如何设计引物扩增的方法

1. 如何设计引物

一般是通过设计软件，例如oligo6，primer5等，你可以在网上搜一下引物设计软件下载和使用说明，是比较容易的。
至于设计引物的一般原则如下：
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序列选取应在基因的保守区段
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避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构
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典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
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Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
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引物之间的TM相差避免超过2℃
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引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基
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为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
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Taqman探针PCR要求片段长度在80bp－150bp
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引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

2. pcr的技术的主要步骤及pcr引物设计的一般原则有哪些

PCR的技术的主要步骤及PCR引物设计的一般原则分述如下：

PCR的技术的主要步骤：

1、DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

2、退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

2、引物设计的基本原则

1、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

3、引物内部不应出现互补序列。

4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

6、引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

7、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

(2)如何设计引物扩增的方法扩展阅读

PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。

在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR技术常与其他技术结合起来使用， 如RT-PCR、竞争PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。

第一代PCR就是常见的定性PCR技术，它采用普通PCR仪来对靶基因进行扩增，采用琼脂糖凝胶电泳来对产物进行分析。第二代PCR就是荧光定量PCR技术（Real-Time PCR，qPCR），它通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测扩增产物的积累，借助荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。

第三代PCR技术--数字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一种全新的对核酸进行检测和定量的方法。它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。

PCR芯片技术PCR仪器发展的趋势之一变得更加微型化，PCR芯片就是在这种趋势下诞生的。PCR芯片就是在微型的载体上进行PCR反应，是微型化的PCR仪。芯片PCR不仅节省了大量反应试剂因此降低了实验成本，还有助于提高反应速度。

3. 若给一指定DNA序列并需要通过PCR扩增此序列,如何设计扩增引物

你要分别得到这条序列的上下游的序列，然后再上下游区设计引物，如果片段过大还需要设计中间引物

4. 怎么设计扩全长的引物

您应该使用巢式PCR来做这个实验。

无论您是先提RNA再做反转录，还是直接从DNA中获得基因，考虑到模板的复杂性，都应当使用巢式PCR。建议您先从目的基因的上下游设计一段引物，即外引物，再根据目的基因上下游设计一段内引物。

外引物不在目的基因上，可以在目的基因上下游100bp以内，这就可以利用引物设计找出最优秀的引物，提高了第一次PCR的成功率。将第一次PCR产物做模板，进行第二次PCR，这样如果P出了大小正确的条带，就可以肯定是你的目的条带。因为两次特异性扩增再加上大小正确，这样的总特异性是极高的。

另外，由于在第二次PCR过程中，模板是第一次PCR产物，成分单一，就是内引物再糟糕，也没有问题，这就规避了你提到的“那如果在CDS区两端设计不出引物怎么办？”这个问题。

您明白了吗？欢迎追问！

5. 要扩增全长cDNA 引物怎样设计

其实要看你的目的，如果你是要扩增基因组的基因的话，那你就去ncbi－genome上面找到你要研究的那段基因，如果基因不太长1kbp以内的话，那就可以直接选取两头约20bp的片段设计互补引物。如果基因太长了，那就设计多段引物，一段一段把基因pcr出来再连在一起。如果你要扩增的是cDNA的话，也就是蛋白质的cDNA序列的话，就去ncbi－gene里面找到相应蛋白质的序列，再设计引物，以cDNA文库位模版把目标基因给pcr出来。

6. 实时荧光定量pcr引物怎么设计

1、查找该物种或近缘物种信息，看是否能确定内含子序列的位置，在CDS上设计跨内含子的引物，以避免基因组污染；
2、扩增片段大小最好在200bp左右，太大会影响扩增效率；
3、最好一次分别设计两条上游（距离较近）和下游引物（距离较近），组合成4个扩增片段；
4、用任何方法或软件设计好的引用都要用少量cDNA样本来验证引物扩增效果：主要是有无二聚体？有无非特异性扩增？
5、筛选出一对最满意的引物上机，祝你实验顺利。

7. 如果要使用PCR扩增一段已知的DNA序列,要如何设计引物

把这段基因输入设计软件里，调节引物位置，使变性温度在94度，退火温度=Tm-（5到10度） 延伸温度72度左右，满足这些条件基本就可以了，当然还要根据实际情况多次实验得到最佳引物。如果你要扩增整个的基因，引物必须要在起始密码子之前，或包含起始密码子。最后加上酶切位点就可以了。

8. 怎样设计PCR引物

引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。
设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理：
① 引物长度
一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。
在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。

引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

② GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。

③ 退火温度
退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火
温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。

④ 避免扩增模板的二级结构区域
选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增
的成功是有帮助的。

⑤ 与靶DNA的错配
当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。

9. pcr如何设计引物如何进行扩增

若是根据已知序列扩增未知物种的相应序列，可以根据先根据已知序列进行blast搜索，发现其他同源序列，保存后进行比对，找出其中较保守区域，并根据primer或oligo等软件对某条序列进行分析，搜索其中适合做引物的片段，并人工修正不合适部分。也可以设计成兼并引物。
如果已经获得序列，只是需要设计引物将其中某段扩增出来，相对就简单些了，可以直接用上述软件进行设计就可以了。
当然，实际操作起来还要看运气啦。------更多交流，中国西部生命科学论坛

10. 如何设计引物，扩增目的基因的ORF

如何设计引物，扩增目的基因的ORF
无论您是先提RNA再做反转录,还是直接从DNA中获得基因,考虑到模板的复杂性,都应当使用巢式PCR.建议您先从目的基因的上下游设计一段引物,即外引物,再根据目的基因上下游设计一段内引物.
外引物不在目的基因上,可以在目的基因上下游100bp以内,这就可以利用引物设计软件找出最优秀的引物,提高了第一次PCR的成功率.将第一次PCR产物做模板,进行第二次PCR,这样如果P出了大小正确的条带,就可以肯定是你的目的条带.因为两次特异性扩增再加上大小正确,这样的总特异性是极高的.
另外,由于在第二次PCR过程中,模板是第一次PCR产物,成分单一,就是内引物再糟糕,也没有问题,这就规避了你提到的“那如果在CDS区两端设计不出引物怎么办?”这个问题.