病理科vcr检测方法

❶ PCR鉴定微生物,请问一下具体的步骤是什么

PCR即聚合酶链式反应是常用的快速扩增基因的方法。
通过PCR可以鉴定到种
具体步骤：
1将培养过的微生物（最好是青年时代的）提取基因组（这步不清楚再问我）
2 通过PCR扩增，
3 测定基因序列
4 和已知的基因图库上的序列比较，就可以确定是哪一个种
不过现在一般不采用基因组来比较，这样工程量太大。比较16SRNA是比较常用的方法。相对简单，准确度高。

❷ RT-PCR检测方法的具体步骤

RT-PCR检测方法的具体步骤如下：

（一）RNA提取
1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。
2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。 3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。
4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。
6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。
7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。
8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。
9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。
10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。
（二）反应体系配制
1、实验设计： 检测标本RNA
阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。） 阳性对照：已知病毒RNA

2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液） 1）按下表加入试剂： PCR反应体系
对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：
（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；
（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。
2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。

3）加RNA模板（在核酸提取区）
将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反应
将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR 扩增。

4、RT-PCR产物检测
1）2.0％琼脂糖凝胶制备：称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。
2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。
3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。 4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。 5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。
5、结果判断。

❸ PCR产物的检测方法有哪些都有什么原理

1.琼脂糖凝胶电泳
同时点分子量marker，根据marker条带判断产物分子量大小，从而大致判断是不是你要的
2.酶切
已知你产物的序列，看上面有什么酶切位点，用一个酶或者两个酶切断，看与理论预测的条带数目和大小是否一致。一般检测有以上两步就行了，如果需要知道确切的需要进行3
3.测序
连接到pMD-18t
载体上，转到大肠杆菌中。拿到公司去测序，测序结果通过gene
bank比对看与哪个基因一致，这种方法最准确
4.表达
pcr产物连到真核或者原核表达载体上，适宜条件表达出来以后的蛋白做质谱分析，看与理论产物表达的蛋白是否有一致的片段

❹ rt pcr的扩增检测需要首先经过什么过程后才能进行pcr循环

1、PCR引物设计

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则：引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

引物内部不应出现互补序列。两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

2、模板的制备

PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

❺ pcr的特异性检测和敏感性检测要怎么做

1. pcr灵敏度检测

   1.1 样本准备：以4次方国家一级或者二级标准品为基础样本，用阴性血清进行倍比稀释，稀释后的样本浓度分别为1000IU/ml、500IU/ml、250IU/ml、125IU/ml、100IU/ml、50IU/ml、25IU/ml，每份样本使用1000μl进行检测。

   1.2 用质检合格核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行检测，每个浓度每批次试剂盒做5个复管，分析各浓度标本的检出率（即阳性率）。以标本浓度值对数为横坐标，对应的检出率为纵坐标描点，用Origin的Sigmoidal Fit 的方法拟合成曲线，根据软件给出的曲线公式计算出当检出率为95%时所对应的浓度，此浓度即为本试剂盒对HBV标本的分析灵敏度。

2. pcr特异性检测

   2.1 参考样本选择：选择与目的片段相近或者感染方式相似的其他病毒或者细菌高载量样本，同时应满足临床或者其他方法确认目的片段为阴性，做5个副管扩增并且全部为阴性。以乙肝为例：选择高载量HCV、CMV、EBV、HSV2的阳性标本各1个（乙肝表面抗原为阴性）,分别检测乙肝表面抗原及乙肝核酸量。每个测5次，全部阴性或者在参考范围以下为特异性良好。

   希望能够帮到你，有其他需要可以随时交流！

❻ pcr实验详细步骤是怎么样的

1、模板的取材主要依据PCR的圹增对象，可以是病原体标本如病毒、也可以是病理生理标本如细胞等。

2、标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品霓要经过SDS和蛋白 酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。

3、引物最好在模板cDNA的保守区内设计，引物长度一般在15~30碱基之间，引物长度常用的是18~27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应

4、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度

5、引物3’端要避开密码子的第3位，引物3′端不要终止于密码子的第3位，引物3′端不能选择A，最好选择T，引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异。

(6)病理科vcr检测方法扩展阅读：

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。

通过DNA基因追踪系统，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别，精确检测乙肝病毒在患者体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否必要服药、肝功能有否异常改变。

能及时判断病人最适合使用哪类抗病毒药物、判断药物疗效如何、给临床治疗提供了可靠的检验依据。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

❼ PCR鉴定具体操作是什么怎么用它来鉴定某个基因的表达

fengzhe79同学只提到逆转录PCR，这只是半定量PCR。
mRNA一般使用RT-qPCR进行“定量”PCR。
步骤前三步同于“半定量”PCR，第四步PCR的时候，用的PCR试剂，必须带有荧光素，用实时定量PCR仪检测。通过数据分析，得到mRNA的含量。
（基因是通过mRNA进行翻译成为蛋白质）

❽ PCR检测的具体步骤是什么

具体步骤就是：
1，制备琼脂糖凝胶，或者聚丙烯酰胺凝胶
2，取少量（大概5ul）PCR产物（确定是否加入上样缓冲液），点样到凝胶孔里，记得点合适的maker
3，接通电源，调好电压（120V）,开始运行
3，等跑到大概2/3处，在紫外成像仪里查看条带。
就是如此，关键看你设备是否齐全

❾ 求助：免疫组化和基因检测的区别是什么

免疫组化和基因检测都对现在医学检查很重要，特别是在肿瘤治疗中，免疫组化现在几乎是必不可少的，可以帮助确定肿瘤的原发位置、预后以及对药物的敏感性，属于医院分子病理科的检查范围；基因检测是发现个体中基因的缺陷，涉及更多的遗传性或基因突变导致的疾病，并不仅仅局限于肿瘤。除了这些再通过以下一些对比帮助您了解免疫组化和基因检测的区别问题。
免疫组化和基因检测的材质不一定相同
免疫组化一般通过取得患者的组织，通常会使用穿刺、手术等方式获取，然后进行冰冻、切片、染色、分析等最终确定，由病理科负责检验。
基因检测大部分是采用外周血或者体液就可以进行，个别一些也需要病理组织做检验，目前大部分在基因检验公司进行，比较少的医院内部做基因检测。
免疫组化和基因检测对癌症治疗的帮助不同
免疫组化是可以帮助医生判断肿瘤的原发位置，肿瘤恶性程度及预后效果，对于药物的使用也有指导。
基因检测目前则主要偏向于药物的使用，在少部分基因缺陷的群体中有一定的预测关系；目前比较常见的包括微卫星不稳定MSI或基因错配修复缺失dMMR，还有BRCA1/2缺失的患者。
这里需要说明：微卫星不稳定与基因错配修复有一定的关系，存在基因错配修复确实的患者属于微卫星不稳定；但是反之并不一定。
微卫星不稳定和基因错配修复的检测可以通过免疫组化或者PCR基因检测方法进行，目前新确认二代基因测序方法也是可以的。
免疫组化和基因检测面对的病症并不相同
免疫组化主要是肿瘤科使用，主要是需要确定肿瘤的分子分型；大部分是在影像检测之后。
基因检测面对的群体比较广泛，健康群体也是可以的，包括肿瘤在内的其它疾病患者都可进行。
如果说免疫组化和基因检测在肿瘤中的作用也是不相同的，比如肺癌的EGFR突变，免疫组化是可以测出阳性；基因检测则可以测出EGFR相关外显子（18-21）和密码子的突变位置，这样指导靶向药物使用更加具体。
免疫组化和基因检测在现代医疗中的使用都比较常见，由于其中部分检查项目是重合的，让很多认真的患者认为是在重复检查，但是从实际使用中两者还是有很多细节上的区别。比如Ki-67这个指标，就在免疫组化检查中很常见，而基因检测并没有。所以患者在治疗前要遵从安排做好各项检查，尤其是精准医疗时代，只有对疾病把握的更全面充分，治疗才能更精准和有效。

❿ PCR产物的检测方法有哪些

PCR产物的检测方法：

1. 琼脂糖凝胶电泳

   这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。

   用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。

   （1）制胶

   琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入100ml0.5×TBE液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60℃时，加入终浓度0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。

   （2）加样和电泳

   上样时一般取PCR反应液5~10μl，加入3μl溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5×TBE液，接通电源，使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约30-60分钟。

   （3）检测

   将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，DNA产物与荧光染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。

2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳

   聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。

   聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨DNA片段的有效范围：

   (1)制胶
   

   在两块制胶玻璃板中间放上垫片，放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。

   制备适量合适浓度的凝胶，使之略多于胶板。制备100μl体积凝胶的配制方法见下表。

   不同浓度（%）聚丙酰胺凝胶的制法：

   
   

   

   
   

   在加入TEMED和10%过硫酸铵后，立即混匀，倒入放置45℃角的玻璃板内，完全注满（注意不要有气泡），迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧，待30-60分钟胶聚合后，取下胶板，放入电泳槽中固定。

   （2）加样和电泳

   上下槽中加入1×TBE电泳缓冲液，溢过加样孔，拔出梳子，排出加样孔中的气泡，将PCR产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀，用微量注射器加入加样孔底部，使样品在孔底成一层，两侧孔中加入标准分子量的DNAMarker。

   以2-10V/cm电压电泳，电泳时间足够长，使片断足以分开，待指示剂走到适宜位置时关闭电源，将胶片取出。

   （3）银染

   分开两块玻璃板，将凝胶片放入100ml银染固定液中振荡15min，双蒸水洗3次，每次2min，然后将凝胶片转入100ml0.2%的AgNO3中于摇床上染色约10min，吸去AgNO3液，用双蒸水洗3次，每次30s，加入100ml显色液约7-10min，待DNA带显示清除时，吸去显色液，加入固定液Na2CO3，静置2-3min，取出凝胶观察。