酶蛋白检测试验方法

A. 蛋白的常用蛋白鉴定方法

传统的蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选。目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序、进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术。 “满天星”式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析。在一系列高质量的2-DE凝胶产生(低背景染色，高度的重复性)的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。
首先，采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD(charge coupled device)照相机;激光密度仪(laser densitometers)和Phospho或Fluoro imagers，对图象进行数字化。并成为以象素(pixels)为基础的空间和网格。
其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工，以进行斑点检测。利用Laplacian，Gaussian，DOG(difference of Gaussians) opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、周长和方向。
图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致。在这一原则下，多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析，边缘检测的软件可精确描述斑点外观，并进行边缘检测和邻近分析，以增加精确度。通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界。以PC机为基础的软件Phoretix-2D正挑战古老的Unix为基础的2-D分析软件包。
第三，一旦2-DE图象上的斑点被检测，许多图象需要分析比较、增加、消减或均值化。由于在2-DE中出现100%的重复性是很困难的，由此凝胶间的蛋白质的配比对于图象分析系统是一个挑战。IPG技术的出现已使斑点配比变得容易。因此，较大程度的相似性可通过斑点配比向量算法在长度和平行度观测。用来配比的着名软件系统包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，计算机方法如相似性、聚类分析、等级分类和主要因素分析已被采用，而神经网络、子波变换和实用分析在未来可被采用。配比通常由一个人操作，其手工设定大约50个突出的斑点作为“路标”，进行交叉配比。之后，扩展至整个胶。
例如：精确的PI和MW(分子量)的估计通过参考图上20个或更多的已知蛋白所组成的标准曲线来计算未知蛋白的PI和MW。 在凝胶图象分析系统依据已知蛋白质的pI值产生PI网络，使得凝胶上其它蛋白的PI按此分配。所估计的精确度大大依赖于所建网格的结构及标本的类型。已知的未被修饰的大蛋白应该作为标志，变性的修饰的蛋白的PI估计约在±0。25个单位。 同理，已知蛋白的理论分子量可以从数据库中计算，利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量。 未被修饰的小蛋白的错误率大约30%，而翻译后蛋白的出入更大。 故需联合其他的技术完成鉴定。 蛋白质的微量测序已成为蛋白质分析和鉴定的基石，可以提供足够的信息。尽管氨基酸组分分析和肽质指纹谱(PMF)可鉴定由2-DE分离的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是进行鉴定的主要技术。目前已实现蛋白质微量测序的自动化。 首先使经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上，染色、切割，然后直接置于测序仪中，可用于subpicomole水平的蛋白质的鉴定。 但有几点需注意：Edman降解很缓慢，序列以每40 min 1个氨基酸的速率产生;与质谱相比，Edman降解消耗大;试剂昂贵，每个氨基酸花费3～4$。 这都说明泛化的Edman降解蛋白质不适合分析成百上千的蛋白质。然而，如果在一个凝胶上仅有几个有意义的蛋白质，或者如果其他技术无法测定而克隆其基因是必需的，则需要进行泛化的Edman降解测序。
近来，应用自动化的Edman降解可产生短的N-末端序列标签，这是将质谱的序列标签概念用于Edman降解，业已成为一种强有力的蛋白质鉴定。当对Edman的硬件进行简单改进，以迅速产生N-末端序列标签达10～20个/d，序列检签将适于在较小的蛋白质组中进行鉴定。若联合其他的蛋白质属性，如氨基酸组分分析、肽质质量、表现蛋白质分子量、等电点，可以更加可信地鉴定蛋白质。选择BLAST程序，可与数据库相配比。目前，采用一种Tagldent的检索程序，还可以进行种间比较鉴定，又提高了其在蛋白质组研究中的作用。 质谱已成为连接蛋白质与基因的重要技术，开启了大规模自动化的蛋白质鉴定之门。用来分析蛋白质或多肽的质谱有两个主要的部分，(1)样品入机的离子源，(2)测量被介入离子的分子量的装置。
首先是基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)为一脉冲式的离子化技术。它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测其分子量。
其次是电喷雾质谱(ESI-MS)，是一连续离子化的方法，从液相中产生离子，联合四极质谱或在飞行时间检测器中测其分子量。
在MALDI-TOF中，最重要的进步是离子反射器(ion reflectron)和延迟提取(delayed ion extraction)，可达相当精确的分子量。在ESI-MS中，纳米级电雾源(nano-electrospray source)的出现使得微升级的样品在30～40 min内分析成为可能。
将反相液相色谱和串联质谱(tandem MS)联用，可在数十个picomole的水平检测;若利用毛细管色谱与串联质谱联用，则可在低picomole到高femtomole水平检测;当利用毛细管电泳与串联质谱连用时，可在小于femtomole的水平检测。甚至可在attomole水平进行。目前多为酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用鉴定蛋白质。下面以肽质指纹术和肽片段的测序来说明怎样通过质谱来鉴定蛋白质。
(1)肽质指纹术
由Henzel等人于1993年提出。用酶(最常用的是胰酶)对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂，断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量(MALDI-TOF-MS，或为ESI-MS)，这一技术能够完成的肽质量可精确到0。1个分子量单位。所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比(理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的)。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜，“冠军”肽片段可能代表一个未知蛋白。若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正确鉴定的可能性较大。
(2)肽片段的部分测序
肽质指纹术对其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白质。为进一步鉴定蛋白质，出现了一系列的质谱方法用来描述肽片段。用酶或化学方法从N-或C-末端按顺序除去氨基酸，形成梯形肽片段(ladder peptide)。
首先以一种可控制的化学模式从N-末端降解，可产生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定数目的肽质量由MALDI-TOF-MS测量。另一种方法涉及羧基肽酶的应用，从C-末端除去不同数目的氨基酸形成肽片段。化学法和酶法可产生相对较长的序列，其分子量精确至以区别赖氨酸和谷氨酰胺。或者，在质谱仪内应用源后衰变(post-source decay，PSD)和碰撞诱导解离(collision-inced dissociation，CID)，目的是产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列肽峰的质谱。因此，允许推断肽片段序列。 肽片段PSD的分析在MALDI反应器上能产生部分序列信息。首先进行肽质指纹鉴定。 之后，一个有意义的肽片段在实验仪器质谱仪被选作“母离子”，在飞行至离子反应器的过程中降解为“子离子”。在反应器中，用逐渐降低的电压可测量至检测器的不同大小的片段。但经常产生不完全的片段。现在用肽片段来测序的方法始于70年代末的CID，可以一个三联四极质谱ESI-MS或MALDI-TOF-MS联合碰撞器内来完成。在ESI-MS中，由电雾源产生的肽离子在质谱仪的第一个四极质谱中测量，有意义的肽片段被送至第二个四极质谱中，惰性气体轰击使其成为碎片，所得产物在第三个四极质谱中测量。与MALDI-PSD相比，CID稳定、强健、普遍，肽离子片段基本沿着酰胺键的主架被轰击产生梯形序列。 连续的片段间差异决定此序列在那一点的氨基酸的质量。由此，序列可被推测。由CID图谱还可获得的几个序列的残基，叫做“肽序列标签”。这样，联合肽片段母离子的分子量和肽片段距N- C端的距离将足以鉴定一个蛋白质。 1977年首次作为鉴定蛋白质的一种工具，是一种独特的“脚印”技术。利用蛋白质异质性的氨基酸组分特征，成为一种独立于序列的属性，不同于肽质量或序列标签。Latter首次表明氨基酸组分的数据能用于从2-DE凝胶上鉴定蛋白质。 通过放射标记的氨基酸来测定蛋白质的组分，或者将蛋白质印迹到PVDF膜上，在155℃进行酸性水解1 h，通过这一简单步骤的氨基酸的提取，每一样品的氨基酸在40min内自动衍生并由色谱分离，常规分析为100个蛋白质/周。依据代表两组分间数目差异的分数，对数据库中的蛋白质进行排榜，“冠军”蛋白质具有与未知蛋白质最相近的组分，考虑冠亚军蛋白质分数之间的差异，仅处于冠军的蛋白质的可信度大。Internet上存在多个程序可用于氨基酸组分分析，如AACompIdent，ASA，FINDER，AAC-PI，PROP-SEARCH等，其中，在PROP-SEARCH中，组分、序列和氨基酸的位置被用来检索同源蛋白质。 但仍存在一些缺点，如由于不足的酸性水解或者部分降解会产生氨基酸的变异。故应联合其他的蛋白质属性进行鉴定。

B. 蛋白浓度测定的方法具体有哪些

蛋白浓度测定的方法：

1. 紫外分光光度法

紫外光谱吸收法测定蛋白质含量是讲蛋白质溶液直接在紫外分光光度计中测定的方法，不需要任何试剂，操作简单且易回收。蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的，所以光密度受这两种氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差，其最大吸收在260nm。所以同时测定280及260nm两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。

2. 双缩脲法

利用半饱和硫酸铵或27.8％硫酸钠——亚硫酸钠可使血清球蛋白沉淀下来，而此时血清白蛋白仍处于溶解状态，因此可把两者分开，这种利用不同浓度的中性盐分离蛋白的方法称为盐方法。盐析分离蛋白质的方法不仅用于临床医学，而且还广泛地用于生物化学研究工作中，如一些特殊蛋白质—酶、蛋白激素等的分离和纯化。

蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物（双缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可于蛋白质的定量测定。

但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有—CH2—NH2等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。本实验用27.8％硫酸钠—亚硫酸钠溶液稀释血清，取出一部分用双缩脲反应测定蛋白质的含量，剩余部分则用滤纸过滤，使析出的球蛋白与白蛋白分离，取出滤液用同一反应测定白蛋白的含量。总蛋白与白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白与球蛋白之比即所谓的白／球比值。

3. Folin-酚试剂法

目前实验室较多用Folin-酚法测定蛋白质含量，此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。其原理是蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生兰色化合物，颜色深浅与蛋白含量成正比。

4. 考马氏亮蓝G-250

此方法是1976年Bradform建立。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便、快迅，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。考马氏亮蓝G－250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与 595nm的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。

以上便是实验室中常见的几种蛋白浓度测定的方法，另外还有凯氏定氮法和BCA法，有凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎。

C. 目前蛋白质的精确定量检测方法都有哪些

蛋白质鉴定是指对复配类蛋白品通过前处理提纯并通过生物质谱鉴定蛋白种类及含量（包括具体的分子量、定性、定量结果）或对纯蛋白品通过生物质谱鉴定具体的蛋白类型（包括具体的分子量、定性、定量结果）。
蛋白质种类鉴定业务范围：

水溶性蛋白、水解酶、蛋白酶、脂肪酶； 血清蛋白（白蛋白和球蛋白）、牛血清（白）蛋白、血清球蛋白； 乳清蛋白、复合蛋白质、乳清蛋白粉、β-乳球蛋白，α-乳白蛋白，免疫球蛋白，乳铁蛋白； 大豆分离蛋白、小麦蛋白（谷朊粉）、酪蛋白、纤维素酶、β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶、糖化酶； 碱性蛋白酶、果胶酶、聚半乳糖醛酸水解酶、脂肪酶、过氧化氢酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、超氧化物歧化酶、弹性蛋白酶。 动物饲料，大米，油料种子、谷类食品、谷类，大豆、玉米、鱼肉、果汁等各种食物中蛋白种类及含量。

D. 求助：蛋白酶酶活的测定方法

酶活测定方法 还原法
酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加化学试剂 ,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下 比色 ,即可求 出还原产物的含量 ,从而计算出酶活力的大小 。
色原底物法
通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。该底物与酶发生反应后 ,生色基团可被释放出来 ,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后 ,即可求出待测酶的活力。 粘度法
该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大 为降低。基 于Poiseuille定律我们知道 ,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法
酶与其底物在特定的条件下充分反应后 ,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量 ,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法
常用 于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法 、免疫凝胶扩散法。这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应 ,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法
将酶作用的底物与琼脂混合熔融后 ,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径 的小孔。在点加酶样并培养24h以后 ,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。

E. 一般采用什么方法检验蛋白质即鉴定

一般用双缩脲试剂鉴定，双缩脲试剂可以和蛋白质发生紫色反应。

F. 测定蛋白质分子量的常用方法

蛋白定量的测试方法有很多种，其中较为常见的有五种，分别是Bradford法、Bradford斑点试验、Coomassie 斑点试验、紫外分光度检测法及BCA法这五种。

在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，是经常进行的一项非常重要的工作。蛋白质是一种十分重要的生物大分子，它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法带来了许多具体的因难。

(6)酶蛋白检测试验方法扩展阅读

蛋白定量分析也就涉及到生产科研的多个领域及行业，也是生物学科、食品检验及掺假掺伪、临床检验、诊断疾病和质量检验中最常见的方法。

蛋白定量是生物学实验不可缺少的一部分。为验证细胞裂解是否成功，或为了将多个样品进行平行实验比较或标准化保存，需对细胞裂解液进行蛋白定量。

为了判定蛋白的产量，需对纯化好的蛋白进行定量。为了将纯化好的蛋白用生物素或者报告酶进行标记，同样需首先对蛋白样品进行定量，以保证标记反应在适当的化学浓度下进行。

G. 酶活性中心的测定方法

测定酶活性中心组成和结构是研究酶催化作用的重要课题。目前常用方法有：化学修饰法、反应动力学法、X－射线衍射法等。
1.化学修饰法：此方法是研究最早，应用最广泛的方法。原则上讲，酶分子侧链上的各种基团，如羧基、羟基、巯基和咪唑基等均可由特定的化学试剂进行共价修饰。当它被某一化学试剂修饰后，若酶活性显着下降或丧失，则可初步推断该基团为酶的必需基团。
2.动力学分析法：酶蛋白是含有许多解离基团的两性电解质，pH改变必然影响到解离基团的解离状态，处于活性中心基团的解离状态的改变必然影响到酶的活性。因此，通过研究酶活性与pH关系，可以推测到与催化直接相关的某些基团的pK值，进而推测这些基团的作用。另外，改变反应温度求出Vmax和Km与pH关系，从而求出有关基因解离的DH，DH的求得有助于补充pK值对活性中心的判断。在有机溶剂存在条件下，测定酶pK值与介电常数的关系，也有助于对活性部位的判断。
3.X－射线衍射分析法：化学修饰法和动力学分析只能推断酶活性部位氨基酸残基的数目，活性中心空间结构的信息，则需用X－射线衍射法。采用X射线衍射法在研究酶活性中心空间构象时，通常是将酶与底物类似物或专一性抑制剂形成复合物，而后作X－射线衍射分析，从而得到有关酶活性中心构象、酶与底物的接触状况以及催化机理的信息。
4.蛋白质工程：蛋白质工程是近年来发展的研究酶必需基团和活性中心的最先进的方法。蛋白质工程实质是按照人们的设想，通过改变基因来改变蛋白质的结构，制造新的蛋白质。利用基因定点突变技术将酶相应的互补DNA（cDNA）基因定点突变，突变的cDNA表达出被一个或几个氨基酸置换的酶蛋白，再测定其活性就可以知道被置换的氨基酸是否为酶活性所必需。此方法可改变酶蛋白中任一氨基酸而不影响其他同类残基和不引起底物和活性中心结合的立体障碍，以及可人工地造成一个或几个氨基酸的缺失或插入，了解肽链的缩短或延长对酶活性的影响和定点改变酶蛋白的糖基化位点或磷酸化位点，从而了解糖基化或磷酸化对酶结构和功能的影响。

H. 测定碱性蛋白酶活有哪些方法

碱性蛋白酶酶活力检测方法

酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。

碱性蛋白酶酶活测定原理 福林法原理

碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（Folin)（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力，以此计算其酶活力。

酶活力测定实验步骤

酶液制备：精确称取干酶粉1g（±0.001），加入10mL缓冲液（2.2.5），在小烧杯中溶解，并用玻璃棒搅拌，静置片刻后，将上层液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复搅拌溶解4次，最后全部移入100mL容量瓶中。用缓冲液定容至刻度，充分摇匀，用四层纱布过滤。吸取滤液5mL，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，所得液位稀释2000倍的酶液。（稀释倍数具体要看待测酶样品的酶活）

酶活定义

碱性蛋白酶活力单位的定义：1克碱性蛋白酶粉在pH10，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1微克酪氨酸，定为一个酶活力单位。

酶活力测定注意事项

1、酶反应的温度、pH和时间对被水解的肽键数量有直接的影响，因此必须严格控制。

2、用三氯醋酸终止反应后，过滤反应混合物所得的滤液必须是澄清的。

3、因为Folin试剂对酸性环境比较敏感，容易发生变化，因此在测定时有顺序的规定，需要先加入碳酸钠溶液形成一个碱性环境，之后再加入Folin试剂，使其能正常发挥作用

I. 酶联免疫检测的几种方法及其原理

（1）酶联免疫吸附试验（enzyme
linked
immunosorbent
assay,ELISA）：是将抗原或抗体吸附在固相载体表面。使抗原抗体反应在固相载体表面进行。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。
（2）夹心法（sandwich
assay）:将已知的特异抗体包装在固相载体（塑料板凹孔或纸片上），加入待检标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。
间接法（indirecr
ELISA）常用于检查特异抗体。先将已知特异抗原包被固相载体，加入待检标本（可能含有相应抗体），再加入酶标抗Ig的抗全（即第二抗体），经加底物显色后，根据颜色的光密度计算出标本中抗体的含量。
（3）BAS-ELISA：近年来对酶免设分析法的改进是使用生物素-亲合素-过氧化物酶复合物作为指示剂，组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。一个亲合素（avidin）分子可以结合4个生物素分子（biotin）。结合非常稳定。亲合素和生物素都可与抗全、酶、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲合素。因此大提高检测的敏感度。目前应用生物-酶标亲合素系统（biotinavidin
system-
ELISA,BAS-ELISA），它是通过生物素标记抗体连接免疫反应系统，同时借助生物素化酶或酶标亲合素引入酶与底物反应系统。

J. 酶的特异性鉴定试验

【实验目的】

1、了解酶的特异性

2、掌握检查酶特异性的方法及原理

【实验原理】

酶是生物体内一类具有催化功能的蛋白质（传统酶的概念），即生物催化剂。它与一般催化剂的最主要区别就是具有高度的特异性（专一性）。

所谓特异性是指酶对所作用的底物有严格的选择性，即一种酶只能对一种化合物或一类化合物（其结构中具有相同的化学键）起一定的催化作用，而不能对别的物质起催化作用。酶的特异性是酶的特征之一，但各种酶所表现的特异性在程度上有很大差别，又可分为结构特异性和立体异构特异性。

淀粉和蔗糖都是非还原性糖，分别为唾液淀粉酶和蔗糖酶的专一底物。唾液淀粉酶可水解淀粉生成具有还原性的麦芽糖，但不能水解蔗糖；蔗糖酶可水解蔗糖生成具有还原性的葡萄糖和果糖，但不能水解淀粉。

Benedict试剂是含硫酸铜和柠檬酸钠的碳酸钠溶液，可以将还原糖氧化成相应的化合物，同时 Cu2+被还原成Cu+，即蓝色硫酸铜溶液被还原产生砖红色的氧化亚铜沉淀。因此，可用Benedict试剂检查两种酶水解各自的底物所生成产物的还原性，来加深对酶特异性的理解。

【器材及试剂】

1、仪器：

（1）研钵 ；

（2）试管：6 支；

（3）试管架；

（4）小烧杯；

（5）刻度吸管：1毫升×5，2毫升×1 ；

（6）漏斗；

（7）电热恒温水浴。

2、试剂：

（1）1% 淀粉溶液（含0.3%NaCl）：将1克可溶性淀粉及0.3克氯化钠，混悬于5毫升蒸馏水中，搅动后缓慢倒入沸腾的60毫升蒸馏水中，搅动煮沸1分钟。晾至室温后加水至100毫升，放置于冰箱贮存。

（2）2% 蔗糖溶液：蔗糖是典型的非还原糖，若商品蔗糖中还原糖含量超过一定标准，则呈还原性，这种蔗糖不能使用。所以，实验前必须进行检查。本实验用的蔗糖至少应是分析纯的试剂，要现用现配。

（3）淀粉酶液：稀释200倍的新鲜唾液。

（4）蔗糖酶液：取1克新鲜酵母放入研钵中，加少量石英砂和蒸馏水，研磨10分钟左右，用蒸馏水稀释至50毫升，静止片刻再过滤，滤液即为蔗糖酶提取液。

（5）本乃狄（Benedict）试剂：将17.3克硫酸铜溶解于100毫升蒸馏水中。冷却后稀释至150毫升。取柠檬酸钠173克及碳酸钠（Na2CO3·H2O）100克，加水600毫升，加热使之溶解，冷却后，稀释至850毫升。最后把硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可停止。

【操作步骤】

取6支试管编号，按下表操作：

酶的反应特点：

1、高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；

2、专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽；

3、多样性：酶的种类很多，迄今为止已发现约4000多种酶，在生物体中的酶远远大于这个数量；

4、温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的；

5、活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等；

6、易变性：大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏；

7、有些酶的催化性与辅助因子有关；

8、改变化学反应速率，本身几乎不被消耗；

9、只催化已存在的化学反应；

10、能加快化学反应的速度，但酶不能改变化学反应的平衡点，也就是说酶在促进正向反应的同时也以相同的比例促进逆向的反应，所以酶的作用是缩短了到达平衡所需的时间，但平衡常数不变；

11、降低活化能，使化学反应速率加快；

12、与无机催化剂一样，也会出现中毒现象。