雅睿生物非洲猪瘟检测器使用方法

1. 非洲猪瘟的检测方法有哪些非洲猪瘟疫情防控方法是什么

荧光定量 PCR 方法，该方法是将光谱技术引入到PCR 反应中，通过荧光信号的强弱变化定量测定特异性扩增产物的量，解决了常规 PCR 方法敏感性低和电泳检测中溴化乙锭对环境的污染问题。

等温扩增法，该方法是一种新兴的分子生物学检测方法，等温扩增方法不需要 PCR 中的变性、退火步骤，即可完成对靶序列的循环扩增，大幅缩短了时间，整个扩增反应时间一般少于 60 min，而常规PCR 方法的反应时间一般需要 2 h 以上。等温扩增试剂盒适合现场检测，灵敏度高，能够大幅提高猪瘟防控的可行性。

要减少场外人员和车辆进入猪场，要对人员和车辆入场前彻底消毒，要对猪群实施全进全出饲养管理，要对新引进生猪实施隔离，要按规定申报检疫。

非洲猪瘟防控注意事项

养殖场应该坚持全进全出，自繁自育的养殖模式，构建完善的封锁隔离措施，避免猪和野猪直接接触。养殖场在生猪调运过程中，尽量不要跨省引进种猪，必须引种时，一定要进行严格的产地检疫、疫情检测，严格执行落地报告制度和隔离观察制度。

殖场内部如果发现非洲猪瘟可疑疫情，严格按照《非洲猪瘟疫情应急预案》进行处置，迅速采取应急措施，预防疫情传播和蔓延。

2. 非洲猪瘟用什么消毒水消毒最好

一、种类

最有效的消毒药有10%苯及苯酚、去污剂、次氯酸、碱及戊二醛。

碱类（氢氧化钠、氢氧化钾等）、氯化物和酚化合物适用于建筑物、木质结构、水泥表面、车辆和相关设施设备消毒。酒精和碘化物适用于人员消毒。

简述几种常用消毒剂的使用

1.氢氧化钠

氢氧化钠也叫火碱，易溶于水，是一种高效消毒药，常用浓度为2％-3％。因其有一定的腐蚀性，所以不建议在猪舍内部使用，适合用于消毒池或者猪舍外的环境消毒。

猪场入口处的消毒池应为进出车辆车轮的两个周长以上，以确保车轮能全部得到消毒，宽度应与入口大门等宽，深度为浸入车轮轮胎高度的二分之一为宜，最小不得小于15厘米。猪场大门处最好设置喷雾消毒装置，对车身、车底进行细致、彻底的消毒。消毒池内的氢氧化钠溶液浓度可以适当增加到5％-8％，以加强消毒效果。使用氢氧化钠溶液喷雾消毒时，消毒人员应注意做好防护工作，要穿戴橡胶手套、防护眼镜等，避免被灼伤。

小型养殖场，如果没有配备消毒池，可将火碱直接铺在大门外，宽度与门口等宽，长度约为进出车辆车轮的两个周长以上，厚度约为5厘米，也可起到很好的消毒效果。

2.漂白粉

漂白粉是目前应用最为广泛的含氯消毒剂，其有效成分为次氯酸钙，有一定的氯臭味。其消毒作用与其有效氯含量有关，因此在使用储存的漂白粉前，需要先测定其有效氯含量。一般来说，有效氯含量低于16％时，不宜用于消毒。

漂白粉可用于养殖场内的路面和粪污消毒。用于砖地或水泥路面消毒时，可将漂白粉均匀地撒在地面上，再用喷水壶进行洒水；泥地可用10％-20％的漂白粉混悬乳，将泥土与混悬乳混合处理；用于粪污消毒时，可按照漂白粉与粪污1∶5的用量，一边搅拌，一边加入漂白粉。漂白粉对金属有腐蚀作用，不宜用作金属物品的消毒。

二、疫点内饲养圈舍清理、清洗和消毒。

1、对圈舍内外消毒后再行清理和清洗

2、清理污物、粪便、饲料等

3、对地面和各种用具等彻底冲洗，洗刷圈舍、车辆，对污水进行无害化处理

4、对金属设施设备，可采取火焰、熏蒸等方式消毒

5、对饲养圈舍、场地、车辆等采用消毒液喷洒的方式消毒

6、饲养圏舍的饲料、垫料等作发酵或焚烧处理

7、粪便等污物作化学处理后深埋、堆积密封或焚烧处理

三、交通工具清洗消霉

1、出入疫点、疫区的交通要道设立临时性消毒点，对出入人员、输工具及有关物品进行消毒

2、疫区内所有可能被污染的运载工具应严格消毒，车辆内、外及所有角落和缝隙都要用消 毒剂消毒后再用清水冲洗，不留死角

3、车辆上的物品也要做好消毒

4、从车辆上清理下来的垃圾和粪便要作无害化处理

四、生猪交易市场消毒清洗

1、用消毒剂喷洒所有区域

2、饲料和粪便等要化学处理后深埋、发酵或焚烧

五、生猪屠宰，加工，储藏等场所清洗消毒

1、所有带毒生猪及其产品都要化学处理后深埋或焚烧

2、圈舍、过道和舍外区域用消毒剂喷洒消毒后清洗

3、所有设备、桌子、冰箱、地板、墙壁等用消毒剂喷洒消毒后冲洗干净

4、所有衣服用消毒剂浸泡后清洗干净，其他物品都要用适当的方式进行消毒

5、以上所产生的污水要经过处理，达到环保排放标准

六、消毒频率

疫点消毒1天3-5次，连续7天，之后1天一次，疫区内疫点以外的区域每天消毒1次，持续消毒21天。

3. 非洲猪瘟怎么办

得了非洲猪瘟怎么办？严重的按规定做无害化处理。轻度以及未感染者立即做好隔离。做好生物安全防控（消杀）。在给猪只饲喂铁兰32提高猪只免疫机能。这样可以最大化降低损失。

非洲猪瘟病毒和经典猪瘟病毒若要通过饲料传播,饲料需被病毒污染且以传染性形式存活。所以非洲猪瘟防控一定要重视。

得了非洲猪瘟怎么办？铁兰32

4. 非洲猪瘟消毒方法

可以在猪场安装一台DCW次氯酸发生器，使用这种设备电解盐和水生成的次氯酸对猪舍、猪饮用水，以及猪场环境进行消毒，经检测，次氯酸可以快速、彻底杀灭非洲猪瘟病毒。使用盐和水电解生成的次氯酸无毒，杀菌后可降解成盐和水，无腐蚀，不刺激动物，可带活体喷雾消毒。

5. 非洲猪瘟用什么消毒液

由于没有治疗非洲猪瘟的**物，因此如何预防做好生物安全就显得尤为重要。有些养殖户对于各类消毒药的用途和用法还比较模糊，在此我给大家详细讲一下。

第一种：氢氧化钠（经济实用）

氢氧化钠也叫火碱/烧碱，易溶于水，是一种高效消毒药，常用浓度为2％-3％。因为该消毒剂属于强碱，所以使用过程要小心处理，尽量避免灼伤。

该消毒药的常用方法为。1.消毒池的牧场进出口，人员车辆进出脚底，车辆四轮消毒。2.栏舍的喷雾消毒，但是注意的是栏舍消毒过后要清水洗净，以免灼伤生猪。

第二种：戊二醛（经济实用）

戊二醛消毒具有广谱、强效、速效、低毒等特点。因其价格较贵且对金属基本无腐蚀性，所以常用来对器械消毒，其消毒效果是甲醛的10-20倍。戊二醛常总在空栏舍的消毒。

第三种：过硫酸氢钾（使用面广）

过一硫酸氢钾，有极强的水溶性和腐蚀性，因其可提供超强有效的非氯氧化电势和微生物效能，而被广泛应用于工业生产和消毒领域，它还具有储存稳定性好、使用安全方便等特点。

其他在牧场中常用的消毒药有：生石灰，漂白粉，甲醛，高锰酸钾等等。各种消毒药应当交替轮换使用。在这场非洲猪瘟的防控攻坚战中，做好生物安全才是决胜的法宝，猪栏里有猪，才能在之后的市场中立于不败之地）。

6. 哪里能检测非洲猪瘟病毒，检测要多长时间

农业农村部：在动物检疫中对生猪及其产品开展非洲猪瘟病毒检测，应当使用我部批准或经中国动物疫病预防控制中心比对符合要求的检测方法及检测试剂盒（试纸条），确保检测结果准确。符合要求的检测方法及检测试剂盒（试纸条）可从中国动物疫病预防控制中心网站查询。

中国动物疫病预防控制中心与中国动物卫生与流行病学中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所等单位共同组成了评价专家组，开展了非洲猪瘟现场快速检测试剂评价工作

中国动物疫病预防控制中心：

非洲猪瘟病猪主要临床表现差异较大，不易识别，但通常有以下几种或全部典型症状，包括高热、呕吐、腹泻或便秘，有的便血，虚弱、难以站立，体表不同部位（尤其是耳、鼻、腹部、臀部）皮肤呈红色、紫色或蓝色，有的咳嗽、呼吸困难，母猪流产、产死胎或弱胎。出现上述临床症状后，一般2-10天内死亡。剖检可见内脏多个器官组织出血，脾脏显着肿大，颜色变暗，质地变脆。部分首次发生非洲猪瘟的养殖场，猪群发病非常急，最急性型不表现任何症状而突然死亡，无特征性剖检病变。

资料来源：中国动物疫病预防控制中心《非洲猪瘟现场排查手册》

7. 预防非洲猪瘟专用消毒设备

预防非洲猪瘟最好用高浓度的次氯酸，次氯酸氧化性强，经检测高浓度次氯酸可以快速杀灭非洲猪瘟病毒。推荐你安装一台DCW次氯酸发生器，这种设备使用盐和水电解现场生产高浓度的次氯酸溶液，有效氯浓度可达1000ppm，完全可以预防非洲猪瘟病毒。

8. 得了非洲猪瘟怎么办

自己的猪发现了疑似非洲猪瘟的症状，该怎么办？
首先，要立马进行上报，上报的时候可以找一下当地的畜牧部门电话，没有也可以和当地的社区，派出所联系，或者直接拨打110进行上报也可以，他们会安排人到你家里去查看，确认。在相关部门人员到来前，首先，我们要做好处置工作，在第一时间将养殖场关闭，禁止人员进出，已经死亡的病猪不要去触碰，在最短的时间内隔断养殖场和外界接触的可能性。
其次，非洲猪瘟不是人畜共患病，我们自身要保持冷静，沉着去应对不要慌张。不要因为害怕疫情到处去跟别人沟通，知道的人越少越好，毕竟我们还没有确认，以免引起不必要的恐慌。相关部门人员到达后，我们要积极的配合相关工作，查找出来疑似感染病毒的来源，让相关人员在第一时间了解到详细的情况，妥善的处置，避免再次出现疫情。
再次，如果经检查确认是非洲猪瘟疫情，当地有关部门会统一进行处置。需要对病猪进行处理时，也会按照相关规定要求给予补偿，将养殖户的损失降到最低。在确认疫情前，千万不要去随意的处置死亡的生猪，更不要私自掩埋处理，非洲猪瘟是一种高热急性传染病，被感染后死亡率可以达到百分之百，一旦感染任何的处置办法都是徒劳的。所以不要产生任何的其他想法，避免触犯相关的法律，而对自身和他人引起不必要有损失。
最后，现在的网络四通八达，在疫情未被确认前，不要私自告诉他人自己的确定位置，个人信息要严格保密。如果确定疫情有关部门会进行及时通报，避免被不法分子进行操作，引起他人不必要的恐慌。这个问题的确需要大家知晓，非洲猪瘟疫情在我国防控压力还是很大的，只有早发现、早上报、早扑杀、是目前行之有效的办法，最后还是不希望大家养殖场，有任何异常！提醒大家做好养殖场的生物安全才是根本！

9. DG55155Tl设置方法

团体标准T/CVMA 5—2018
非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法
Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus
中国兽医协会发布
前言
本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由中国兽医协会提出并归口。
本标准起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、北京海关。
本标准主要起草人： 倪建强、王传彬、王琴、仇华吉、殷宏、杨林、辛盛鹏、刘艳华、刘洋、宋晓晖、赵启祖、罗玉子、刘志杰、张乾义、乔彩霞、夏应菊、杨吉飞、徐璐、顾小雪、亢文华、李硕、毕一鸣。
1、范围
本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。
本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。
2、规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3、试剂
3.1 DNA提取试剂
DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。
3.2 2 × PCR缓冲液
2 × PCR缓冲液的配制见附录A。
3.3 引物探针
3.3.1 采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：
上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'
下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'
荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB--3'
3.3.2 可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：
上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'
下游引物ASF-OIE-rPCRR：
5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'
荧光探针ASF-OIE-Probe：
5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'
3.3.3 使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。
3.4 阴性及阳性对照
阴性及阳性对照的制备方法见附录C。
3.5 其他试剂
消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、无菌无核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。
消毒液配制见附录A， 0.01mol/L PBS配制见附录A。
4、仪器和耗材
分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12 000r/min）、冰盒、实时荧光PCR仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL）、1.5mL离心管（无核酸酶）。
5、操作步骤
5.1 样品采集及运输
样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。
5.2 样品处理
检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取0.1g～0.2g组织或血粉，经研磨破碎后加1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）制成匀浆，经12 000 r/min离心2Min取上清；全血、血清样品直接取1mL，置于1.5 mL离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。
5.3 样品保存
采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。
5.4 病毒DNA提取
5.4.1 DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒DNA提取试剂，则按照试剂说明书操作。
5.4.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5 mL离心管，逐管编号。
5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，1份样品换用1个吸头，混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，13 000 r/min离心10 min。DNA提取液1见附录A。
5.4.4 尽可能吸取上清、弃去，吸头不要碰到沉淀，再加入10 μL DNA提取液2，混匀器上震荡混匀5 s。于4℃～25℃条件下，2 000 r/min离心10s。DNA提取液2见附录A。
5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。
5.4.6 加入90μL无DNA酶的灭菌去离子水，13 000 r/min离心10 min，上清即为提取的DNA，-20℃保存备用。无DNA酶的灭菌去离子水见附录A。
5.5 实时荧光PCR操作
5.5.1 在反应混合物配制区、样品制备区和检测区分别进行5.5.2～5.5.4。
5.5.2 每个检测反应体系需使用20μL实时荧光PCR反应液。根据5.4.2中设定的n值，按附录D配制反应液，充分混匀后分装，每个PCR反应管20μL。转移PCR反应管至 样品制备区 。
5.5.3 在上述5.5.2的反应管中分别加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管总体积达到25 μL，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。
5.5.4 将5.5.3加样后的反应管放入实时荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定5-羧基荧光素（FAM）作为报告基团，小沟结合物（MGB）为淬灭基团，反应参数设置如下： 预变性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45个循环； 在每次循环的60℃退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的Ct值和荧光曲线判定结果。
6、结果判定
6.1 结果分析条件设定
实时荧光PCR检测阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数即为Ct值。
6.2 结果描述及判定
当阳性对照Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值无扩增曲线时，实验成立，实例参考附录E。 当被检样品出现典型的扩增曲线且Ct值≤38.0时，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性 ； 被检样品无Ct值，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；对于Ct值＞38.0的样品且出现典型的扩增曲线，应重检，重检仍出现上述结果的判为阳性，否则判为阴性。
7、实验室生物安全要求
7.1 本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在（动物）生物安全三级试验室中进行，实验室生物安全管理要求见GB 19489。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定执行。
7.2 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。
一
附录 A (规范性附录) 试剂的配制
A.1 DNA提取液1
PEG8000晶体20.74g，NaCL17.53g，加去离子水定容到100 mL。
A.2 DNA提取液2
1mol/LTris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去离子水定容到100 mL。
即KCL14.912g，Tris碱12.114g，1.2068 mL浓HCl，EDTA14.612g，NaOH 6g, 加去离子水定容到100 mL。
A.3 2×PCR缓冲液
灭菌去离子水 70 mL
三羟甲基氨基甲烷（Tri s） 0.79 g
氯化钾 1.865 g
曲拉通X-100 0.5 mL
dATP (100mmol/L) 2.5 mL
dTTP (100mmol/L) 2.5 mL
dGTP (100mmol/L) 2.5 mL
dCTP (100mmol/L) 2.5 mL
六水氯化镁 0.61 g
盐酸 调pH至9.0
灭菌去离子水 加至100 mL
A.4 消毒液
8‰氢氧化钠或3‰福尔马林或3%邻苯基苯酚或碘化合物等其他消毒试剂均可。
A.5 磷酸盐缓冲液（PBS）的配方
A.5.1 A液
0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6 g，溶于蒸馏水中，最后定容至1 000 mL。
A.5.2 B液
0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6 g（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g），加蒸馏水溶解，最后定容至1 000 mL。
A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制
取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。经过滤除菌后，无菌条件下分装。
A.6 无DNA酶的灭菌去离子水
无DNA酶的灭菌去离子水是用1 %DEPC处理后的去离子水，电阻应该大于18.2mΩ。
二
附录B （资料性附录）非洲猪瘟病毒VP72基因参考序列
1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA
61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT
121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT
181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT
241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT
301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT
361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC
421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT
481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC
541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA
601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA
661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT
721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT
781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT
841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC
901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT
961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC
1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG
1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT
1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA
1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC
1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA
1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA
1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT
1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC
1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA
1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT
1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT
1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG
1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA
1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG
1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT
三
附录C （规范性附录）非洲猪瘟病毒核酸阳性及阴性对照
C.1阳性对照
阳性对照制备方法：人工合成非洲猪瘟病毒VP72基因片段，序列参见附录B，将VP72基因连接于pMD20-T载体制成阳性质粒pMD20-T-VP72，使用非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液将质粒稀释至浓度为10 000copies/L，保存于-20℃备用。
C.2 阴性对照
阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。
四
附录D （规范性附录）实时荧光PCR反应液配方
实时荧光PCR反应液配方见表D.1。
表D.1 实时荧光PCR反应液配方
组 分
1个检测体系的加入量
2×PCR 缓冲液a
12.5μL
dNTP（2.5 mmol/L）
1.0 μL
上游引物（10 μmol/L）
1.0 μL
下游引物（10 μmol/L）
1.0μL
探针（10 μmol/L）
1.0 μL
Taq 酶b（5U/μL）
0.5μL
去离子水
3μL
总体积
20μL
2×PCR 缓冲液a: 参见附录A.1配方。
Taq 酶b：具有5’→3’外切活性。
五
附录 E （资料性附录）非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例参考
图D.1给出了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例。
图E.1 非洲猪瘟病毒核酸实时荧光PCR典型扩增曲线示意图
(资料来源：中国兽医协会）

10. 非洲猪瘟检测方法是什么

1、红细胞吸附试验：将健康猪的白细胞加上非洲猪瘟猪的血液或组织提取物，37℃培养，如见许多红细胞吸附在白细胞上，形成玫瑰花状或桑椹体状，则为阳性。

2、直接免疫荧光试验：荧光显微镜下观察，如见细胞浆内有明亮荧光团，则为阳性。

3、动物接种试验。

4、间接免疫荧光试验：将非洲猪瘟病毒接种在长满Vero细胞的盖玻片上，并准备未接种病毒的Vero细胞对照。试验后，对照正常，待检样品在细胞浆内出现明亮的荧光团核荧光细点可被判定为阳性。

5、酶联免疫吸附试验：对照成立时（阳性血清对照吸收值大于0.3，阴性血清吸收值小于0.1），待检样品的吸收值大于0.3时，判定为阳性。

6、免疫电泳试验：抗原于待检血清间出现白色沉淀线者可判定为阳性。

7、间接酶联免疫蚀斑试验：肉眼观察，或显微镜下观察，蚀斑呈棕色则为阳性，无色则为阴性。

(10)雅睿生物非洲猪瘟检测器使用方法扩展阅读

非洲猪瘟急性病例临床症状以高热、病程短、死亡率高、内脏器官广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能紊乱为主要特征。

在无本病的国家和地区应防止ASFV的传入，在国际机场和港口，从飞机和船舶来的食物废料均应焚毁。对无本病地区事先建立快速诊断方法和制定一旦发生本病时的扑灭计划。