细菌营养缺陷的检测方法

Ⅰ 筛选营养缺陷型细菌的基本步骤和方法及其原理

营养缺陷型是指某菌株经突变后，丧失了合成某营养素的功能，若在培养基上培养必须添加相应的营养素才能生长。用加有青霉素的培养基来选择细菌的营养缺陷型的一种方法。也就是由于青霉素是细菌细胞壁的合成抑制剂，利用其可杀死正在繁殖的细菌的性质，对所有青霉素敏感菌的一种方便的选择法。
例如将细菌先在完全培养基中培养24小时，离心分离菌体，即用生理盐水（0.85％—0.95％NaCl溶液）反复离心洗涤2—3次，然后在加有青霉素（100—300单位/立升）的基本培养基中于最适温度中培养24小时。
这时不是营养缺陷型的原来野生型细胞会因不断分裂而被青霉素所杀死。然后将菌悬液放在完全琼脂培养基进行平面培养，在平面上长出来的菌落大多为营养缺陷型。通过与影印法并用，可高效率地分离到变异菌株。
筛选营养缺陷型菌株般步骤和方法①诱变 ②淘汰野生型③检出缺陷型④鉴定营养缺陷型——生长谱法

Ⅱ 怎样筛选营养缺陷型菌株

一.筛选营养缺陷型菌株的一般步骤和方法
①诱变 常用紫外线等物理方法和化学诱变剂等诱变形成大量营养缺陷型菌株。用15W或20W紫外灯管，距离15cm～30cm，照射10sec～20min。在照射受试菌前，灯管须预热20min，使灯光稳定。菌悬液要磁力搅拌，使所有单细胞或单孢子均匀受到照射。特别要注意，应在黑暗或红外光下操作，接种后器皿用黑布包严，防止发生可见光的修复作用。
②淘汰野生型
a）抗生素法 某些抗生素能杀死生长繁殖着的微生物，而对处于休止状态的微生物无杀伤作用。如青霉素能抑制细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，制霉菌素可损伤真菌细胞膜，二者可分别杀死生长繁殖着的细菌、真菌。
b）菌丝过滤法 适用于放线菌、霉菌等丝状微生物。在基本培养基中野生型孢子能萌发长成菌丝体，而营养缺陷型孢子则不生长。将经诱变处理的孢子接种于液态基本培养基中，振荡培养10h～12h，使原养型萌发（以肉眼刚能看见菌丝为度），然后以滤纸、棉花或玻璃过滤漏斗过滤，菌丝被滤除，未萌发的缺陷型孢子能顺利通过，从而达到富集营养缺陷型的目的。
③检出缺陷型的常用方法
a）逐个测定法（点种法）把经诱变处理并淘汰野生型后的菌液在完全培养基上涂布分离，将培养后长出的每一个菌落分别点种在基本培养基和另一个完全培养基上，凡在基本培养基上不能生长而在完全培养基的相应位置上能生长的菌落，表明其为营养缺陷型。
b）夹层培养法经诱变处理后的菌液，稀释后与基本培养基混匀并倾入平皿中，待凝固后，再加上一薄层不含菌的基本培养基。培养后在皿底将长出的菌落做上标记。然后加上一层完全培养基，再经培养后，新出现的菌落多数是营养缺陷型（图3－31）。此法适用于兼性厌氧的细菌。
C）影印法 将丝绒包在直径小于平皿的圆柱台上，固定，作为影印接种工具，灭菌备用。将经诱变处理并淘汰野生型的菌液涂布于完全培养基表面上，培养，待长出菌落后，用影印接种工具在此平板上轻按一下，然后在另一基本培养基平板上按一下。经培养后在基本培养基上不长而在完全培养基的相应部位上生长的菌落，为营养缺陷型。
④鉴定营养缺陷型——生长谱法 将检出的缺陷型菌株接种在完全培养基上培养，把生长的菌体或孢子洗下，离心清洗后制成浓度为107个／ml～108个／ml的菌悬液。取0.1ml该悬液与基本培养基混匀倒皿，冷凝并稍干燥后，分区加沾有各种营养物的圆滤纸片，培养，观察生长反应。
在筛选营养缺陷型的过程中必须注意表型延迟现象。由于诱变剂一般仅作用于DNA的某一单链，故突变无法反映在当代的表型上，需经DNA复制和细胞分裂后，才使表型发生变异，此即表型延迟现象。
二.富集和分离抗生素敏感菌的营养缺陷型突变株的抗生素法 将抗生素加入原养型培养基（即培养基中缺少营养缺陷型所需的养分）中，能杀死生长中的野生型细胞，而不能生长的突变株得以幸免。
抗生素敏感菌营养缺陷型菌株的筛选过程①菌悬液诱变处理。②死的和活的野生型细胞及一些活的前突变细胞的混合液在C．M．中培养，使已发生营养缺陷突变的细胞的缺陷表型得以充分表现。若无这一阶段的培养，则许多细胞的基因型虽已改变，但表型仍和野生型一样，这些突变细胞在以后接触抗生素时也将被杀死。③在无氮培养液中培养，使营养缺陷型菌株细胞内所含养料尽量消耗，以便停止其生长繁殖。④在含抗生素的M．M．中培养，杀死能生长的野生型菌株。⑤检出缺陷型。⑥鉴定缺陷型.
三.营养缺陷型在科研和生产实践中的应用在科学研究中，营养缺陷型既可作为研究代谢途径和杂交、转化、转导、原生质体融合等遗传规律所必不可少的标记菌种，也可作为氨基酸、维生素或碱基等生物测定的试验菌种。在生产实践中，营养缺陷型可作为菌种杂交、重组育种和构建工程菌时所不可缺少的带有特定基因标记的亲本菌株，它们还常被用作生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株。由于营养缺陷型在代谢途径中某一步骤发生缺陷，致使终产物不能积累，从而遗传性地解除反馈抑制，使中间代谢产物或另一分支途径的末端产物得以积累。
例如，用高丝氨酸营养缺陷型作为赖氨酸的生产菌株，由于该突变株的遗传性，解除了赖氨酸与苏氨酸的协同反馈抑制，因此，在培养系统中限量补充苏氨酸，就可使天冬氨酸半醛全部向赖氨酸方向转化，赖氨酸产量大大提高。

Ⅲ 归纳概括细菌检验方法

10种常用的细菌检测方法

一、[3H]脱氧胸苷摄入法测定细胞数：
1、用RPMI-1640培养液洗涤对数生长期（培养3天）的CTLL-2细胞两次，每次250×g离心10分钟，洗去培养液中残存的IL-2。
2、用台盼蓝（1% Trypan blue）染色法计数细胞并决定细胞的活力，用10%小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞至1×105/ml。
3、在96孔细胞培养板中每孔加0.1ml倍比稀释的标准IL-2或待测样品，每个稀释度三个复孔，标准IL-2从40 IU/ml稀释到0.019 IU/ml（8～10个稀释度），阴性对照孔不加IL-2。
4、每孔加0.1ml细胞悬液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养18～24小时。每孔加10μl（0.5μCi或1.85×104Bq）[3H]脱氧胸苷，继续培养4小时。
5、用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用3%醋酸水溶液滤纸3次，洗去游离的[3H]TdR。将滤纸置液体闪烁瓶中，加入5ml闪烁液。在液体闪烁仪上计数细胞摄入的同位素活性（每分钟放射性计数，cpm），根据仪器效率换算成dpm（每分钟衰变数）。
6、用dpm值对样品稀释倍数作图。在图上，标准IL-2的曲线与待测样品的曲线应当呈平行的S型，说明是同样的分子反应。比较同样dpm处的不同稀释倍数，决定待测样品的相应浓度。
二、MTT检测法：
1、取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时让细胞帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步）
2、用RPMI-1640培养液2～10倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况2～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个：3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔，每孔加0.1ml RPMI-1640培养液。在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24～48小时或预定的时间。
3、吸去培养液，用PBS洗涤一次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心培养板）。
4、每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4～6小时。
5、每孔加0.1ml酸化异丙醇，也可用含10% SDS的10mmol/L HCl代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长570nm，参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。
三、XTT检测法：
用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤，XTT可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物（formazan）。代谢产物在OD450处有吸收峰。
四、MTS检测法：
1、培养IL-2依赖细胞株CTLL-2细胞或HT-2细胞（检测IL-2），或者IL-3依赖细胞株FDC-P1细胞或FL5.12细胞（检测IL-3）到对数生长期。
2、取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml含1×104～2×104上述细胞之一的DMEM培养液（加10%小牛血清）。
3、每孔加0.1ml系列稀释的待测细胞因子（IL-2或IL-3）样品或细胞因子标准品，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。
4、每孔加20μl MTS/PMS混合液，继续培养3～4小时显色。
5、检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。在酶联检测仪上，波长570nm（或490nm，或570nm和690nm）处检测各孔的光吸收值（OD）。用样品稀释度对OD值（OD570、OD490或OD570/OD690）绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算样品中细胞因子的量。
五、NAG检测法：
1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。
2、吸去培养液，用PBS洗涤两次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前先离心）。
3、每孔加60μl NAG染液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。
4、每孔加90μl终止液，混匀后置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长402nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。
六、AlamarBlueTM摄入法：
1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。
2、在培养结束前24小时加入Alamar Blue染料，96孔细胞培养板每孔20μl。
3、在培养结束后，直接在酶联检测仪上测定光吸收值。氧化型Alamar Blue的最大光吸收在570nm，用OD570减去OD600即为活细胞还原的Alamar Blue染料，颜色深浅与活细胞数成正比。
七、碱性磷酸酶检测法（AKP法）：
1、按MTT法用细胞因子处理靶细胞适当时间，用PBS洗去死亡细胞，洗两次。
2、向96孔细胞培养板各孔中加0.2ml新鲜配制的底物液（0.2mol/L 硼酸，1mmol/L MgCl2，1.2mmol/L甲伞基磷酸）。在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养3小时。
3、在荧光计数仪上测定荧光的量。根据测定已知不同数目细胞的荧光量作出标准曲线，根据标准曲线可得到各孔中的活细胞数。
八、三磷酸腺苷检测法（ATP法）：
1、ATP反应液（Bio-Orbit）是粉末状混合物，含有荧光素、荧光素酶、0.5mmol醋酸镁、50mg BSA和0.1μmol无机焦磷酸。在4℃可以保存1个月。用前用10ml含2mmol/L EDTA的0.1mol/L pH7.75 Tris-醋酸缓冲液稀释。稀释液分装后可在－20℃长期保存。
2、在已经完成促增殖或抑生长试验后的96孔细胞培养板中（每孔含100μL细胞培养液），每孔加0.1ml ATP释放因子，室温中反应5分钟。取另一块96孔细胞培养板，从第一块板的各孔中吸0.1ml细胞溶解物到第二块板的相应各孔。
3、在低于25℃中，将第二块板置自动多孔荧光检测仪中。用自动加样器，每孔加入20μl ATP反应液，立即检测10秒钟的荧光强度。温度升高，检测敏感性就下降。
4、用RLU（Y轴）对细胞因子标准品的稀释度（X轴）作标准曲线，根据标准曲线确定待测样品中细胞因子的含量。
九、染料染色法测定细胞数：
1）结晶紫检测法：
1、在96孔细胞培养板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），37℃ 5% CO2的二氧化碳培养箱中培养2～3小时，让细胞帖壁。
2、用RPMI-1640培养液10倍递次稀释TNF标准品，根据需要3～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品或待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个，3个阳性对照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔各加100μl RPMI-1640培养液。继续培养18～24小时。
3、甩去培养液，用PBS小心洗涤一次，每孔加0.1ml 10%甲醇溶液固定细胞30秒钟。
4、吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml结晶紫染液，室温中放置20分钟。
5、轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室温中长期保存。
6、测定前，每孔加0.1ml 33%醋酸脱色，充分振荡后在570nm处测定光吸收度。用光吸收度（OD）值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性
2）NBB检测法：
1、在用细胞因子处理靶细胞以后倾去培养液，倒置培养板于吸水纸上吸干培养液。再用100μl磷酸缓冲盐水小心洗去死细胞，用吸水纸吸干培养液。
2、每孔加100μl NBB染液，室温中染色30分钟。轻轻染液。用吸水纸吸干染液。</P< p>
3、每孔加100μl福尔马林固定液固定15分钟。用自来水轻轻洗去固定液，倒置培养板，用吸水纸吸干染液。
4、每孔加150μl 50mmol/L氢氧化钠。轻轻振荡培养板直到染料全部溶解并均匀分布。在分光光度计上读取各孔在620nm处的光密度（OD）值。计算TNF的活性。
3）美蓝染色检测法：
1、用细胞因子处理靶细胞，在含100μL细胞培养液的检测孔中，每孔加0.02ml 25%戊二醛固定活细胞15分钟，用自来水缓缓洗去死细胞和固定液。
2、每孔加0.1ml 0.05%美蓝染液，染色20分钟，用自来水缓缓冲净染液，晾干。
3、每孔加0.2ml 0.33mol/L盐酸溶解美蓝，振荡混匀。在665nm波长处测定光吸收度。计算TNF的活性。
4）中性红染色检测法：
1、用细胞因子处理靶细胞，在含100μL细胞培养液的检测孔中，每孔加50μl 5%中性红染液。继续培养2小时。
2、小心倒去培养液。用200μl Hanks液洗涤细胞1次。小心倒去培养液，减少细胞丢失。
3、每孔加100μl脱色液，在摇床中轻轻摇晃溶解30分钟。在550nm波长处测定OD值。
十、直接计数细胞：
1、如果靶细胞是帖壁细胞，在细胞因子作用适当时间后，用生理盐水洗去死亡细胞，用0.25%胰蛋白酶液消化细胞。加适量生理盐水吹打，使细胞分散成单个细胞。直接在血细胞计数板上计数细胞。
2、如果靶细胞是悬浮细胞，则需要用染色剂区分死细胞和活细胞然后再计数。通常用台盼蓝染色细胞，活细胞可以排除进入细胞的台盼蓝而不着染，死细胞着染呈深蓝色。
3、计数血细胞计数板上4个大方格中的全部活细胞，按下式计算活细胞数：活细胞数（个/ml）＝计数的全部活细胞数×10 000×2×1/4。

Ⅳ 如何用营养缺陷型微生物检测出环境中的“三致”化学物质

艾姆氏试验是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在“三致”物质的简便有效的方法。在含待测可疑“三致”物质例如黄曲霉素，二甲氨基偶氮苯等的试样中加入鼠肝匀浆液，经一段时间保温后吸入滤纸片中然后将滤纸片放置于上述平板中央，经培养后出现了三种情况：①在平板上无大量菌落产生，说明试样中不含诱变剂②在纸片周围有一个抑制圈，其外周出现大量菌落，说明试样中有某种高浓度的诱变剂存在③在纸片周围长有大量菌落，说明试样中有浓度适中的诱变剂存在

Ⅳ 病原微生物中细菌常见检测方法有哪些

1、快速测试片技术法

快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法。

细菌总数检测纸片的研制始于 20 世纪 80 年代，其主要优点是简便、实用、经济、操作性强。近年来以滤纸和美国某公司的 Petrifilm 为载体的测试片已开始被广泛应用。

2、生物电化学方法

生物电化学方法是指通过电极测定微生物产生或消耗的电荷，从而提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电化学性质如电流、电位、电阻和电导等会发生变化，所以可以通过检测分析这些电化学参量的变化来实现对微生物的快速测定。

常见的有：阻抗分析法、电位分析法、电流分析法等。生物电化学方法具有测量快速、直观、操作简单、测量设备成本低和信号的可控性等特点。

3、微菌落技术

微菌落是指细菌生长繁殖早期在固相载体上所形成的只能借助于显微镜观察的微小菌落。微菌落技术具有快速、经济、实用的特点，其研究始于 20 世纪50年代，定量测定技术从 20 世纪 70 年代开始，国外已有报道将该法应用于水、食品中细菌总数的快速检测。

4、气相色谱法

气相色谱应用到微生物的检测中，主要是依据不同微生物的化学组成或其产生的代谢产物各异，利用上述色谱检测可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

5、高效液相色谱法

利用高效液相色谱检测可分析各种体液中的细菌代谢产物、病原微生物等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

Ⅵ 什么是营养缺陷型细菌

1. 无法合成某种生物必需的物质，通常是酶或氨基酸

2. 需要在富含这种物质的培养基中才能存活
   

3. 可以用来挑选一些突变型菌落