴定也称嵌合体标记(Markers of chimera)或嵌合
体分析(Analysis of chimea),通过鉴定所选择的不同细胞系
的遗传标志在嵌合体中的出现,即可判定是否不同培养细胞
参与了嵌合胚的发育。迄今所用的嵌合体鉴定方法可分为
人工标记和遗传标记两种方法。
4.1 人工标记
此种方法多用于蛙类嵌合体的鉴别,哺乳动物中较少应
用。其最典型的标记物为活体染色色素和油滴。此外使用
的标记物还有0.1~0.2μM的珠状物,放射性物质、荧光胶
质金、黑色素颗粒、山葵过氧化物等。
4.2 遗传标记
它是根据嵌合体在嵌合前两个胚胎本身所具有的特性
作为标记来进行鉴定,如由遗传所决定的黑色素以及通过生
物化学、染色体、细胞学、组织学、组织化学、免疫组织化学等
方法能够鉴别的物质等。为了检测ES细胞的嵌合程度,目
前通常是采用两个遗传标记。
.2.1 色素分析法:这是最简单且直观的分析方法,一般选
择皮肤颜色、毛色差异的动物胚胎来制作嵌合体。由于供体
ES细胞与受体胚胎来源品系有明显的毛色区别,故可根据
移植后代是否具有ES细胞来源的毛色明确判定嵌合体。嵌
合体的毛色嵌合程度按ES细胞来源毛皮所占大致比例估
算,结果以百分率表示,外观无受体品系毛色掺杂的嵌合体
毛色嵌合程度计为100%。在嵌合体构建实验中,通常以嵌
合体的毛色嵌合程度推测内脏(尤其是种系)的嵌合程度。
在毛色嵌合程度较高的嵌合体中,种系嵌合的发生及种系嵌
合程度似乎是随机的,与毛色嵌合程度无明显的相关性,这
说明毛色嵌合程度与脏器嵌合程度并不完全平行。因此,有
必要对毛色嵌合程度较低的嵌合体也进行测交分析。
.2.2 生物化学法:主要通过测定嵌合体血液或组织中的
特定酶(同工酶),如磷酸葡萄糖异构酶(GPI)、磷酸葡萄糖变
位酶(PGM-1)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6-PGDi)等,也可
以根据细胞抗原、血清运铁蛋白和白蛋白类型来确定是否有
亲缘关系,以鉴定是否是嵌合体。GPI同工酶分析方法相当
灵敏,其灵敏度约为2%〔46〕,用很微量的样品就可以达到分
析目的。虽然目前已有了一些更为灵敏的方法,如使用PCR
法〔47〕或利用小卫星DNA〔48〕的方法。但由于GPI方法的快
速、简便和价格适中的优点,仍是目前广泛使用的方法。GPI
广泛存在于动物体内的所有组织细胞内,非常稳定,主要催
化六磷酸葡萄糖和六磷酸果糖的互变反应。在小鼠中,GPI
-1基因位于第7染色体上,绝大多数近交系小鼠的基因型
为纯合的GPI-1a或GPI-1b,a和b为两个共显性的等位
基因。在进行电泳时,根据等位基因a和b的不同,可以得
到A型和B型的条带〔49〕。通常在构建嵌合体鼠的实验中,
选择带有与供体细胞不同的等位基因的胚胎作为受体,有利
于对嵌合鼠体内组织器官中的嵌合情况进行分析。
5 嵌合体的应用前景
对哺乳动物基因组进行人工改造,最终是为了获得带有
人们所期望的目的性状的转基因动物,这是哺乳动物遗传工
程研究的一项重大课题。哺乳动物发育的基因调控在过去
由于种种原因(如哺乳动物突变种很少,生命周期长,胚胎是
在母体子宫中发育,数量少等)难以有很大进展。随着ES细
胞的建立,可以在培养瓶中进行突变和筛选,并且筛选出来
的突变细胞株可以经受反复的冻存和复苏,还可以进行嵌合
体分析和分子遗传学分析。或运用体细胞遗传操作技术,在
细胞水平上对带有遗传修饰的转化ES细胞进行有效的筛
选,最终使目的基因整合到生殖细胞中,并传入后代成为种
系嵌合体。由于嵌合体动物在胚胎发育过程中的特殊性,它
不仅是遗传工程的重要组成部分,而且可以作为发育生物
学、细胞生物学、胚胎学、免疫学、医学、畜牧学等方面均具有
广泛应用价值。它既为这些研究提供特殊的动物模型,也可
用于人工创造特殊的动物。
5.1 研究染色体畸变
在对许多遗传病的研究中,发现许多体细胞核的染色体
是非整倍体(Aneuploid),其中单体和三体(Trisome,Ts)最常
见。非整倍体←→2n嵌合体是研究染色体功能、基因平衡、
基因定位的良好模型。在哺乳动物含有非整倍体的个体往
往伴有严重的遗传障碍,一般不能存活。目前人们借助EC
细胞或生化手段已经构建出含有单体或三体染色体的小鼠
嵌合体。
5.2 研究基因突变
在20世纪80年代获得小鼠ES细胞以来,ES细胞在基
因工程领域受到普遍重视,将ES细胞注入受体囊胚是其完
成个体发育的唯一途径。通过基因的同源重组技术可将突
变基因导入ES细胞,当携带突变基因的ES细胞参与嵌合体
生殖系组成后,即可在繁殖后代中研究突变基因的作用。
Goldstein等(1979)证明EC细胞具有高度亲合低密度脂蛋白
的受体,并进一步准备诱发低密度脂蛋白受体缺损株,把这
种细胞注射到囊胚中,从而有望获得与人类高胆固醇血管症
相同的动物模型。1987年Hooper等〔50〕人(英国爱丁堡大
学)以及同年Kuehn(英国剑桥大学)分别从ES细胞中通过
自发突变或诱发突变得到了HPRT-的ES细胞,并通过嵌
合体和嵌合体的繁育得到了HPRT缺陷型的小鼠模型,为研
究人类遗传病Lesch-Nyhan综合征(是由于不能合成雌黄
嘌呤转磷酸核糖激酶而引起)提供了良好的遗传研究模型。
5.3 转基因动物生产方面的应用
从20世纪60年代开始,经过体细胞遗传学家和病毒学
家的长期努力,已经建立起许多成熟的技术可以将外源基因
导入体外培养的细胞并得到稳定表达的转化细胞系。但是,
由已经分化的在体外培养的体细胞无法产生哺乳动物,而哺
乳动物的受精卵或早期胚胎细胞又受到数量和可培育时间
与条件的限制也无法使用这些成功的方法。ES细胞系的建
立将体细胞转化技术和嵌合体技术结合起来,建立了转基因
动物的新途径。Gosseler(1986)、Tokunaga等(1992)利用磷
酸钙方法将neo基因导入ES细胞,并获得了能稳定传递neo
基因的转基因小鼠,显示用ES细胞作为转基因工具与DNA
原核注入法、逆转录酶病毒感染方法相比具有一定的优越
性。主要是可以在细胞水平获得明确的转入基因是否整合
或表达,再由这种明确的细胞发育成个体,避免了对子代小
鼠既要进行DNA水平检测筛选,又要进行RNA或蛋白水平
检测筛选,从中才能获得转基因小鼠的过程,直接就可以获
得整合或表达目的基因的嵌合体小鼠,尔后通过培育获得转
基因小鼠,这为将来进一步探讨该技术的广泛应用奠定了基础。
5.4 嵌合体在胚胎种间移植方面的应用前景
胚胎种间移植,对保存濒临灭亡的动物、克服杂交不育
等方面具有重要意义,但是由于种特异性抗原的相互作用关
系使胚胎种间移植受到极大限制。迄今有关胚胎种间移植
获得成功的报道有:家牛与水牛的交互移植、马与驴的交互
移植、欧洲盘羊移植到家绵羊、野牛胚胎移植到Holstein母
牛、斑马胚胎移植到马等。杂交胚胎细胞能参与正常胚胎发
育,其原因可能是因为胚胎滋胚层与假孕母体属于同一种
类,从而屏蔽母体的种特异性抗原对异种胚胎的ICM的免
疫识别,使异种胚胎能够存活。在制作的绵山羊嵌合体中,
绵羊和山羊能分别产下山羊和绵羊羔,如果这种方法在濒危
动物种类上有可行性的话,有可能为“挽救”濒危动物开辟了一
·4·《上海畜牧兽医通讯》 2008年第3期
全新的途径,可望在实际应用中不断扩大珍稀动物数量。
5.5 嵌合体在繁育纯系动物中的发展前景
在哺乳动物纯系繁育过程中,培育良种的时间是重要的
因素。例如,培育纯系小鼠需要进行20代近交繁殖(约5年
时间),并且最多产生98%的纯合体,此外由于近交衰退导致
生命力和繁殖力降低,因而大多数动物近交繁殖均告失败。
arkert等(1977)报道用显微外科方法制作雌核发育胚胎以
来,为繁育纯系动物提供了最简捷的方法。Stevens、
ndregg、Paldi分别获得了含有雌核发育胚胎的嵌合小鼠,并
得到了含生殖细胞嵌合的个体。这种个体的卵巢有雌核发
育胚胎来源的完全一致的卵子,从而大大缩短了培育纯系小
鼠的时间(约3个星期)。
6 目前研究存在的问题
如上所述,嵌合体在发生学、医学、产业的各个领域有着
无限广阔的利用前景。但目前需研究和解决的问题有:
高效培育嵌合体的方法,特别是通过种间或各种细胞的
组合获得嵌合体;培育各组织、器官的特异性部分嵌合体个
体;消除种间的胚胎着床后发育与受体间的免疫排斥性;研
究更适合的标记。

㈨ 如何查自己是不是嵌合体

网上有这样的说法，智商遗传母亲的比例大，特别是女儿，你这情况是遗传基因学了，得通过基因检测。

㈩ 小鼠敲除基因之后出生致死 有哪些原因

小鼠敲除基因之后出生致死可能是基因排序紊乱导致的。

基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最来自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。

有关基因敲除的可以联系苏州赛业，赛业生物已服务全球数万名科学家，产品和技术已直接应用于包括CNS（Cell，Nature, Science）三大期刊在内的学术论文。除了提供基因敲除、基因敲入、条件性基因敲除模型定制服务外，赛业生物还有专业的手术疾病模型团队，可以提供多种复杂精细的小动物手术疾病模型；药物筛选评价小鼠平台可以提供从欧美行业领袖引进的免疫缺陷鼠、用于心血管及阿尔茨海默症等研究的人源化小鼠；国际标准化无菌鼠技术平台可以提供无菌鼠、无菌动物定制服务、微生物菌群移植服务等基于无菌动物模型的各类产品和服务，结合赛业生物成熟稳定的基因编辑小鼠平台，还可帮助您研究菌群与基因的互作机制。