hCMV细胞感染的检测方法

A. 巨细胞病毒是通过什么检查出来的

唾液、尿液、子宫颈分泌液等标本离心沉淀，将脱落细胞用姬姆萨染色镜检，检查巨大细胞及核内和浆内嗜酸性包涵体，可作初步诊断。
分离培养可将标本接种于人胚肺纤维母细胞中，由于CMV生长周期长，细胞病变出现慢，为了快速诊断，可将培养24小时的感染细胞固定，用DNA探针进行原位杂交，检测CMV DNA。
用ELISA检测lgM抗体和lgG抗体，适用于早期感染和流行病学调查。LgG抗体可终身持续存在，lgM抗体与急性感染有关。
不论是初次感染或复发感染，当病毒血症时，可用葡聚糖液提取外周血单个核细胞，制成涂片，加CMV单克隆抗体，采用免疫酶或荧光染色，检测细胞内抗原。
近年应用免疫印迹法和分子杂交技术直接从尿液，各种分泌物中检测CMV抗原和DNA是既迅速又敏感，准确的方法。

B. 巨细胞病毒怎么办

新生儿黄疸是指未结合胆红素升高的一组新生儿疾病.新生儿血清胆红素水平对个体的危害性受机体状态和环境多种因素的影响.首先,在某些情况下,低于现行生理性黄疸标准,也有形成胆红素脑病的可能,而超过生理性黄疸水平的健康足月儿不一定会造成病理性损害.第二,新生儿生后血脑屏障的发育和胆红素水平是一个动态发育的过程,胎龄及日龄越小,出生体重越低,血清胆红素超过一定限度对新生儿造成脑损害的危险性越大.所以,不能用一个固定的界值作为新生儿黄疸的干预标准. 新生儿黄疸的干预标准应为随胎龄,日龄和出生体重而变化的多条动态曲线.新生儿黄疸的干预方案应建立在病史,病程,体检和权衡利弊的基础上.推荐适合我国国情的新生儿黄疸干预标准见表 1, 2,并做以下说明. 1. 在使用推荐方案前,首先评估形成胆红素脑病的高危因素,新生儿处于某些病理情况下,如新生儿溶血,窒息,缺氧,酸中毒（尤其高碳酸血症）,败血症,高热,低体温,低蛋白血症,低血糖等,易形成胆红素脑病,如有上述高危因素应尽早干预. 2. 24h以内出现黄疸者,应积极寻找病因,并给予积极的光疗措施. 3. 24~72h,出院前出现黄疸者至少要检查1次血清胆红素,出院后48h应于社区或医院复查胆红素,以监测胆红素水平. 4. 出生后7d内（尤其是出生后3d内）接近但尚未达到干预标准者,应严密监测胆红素水平,以便得到及时治疗.无监测条件的地区和单位可适当放宽干预标准. 5. "考虑光疗"是指在该日龄的血清胆红素水平,可以根据临床病史,病程和体检做出判断,权衡利弊,选择光疗或严密监测胆红素. 6. "光疗失败"是指光疗4~6h后,血清胆红素仍上升8.6μmol/(Loh),如达到上述标准可视为光疗失败,准备换血. 早产儿胆红素增长速度快,肝脏及血脑屏障发育更不成熟,干预方案应有别于足月儿.早产儿黄疸治疗标准按照胎龄,日龄,出生体重而形成多条动态曲线.有形成胆红素脑病的高危因素的早产儿,应予以更早期的预防性光疗. 一,干预方法 （一） 光照治疗 1. 光源:蓝光最好（主峰波长为425~475nm）,也可选择白光（波长550~600nm）或绿光（波长510~530nm）. 2. 方法:单面光疗法,双面光疗法. 3. 时间:分连续和间歇照射.前者为24h连续照射;后者是照10~12h,间歇14~12h.不论何法,应视病情而定. 4. 光疗期间需密切监测血清胆红素浓度,一般12~24h测定1次,对溶血病及血清胆红素浓度接近换血指征者,应每4~6h测定血清胆红素和红细胞压积.光疗结束后,连续监测2d,以观察有无反跳现象.当反跳值超过光疗前水平时,需再次光疗. （二） 光疗注意事项 1. 灯管连续使用2 000~2 500h需更换新灯管.在治疗Rh溶血病等重症高胆红素血症时,应更换新灯管. 2. 光疗箱要预热,待灯下温度在30℃左右时才放患才入内. 3. 用黑色,稍硬不透光纸片或布遮盖双眼,尿布遮盖生殖器. 4. 由于光疗时不显性失水增加,因此光疗时液体入量需增加15%~20%. （三） 光疗的副作用 目前认为光疗相当安全,基本无明显并发症.有一些相对较轻和一过性的并发症. 常见表现有发热,腹泻,皮疹,核黄素缺乏,青铜症及低血钙等. 二,换血疗法（参见新生儿溶血病诊疗常规） （一） 血液的选择 1. Rh血型不合时,采用Rh血型与母同型,ABO血型与新生儿同型或O型血.在Rh（抗D）溶血病无Rh阴性血时,也可用无抗D（IgG）的Rh阳性血. 2. ABO血型不合时,最好采用AB型血浆和O型红细胞混合后换血,也可选用O型或与子同型血液换血. 3. 对有明显心力衰竭的患儿,可用血浆减半的浓缩血来纠正贫血和心力衰竭. 4. 血液首选新鲜血,在无新鲜血的情况下可使用深低温保存的冷冻血.换血前先将血液在室内预热,使之与体温接近. （二） 抗凝剂 每100ml血加肝素3~4mg,.换血后可用肝素半量的鱼精蛋白中和.枸橼酸盐保养液可结合游离钙,引起低钙血症,故每换100ml血应缓注10%葡萄糖酸钙1ml,换血结束时再缓注2~3ml. （三） 换血方法 1. 换血途径有经脐静脉换血,脐静脉和脐动脉同步换血及周围血管同步换血法. 2. 换血量和换血速度:换血总量按150~180ml/kg,总量约400~600ml.每次抽输血量3~5ml/kg.输注速度要均匀,每分钟约10ml. 3. 换血后处理: （1）继续光疗重点护理,每4h测心率呼吸,注意黄疸程度及嗜睡,据食,烦躁,抽搐,拥抱反射等情况,黄疸减轻即可解除.使用抗生素3d预防感染,拆线后改为一般护理,继续母乳喂养. （2）血常规每1~3 d检测1次,胆红素每天1次.出院后每2周复查1次红细胞和血红蛋白直至生后2个月. （3）1次换血后,血清胆红素可再次上升,此时可按指征考虑再次换血. 三,药物治疗 1. 一般治疗:如存在引起胆红素脑病的高危因素,应给予对症治疗. 2. 酶诱导剂:苯巴比妥5mg/（kgod）,分3次口服. 3. 抑制溶血过程:大剂量丙种球蛋白;一般用于重症溶血症的早期,用量为1g/kg,4~6h内静脉滴注. 4. 减少游离的未结合胆红素:白蛋白:一般用于生后1周内的重症高胆红素血症,用量1g/kg加葡萄糖液10~20ml静脉滴注;也可用血浆25ml/次静脉滴注,每日1~2次.在换血前1~2h应输注1次白蛋白.

C. 新生儿巨细胞病毒感染的检查

1.实验室检查具有下列任何1项即可诊断。(1)分离出HCMV;;从尿液、血液、唾液、乳汁等组织中分离出HCMV。(2)检出巨细胞病毒;;除外其他病毒感染时，在受检组织细胞中见到典型的巨细胞病毒。(3)血清特异抗体检测;; ①血清抗CMVIgG：从阴性转为阳性表明原发性感染。 ②血清抗CMV;IgM：...阳性结果表明HCMV感染；如同时有抗体CMV-IgG阴性，表明原发性感染；但新生儿产生IgM能力差，因此即使感染了HCMV仍可出现假阴性。(4)特异的单克隆抗体检测;;用特异的单克隆抗体从受检组织或细胞中检测到CMV抗原，表示HCMV活动，从周围血细胞中查得CMV抗原又称为CMV抗原血症。(5)分子杂交或聚合酶链反应法;;用分子杂交或聚合酶链反应法从受检材料中检出CMV-DNA特异片段表明CMV感染，可为潜伏感染或活动性感染。2.其他辅助检查;(1)X线检查;;肺部呈间质性肺炎表现。(2)B超;;有肝脾肿大等改变。(3)脑电图;;异常波形。

D. 巨细胞病毒抗体(CMV-IgG)和巨细胞病毒抗体IgM(CMV-IgM)的检测结果，望专业人士及团队能帮忙解答，谢谢！

表明没有感染病毒的IGM阴性，IgG阳性代表已经感染了艾滋病毒。因此，在怀孕前或怀孕期间，产科医生会要求做产前检查和产后护理检查，以确定是否正常的指标是看IGM是阴性或阳性。巨细胞病毒IGM是阴性，表明你是不是感染了这种病毒，所以对胎儿的影响不大。咨询产科医生和妇科医生的权威，她是这么说的，所以你可...以放心。通常只要提高个人体质，不要让病毒复发。所以，你可以考虑怀孕。 ， IgM阳性，IgG抗体+：在体内抗体的早期感染;近期复发感染或潜伏在体内的病毒被激活，高风险，也可以采取其他检测方法进一步证实，如果近期感染指标仍积极或胎儿不佳，应终止妊娠。 IgM阳性，IgG抗体：原发感染的急性期，危险性极高，临床上非常罕见。该处理方法是相同的。 IgM抗体，IgG抗体+：早期感染，体内有抗体，有一定的免疫力，近期无感染。低风险，无需进一步处理。 IgM抗体，IgG抗体：没有感染史，对身体有没有抗体，没有免疫力。考虑无风险的易感人群，应严格监控，有条件的人工免疫。

E. 巨细胞病毒是什么，它的基因是怎么定量的，危害大吗

人巨细胞病毒核酸定量检测的临床意义（PCR荧光探针法）：
不同人群感染HCMV的临床表现：①孕妇：孕妇感染后多数无症状，仅约10%会出现发热、乏力、头痛等单核细胞增多样表现。②胎儿：HCMV的母婴转播对胎儿造成的影响是巨大的，可致流产、死胎、胎儿生长迟缓。而引起母婴转播的孕妇本人几乎不表现出明显症状。③婴幼儿：宫内感染出生时仅10%表现出临床症状和体征包括：黄疸、肝脾肿大、血小板减少、紫癜，中枢神经系统异常等。无症状的新生儿5-15%会在1年至数年内出现后遗症，其中以单侧或双侧进行性神经性耳聋最为常见。④器官移植者：HCMV感染是继器官移植免疫排斥反应之后最重要的导致器官移植失败的原因。⑤妇女：HCMV和高危型HPV感染混合感染是宫颈癌发病的重要因素。

F. 巨细胞病毒的鉴别诊断

巨细胞病毒对人类的危害性很大，所以我们应积极预防其发生。 巨细胞病毒药品 唾液、尿液、子宫颈分泌液等标本离心沉淀，将脱落细胞用姬姆萨染色镜检，检查巨大细胞及核内和浆内嗜酸性包涵体，可作初步诊断。分离培养可将标本接种于人胚肺纤维母细胞中，由于CMV生长周期长，细胞病变出现慢，为了快速诊断，可将培养24小时的感染细胞固定，用DNA探针进行原位杂交，检测CMVDNA。用ELISA检测lgM抗体和lgG抗体，适用于早期感染和流行病学调查。IgG抗体可终身持续存在，lgM抗体与急性感染有关。不论是初次感染或复发感染，当病毒血症时，可用葡聚糖液提取外周血单个核细胞，制成涂片，加CMV单克隆抗体，采用免疫酶或荧光染色，检测细胞内抗原。应用免疫印迹法和分子杂交技术直接从尿液，各种分泌物中检测CMV抗原和DNA是既迅速又敏感，准确的方法。CMV感染诊断中应注意的问题：CMV感染的诊断依据详见CMV感染诊断方案，临床应用中需注意以下几方面的问题。1．对CMV感染的诊断主要依靠实验室检查结果，因此实验室操作从试剂选用至结果判定，都需保证质量。采用国际上尚未公认的新方法时，应与“金标准”病毒分离等结果对照，考核其可靠性。2．在中国小儿中，原发感染大多发生于婴幼儿时期，此时又多呈产毒型感染状态。以后随着年龄增长趋向潜伏感染。但在患有其他疾病时，体内病毒又可被激活，呈现产毒型感染。如人们观察过3岁以上的53例急性黄疸型甲型肝炎，在他们的急性期除2例(3.8%）外均伴有CMV感染，其中半数以上（64.2%）为再发感染，以后随访中发现又转为潜伏感染，可以作为佐证。
3．CMV感染小儿多表现为无症状性感染，只有少数为症状性感染，且又多发生于先天性和围生期感染患儿。在严重免疫缺陷时，可出现肺炎、肝炎等全身疾患。
4．CMV感染可累及宿主机体各个器官和系统，但产生严重病变的机会不多，靶器官的损害又与患儿的年龄有关。中枢神经系统损害（如小头畸形、智能障碍等）和先天畸形主要见于先天性感染；肝炎、肺炎还可见于婴幼儿时期感染。因此，在生后感染患儿身上发现有中枢神经损害和先天畸形，将其归为CMV感染所致是不科学的。
5．新生儿在娩出时，往往会在其体内混入微量母亲血液，脐带血更甚。故从脐带血或初生新生儿血中用PCR法查得CMVDNA，以示新生儿感染也是不可靠的。应该再次对新生儿复查或作其他病毒学检查核实。
6．对症状性CMV感染如肺炎、肝炎的诊断，仅仅依赖血清学或尿、血中病毒学检查阳性结果也欠妥当。因为这些检测结果只能表现体内有CMV存在或复制，却无定位意义。如从病变肺、肝组织中原位检测阳性则就可靠，但是实施困难。因此，应该采取肺炎患儿的下呼吸道分泌物替代或排除能够引起同样病症的其他病因和病原，力求诊断可靠。 1．根据其感染的次序可分为：⑴原发感染(primaryinfection）：指宿主初次感染CMV，而在感染前缺乏对CMV的任何特异性抗体（6个月以前的婴儿可有从母体被动获得的IgG抗体）；⑵再发感染（recurrentinfection），是由于潜伏在宿主体内的病毒被重新激活（reactivation）而复制增殖；或再次感染（reinfection）外源性不同毒株或更大剂量的同株病毒。CMV侵入宿主体内，并在宿主体内复制或潜伏，即为CMV感染。
巨细胞病毒研究2．根据宿主获得感染的时间可分为：⑴先天性感染（congenitalinfection）：指由CMV感染的母亲所生育的子女，于其出生14天内（含14天）证实有CMV感染，为宫内感染所致；⑵围生期感染（perinatalinfection）：为CMV感染母亲的子女，在出生14天内没有发现CMV感染，而于生后第3～12周内证实感染者，主要经产道或母乳途径获得感染。以上两型都是原发性感染；⑶生后感染（postnatalinfection）或获得性感染（acquiredinfection）：指在出生12周后证实有感染（出生12周内无CMV感染证据），可以是原发感染，也可以为再发感染。人们前瞻性观察47例由CMV感染母亲生育的子女至1周岁，其中先天性感染27.7%，围生期感染23.7%，生后感染34%，无感染14.6%。但在临床工作中，由于患儿没有从出生开始定期作过CMV检测，因此较晚就诊者很难确定为何型感染。有些先天性感染患儿，出生时没有症状，以后才出现智能减退或耳聋，故应格外重视，予以定期随访。3．根据有无症状出现，又可分为：⑴症状性感染（symptomaticinfection）：指出现与CMV感染相关的症状和体征。若CMV损害宿主2个或2个以上的器官、系统时又称全身性感染(systemicinfection），多见于先天性感染，仍可沿用病理诊断名称即巨细胞包涵体病(cytomegalicinclusiondisease，CID）；若CMV损害主要集中于宿主的某一器官或系统，则可相应地称为CMV性肝炎（CMVhepatitis）、CMV性肺炎（CMVpneumonia）或传染性单核细胞增多症(infectiousmononucleosis）等。在症状性感染时，患儿体内均有病毒活动，处于产毒型感染阶段。⑵无症状性感染（asymptomaticinfection）：指体内病毒复制状态有二种情况：一是有病毒复制，若足以引起靶器官或组织损害，临床表现有体征和器官功能改变，称之为亚临床型感染（subclinicalinfection）；若未引起靶器官损害，则无相应体征和功能变化，为真正的无症状性感染。后者是病毒处于潜伏状态或呈不全感染。 巨细胞病毒的研究
CMV具有典型的疱疹病毒形态，其DNA结构也与HSV相似，但比HSV大5%。本病毒对宿主或培养细胞有高度的种特异性，人巨细胞病毒（HCMV）只能感染人，及在人纤维细胞中增殖。病毒在细胞培养中增殖缓慢，复制周期长，初次分离培养需30～40天才出现细胞病变，其特点是细胞肿大变园，核变大，核内出现周围绕有一轮“晕”的大型嗜酸性包涵体。机体的细胞免疫功能对CMV感染的发生和发展起重要作用，细胞免疫缺陷者，可导致严重的和长期的CMV感染，并使机体的细胞免疫进一步受到抑制，如杀伤性T细胞活力下降，NK细胞功能减低等。机体原发感染CMV后能产生特异性抗体和杀伤性T淋巴细胞，激活NM细胞。抗体有限CMV复制能力，对相同毒株再感染有一定抵抗力，但不能抵抗内源性潜伏病毒的活化，及CMV其他不同毒株的外源性感染。而通过特异性杀性T淋巴细胞和抗体依赖细胞毒性细胞能发挥最大的抗病毒作用。

G. 检查巨细胞病毒有几种方法

建议：巨细胞病毒微生物学诊断
唾液、尿液、子宫颈分泌液等标本离心沉淀，将脱落细胞用姬姆萨染色镜检，检查巨大细胞及核内和浆内嗜酸性包涵体，可作初步诊断。
分离培养可将标本接种于人胚肺纤维母细胞中，由于CMV生长周期长，细胞病变出现慢，为了快速诊断，可将培养24小时的感染细胞固定，用DNA探针进行原位杂交，检测CMV DNA。
用ELISA检测lgM抗体和lgG抗体，适用于早期感染和流行病学调查。LgG抗体可终身持续存在，lgM抗体与急性感染有关。
不论是初次感染或复发感染，当病毒血症时，可用葡聚糖液提取外周血单个核细胞，制成涂片，加CMV单克隆抗体，采用免疫酶或荧光染色，检测细胞内抗原。
近年应用免疫印迹法和分子杂交技术直接从尿液，各种分泌物中检测CMV抗原和DNA是既迅速又敏感，准确的方法。

H. 有关巨细胞病毒的治疗

孕产妇感染巨细胞病毒后的处理原则 ： 1.妊娠早期确诊孕妇患巨细胞病毒感染，应立即行人工流产终止妊娠，或等待至妊娠20周时抽取羊水或脐静脉血检查特异性IgM，若为阳性应终止妊娠进行引产，以免分娩先天缺陷儿。2.妊娠晚期 感染巨细胞病毒或从宫颈管分离出病毒者无需特殊处理；妊娠足月临产后，可经阴道分娩，因胎儿可能已在宫内感染巨细胞病毒。由于新生儿尿液中可能有CMV，故应使用一次性尿布，或用过的尿布做消毒处理。3.产妇乳汁中检测出巨细胞病毒，应停止哺乳，改用人工喂养。4.抗病毒药物对巨细胞病毒感染孕妇无实际应用价值，阿糖腺苷8～l0mg／（kg·d）静脉滴注可能有效。大剂量干扰素能抑制病毒血症，缓解病情。概述编辑本段CMV感染在全世界分布，人是CMV的唯一宿主。不同国家及不同经济状况感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切关系。 诊断编辑本段单靠临床表现不能诊断CMV感染，从临床标本中分离出病毒，同时抗体呈出4倍以上增加或持续抗体滴度升高，将有助于诊断。 一、病毒分离 最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白细胞，接种到人的成纤维细胞内繁殖和分离，细胞病变效应（CPE）在1天或数周后出现，经固定和HE染色后可观察到巨细胞，核内有内包涵体，核周晕圈及嗜酸性胞浆内包涵体，很象“猫头鹰眼”（owl′s eye）亦可用单克隆或多克隆抗体的荧光染色等方法检查。 二、血清抗体检测 最常用的有补体结合试验（CF）、间接免疫荧光试验（IIF）、免疫酶试验（EIA）、间接血凝试验（IHA）和放射免疫试验（RIA）等检测CMV-IgG和IgM抗体。当单份血清标本已确定既往有CMV感染时，应当立即留血清标本，以及间隔2周、4周、8周再留血清标本，结合病毒分离可作原发感染诊断。 三、DNA探针 已广泛应用于检测CMV，其中以32P标记的探针敏感性最高，对某些标本来说，杂交方法可能比病毒分离更敏感。 四、聚合酶链式反应（PCR） （一）标本的采集及处理 采集的标本包括患者的血液、尿，以及腺体组织等。由全血制备的血沉棕黄层（buffy coats）可保存于-80℃；尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。 尿液标本经2500r/min离心10min，以除去细胞碎片，收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制剂，因此需用聚乙二醇（PEG6000）进行预处理：50μl尿上清与50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合，置冰浴中6h；15000r/min离心30min收集沉淀。再于6400r/min离心3min；尽可能吸去上清，将沉淀悬浮于蒸馏水中。该悬液可直接用于PCR扩增；扩增时应于100℃加热10min，迅速置冰浴中冷却。 （二）模板DNA的制备 1．由血液标本制备模板DNA 方法A：向血清中加入NaCl使最终浓度为150mmol/L；取10μl 此血清于70℃处理45s后即可直接进行PCR扩增。 方法B：由血沉棕黄层（BCP）制备： ① 用PBS洗涤BCP两次，收取沉淀。 ② 加入500μl 6mol/L盐酸胍，匀浆。 ③ 加入30μl 10mmol/L EDTA，10mmol/L NaCl，30μl20% Sarcosyl和5μl 蛋白酶K（10mg/ml），混合均匀，60℃反应1h。 ④ 加入1130μl 的乙醇，-20℃沉淀1～2h。 ⑤ 离心收集DNA沉淀。 ⑥ 用70%乙醇洗两次，最后将沉淀悬浮于少量10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA中。置4℃备用。 2.由冰冻组织标本制备模板DNA： ① 用恒冷切片机切取一块5～10μm冰冻组织块，置于1.5ml塑料管中。 ② 加入10%用缓冲液配制的福马林。 ③ 10min后离心1～2min轻轻倾去上清液，沉淀用乙醇洗2次。 ④ 于室温干燥10～60min。 ⑤ 加入抽提缓冲液（100mmol/L Tris-HCl，4mmol/L EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K），使刚好浸没沉淀物（约50～100μl ）；将沉淀捣碎。福马林固定的或石蜡包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。 ⑥ 37℃放置过液。 ⑦ 置沸水中7min灭活蛋白酶K。 ⑧ 离心收集上清，取1～10μl 即可进行PCR扩增。 3.由尿液标本制备模板DNA： ①100μl 尿上清液与100μl 6mol/L异硫氰酸胍，7μl 2mol/L NaCl和20μl 玻璃粉悬液（DNA PREP，Asahi Glass Co，Tokyo）混合。 ② 室温放置10min后，6400r/min离心2min，收集沉淀。 ③ 沉淀用50%乙醇，10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次，6400r/min离心1min。 ④ 同样洗涤沉淀2次，收集沉淀。 ⑤ 加入50μl 蒸馏水，于55℃作用15min。 ⑥ 15000r/min离心2min，收集上清（含HCMV DNA），进行PCR扩增，将此悬液于100℃加热10min，并迅速于冰浴中冷却。 （三）引物及探针 引物及探针的设计是根据已发表的CMV的直接早期蛋白基因的启动子区和开始的4个外显子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探针列在表3中。 （四）PCR扩增步骤 1．10×反应缓冲液：100mmol/L Tris-HCl、pH8.4，500mmol/L KCl，25mmol/L MgCl2，2mg/ml明胶。 Taq DNA 聚合酶：5U/μl 。 10×dNTP：4种dNTP各2.0mmol/L。 引物：100pmol/L。 2．常规PCR扩增 10×反应混合物（50μl）反应缓冲液 5μl 10×dNTP 5μl 模板DNA 5μl Taq DNA聚合酶 0.2μl (IU) 引物 各0.5μl 蒸馏水 3.8μl 加1～2滴矿物油。 将反应混合物于94℃加热5min；然后于95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 60s，扩增35～40循环。 3．套式（nested）PCR扩增： ①反应混合物的组成同（2），仅引物为IE2a和IE4b（包括了整个外显子3，共721b），各100pmol。于94℃ 60s，52℃150s，72℃ 480s，扩增20循环。 ② 取2μl 上述扩增产物，各加100pmol的引物IE3a和IE3b补加其他试剂。然后，于94℃ 60s，52℃150s，72℃180s，扩增20循环。 （五）产物鉴定 扩增产物的分析可采用固相（滤膜）杂交和液相杂交试验。 1． 固相杂交： ① 预杂交液为3×SSPE，5×Denhardt，0.5%SDS和25%甲酰胺.含有扩增产物的滤膜于42℃预杂交30～60min。 ② 加入标记探针（10cpm/μg，2ng/ml），杂交30～60min。 ③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分别于室温洗涤滤膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室温洗一次以上,5min/次。 ④ 自显影。 2． 液相杂交及电泳分析： ① 取1/10体积的扩增产物与0.5～1.0pmol末端记的探针混合。 ② 加入最终浓度为150mmol/L NaCl，10mmol/L磷酸钠及1mmol/L EDTA溶液，使总体积为20μl 。 ③ 95℃ 10min，然后于56℃ 60min。 ④ 离心10s加入样品缓冲液，于8%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。 ⑤ 电泳毕，用溴化乙锭染色，然后对X线片曝光，自显影。 HCMV DNA分子很大，其碱基序列尚未全部搞清。虽然它的DNA的限制性内切酶片段长度具多形性，但是对其基因组的离散性还不清楚。用单一引物对进行PCR扩增，可鉴定90%的HCMV野型分离株；而采用针对不同HCMV序列的两套以上的引物对，则可检测几乎所有的病毒株。因此，可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行PCR检测。 在HCMV模板DNA制备过程中，有时会产生一些小片段DNA，在PCR反应时常导致一定水平的本底产物，从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式PCR法，其基本原理就是靶DNA的扩增分为两步：首先利用一对引物，扩增包括靶DNA在内的长片段DNA；然后取少量的扩增产物，利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增。通过控制每步中的扩增循环数，即可防止由小片段DNA引起的假阳性。这种方法也可避免产生假阴性结果。 PCR检测HCMV标本具有很高的敏感性。从HCMV感染的组织培养上清可检测到相当于几十个病毒的DNA分子或1～5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探针进行Southern杂交分析扩增产物，可从尿液标本中检测到1pgHCMV DNA序列的水平；利用该系统，在4×104个细胞中只有一个病毒基因组即可检测出，较斑点印迹杂交提高2×103倍。 PCR技术对HCMV感染的检测具有临床应用价值，因为体液中病毒DNA先于病毒感染的临床症状或血清学证据的出现，可作为HCMV感染的早期指标。由于HCMV可通过胎盘内感染、产道感染等途径传播，而且受感染的新生儿死亡率较高，因此利用PCR进行早期诊断及采取及时的治疗措施，对优生