内参基因 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。 在进行基因研究的过程中,实时反转录 PCR也和传统的mRNA定量方法如 Northern b lot技术等一样, 要求使用参照基因以校正转录效率和 cDNA用量, 弥补制备过程中样本纯度和浓度的差别, 使不同样本之间目的基因的比较成为可能,以期获得真实可靠的结果。大多数分析方法中这些差别可通过与内参照比较处理消除。最普通的内参照是内源性参照基因,也叫管家基因。 管家基因：又称持家基因(house-keeping genes)生物体各类细胞中都表达，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的蛋白质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。是 为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的基因。 管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。 管家基因高度保守并且在大多数情况下持续表达，因此管家基因常被用于分子技术--多位点基因分析。 内参基因通常是各种看家基因，在细胞内组成稳定性表达，有助于保持细胞的功能。理想的内参基因应该满足以下条件：1, 不存在假基因（Pseudogene），以避免基因 DNA的扩增； 2,高度或中度表达，排除低表达； 3,稳定表达于不同类型的细胞和组织（如正常细胞和癌细胞），而且其表达量是近似的，无显着性差别； 4,表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；5, 其稳定的表达水平与目标基因相似；6, 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响
⑵ 两个内参基因怎么数据分析，real time PCR
分别分析，看趋势是否是一样的，更科学
⑶ 最新最好用geNorm、normfinder、bestkeeper 内参基因软件使用方法
实时荧光定量PCR（RT-qPCR）由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点，已经成为研究基因表达分析的常用方法[1-2]。实时荧光定量PCR分为绝对定量和相对定量，在进行相对定量分析时不需要已知量的标准品，因而该方法被经常运用，但该方法需要用内参基因对目的基因进行数据校正，才能获得精确的结果[3-4]。
肌动蛋白基因（ACT）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPD H）、18S rRNA、转录延伸因子基因（EF-1α）、多聚泛素酶基因（UBQ）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）等看家基因在之前的研究中常常被当作内参基因进行使用[5-8]。然而，越来越多的研究表明，在某种试验稳定表达的内参基因，在另一种试验中有可能是变化的[9-11]，而在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在[12-13]。如果仅仅根据文献报道使用某个常用的内参基因，不仅可能导致试验结果的不准确性，甚至可能导致结论的错误。因此，本着严谨的科学态度，科研工作者首先必须从众多的内参基因中筛选出在各自试验条件下较为稳定的内参基因。
geNorm、NormFinder和BestKeeper是专门用于筛选内参基因稳定性的软件，但这3种软件的使用方法和分析的侧重点各不一样，为了让相关科研人员快速了解并掌握这3种软件的使用方法，笔者结合自身使用这些软件的经历，详细介绍了这3种软件的使用要点，以期为相关科研人员分析内参基因稳定性提供便利。
1geNorm软件
1.1软件概述
geNorm软件是Vandesompele等[14]在2002年编写的专门用于实时荧光定量PCR中筛选内参基因及确定最适内参基因数目的程序，该程序可以用于筛选任何试验的任意数目的内参基因，并最终挑选出2个或2个以上的内参基因组合来校正数据，可使相对定量的结果更为精确。geNorm 程序通过计算出每个内参基因稳定性的M值来筛选出稳定性较好的内参基因，判定标准为M值越小内参基因稳定性越好，反之，则稳定性越差。该软件还可计算引入1个新的内参基因后标准化因子的配对变异V值，并根据V n/V n+1值来确定所需最适内参基因的数目。默认的V值为0.15（该值可以人为稍作调整），如果V n/V n+1值<0.15，则最适内参基因的数量是n个；而如果V n/V n+1值>0.15，则最适内参基因的数量是n+1个。
1.2操作流程
1.2.1修改Excel表格安全性级别。若geNorm软件打开后不能正常运行时，可能是由于Excel表格默认宏的安全性级别设置的比较高，这时需要将Excel表格安全性级别更改到最低级别。更改方法为点击Excel表格中的“工具”按钮，然后点击其下拉菜单“宏”的子菜单“安全性”选项，在弹出来的“安全性”对话框中将安全级别设置为最低。
1.2.2计算△Ct值。先找到该基因在所有样品中最小的Ct （Cycle threshold）值（表达量最高），再用其他样品的Ct值减
利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行内参基因稳定性
分析的方法
吴建阳1何冰1杜玉洁1李伟才2魏永赞2*
（1岭南师范学院基础教育学院，广东湛江524037；2农业部热带果树生物学重点实验室，中国热带农业科学院南亚热带作物研究所）摘要实时荧光定量PCR（RT-qPCR）由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点，已经成为研究基因表达分析的常用方
法，但其结果的准确性取决于内参基因。在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在，科研工作者为了获得精准的试验结果，首先必须从众多的内参基因中筛选出稳定的内参基因。geNorm、NormFinder和BestKeeper等是专门用于筛选稳定性内参基因的软件，但这3种软件使用方法差异很大，为了让更多的科研人员了解这些软件、节省时间，笔者结合自己的科研经验详细介绍了这3种软件的使用方法，以期为相关科研人员利用这些软件筛选内参基因提供便利。
关键词内参基因；稳定性分析；geNorm；NormFinder；BestKeeper
中图分类号S60文献标识码A文章编号1007-5739（2017）05-0278-04
⑷ 请问PCR扩增一个目的基因和内参同时跑标准曲线,怎么分析结果。。。谢谢
那么怎么平衡扩增效率呢？
相对定量有两种方法。要求扩增效率相同的是ΔΔCt法，因为只有扩增效率相同目的基因与内参基因的Ct值之差才是恒定的值，这是
⑸ 常用的内参基因及其使用范围请大家推荐生物方面的论坛
内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物 你可以去生物帮那里了解这方面的信息，那儿技术文档、视频资源丰富，我很喜欢到那里找想要的东西，而且还有很多软件可以下载，并且有软件的教材。有时间可以去看看。 包括GAPDH 、β- actin(BETA-actin) 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因 等。 在血清刺激条件下的基因表达定量研究中, B 22MG 和 18SrRNA 作为内参基因是合适的, 而 B 2act in 和GAP 2DH 则不适合。 大鼠是常用实验动物, 老年大鼠在阿尔茨海默症等模型研究中常用。我们针对老年大鼠组织实时老年大鼠肾组织中相对表达最稳定的管家基因是ACTB; 心脏和肺组织中表达最稳定的内参基因是G3pd 内参基因sdha和hprt1适合用于校正目标基因的表达量，为研究幼龄小鼠小肠组织基因表达奠定基础。 可以参考： Click here, Sign in your account www.bio1000.com/zt/dna/225764.html .hope that i can help you 对于枣树基因表达研究的内参基因,组蛋白 ZH j 3基因在不同器官、 不同生长时 期的结果枝及其顶端组织中有表达, 表达最稳定,最适宜用于枣树基因表达研究的内参基因。 HSV感染下用作标化内参基因排序 其研究发现，在应用 pcDNA3.1 载体进行表达研究时，相比之下 GAPDH 作为内参效果更好更为适合和稳定 RT-PCR方法，检测乳腺肿瘤及其邻近乳腺组织中的IL-8mRNA及内参GAPDH的表达水平知乳腺癌组织 高表达IL-8,可作为评价乳腺癌进展 及判断预后 的指标 H MBS 和 C- TBP两个看家基因适用于校正目标基因的表达量,为研究男性乙肝相关肝癌组织中目标基因的表达奠定基础 实时反转录 PCR研究应使用至少两个内参基因以确保结论可靠: 其一可以是某种核糖体 RNA(例如 18S r RNA), 用来对 RNA总量和转录步骤中可能发生的降解进行必要校正; 第二个内参基因应和目的基因 mRNA表达水平接近。Arb p 细胞丰度相对最低、 表达相对最稳定且在不同组织间差异最小,相对较适用于老年大鼠组织间 mRNA表达变化分析。
⑹ 双荧光素酶报告基因实验怎么转染目的和内参两种质粒
（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。
⑺ 核酸检测内参基因是什么
这个概念一般是用在定量pcr中。定量pcr是要检测某个基因的表达，降低或者提高，但是当你得出结果以后，你并不知道是它本身的表达降低/提高了，还是你操作过程中造成的误差（比如提rna时的损失），所以这个时候需要同时检测另外的基因作为参照。这个基因就是内参基因，这类基因是生物体或者细胞中稳定表达的基因，表达量几乎不变。常用的内参基因如β-actin，gapdh，18s-rrna等。仅供参考！
⑻ 有两个内参基因时,目的基因的ct值怎么算
如何通过荧光定量目的基因和GAPDH计算相对表达量
内参就是一个表达量在各个组基本保持不变的基因，又叫看家基因，比如常用的GAPDH， actin。或者18s rRNA也可以。
如果内参表达量一致，说明你PCR的上样量一致，样本的质量也一致。如果出入很大，说明你的样本的浓度或者是质量有问题。测到的目的基因的表达量就不可靠了
管家基因是用来定量的。用来计算相对表达量。管家基因在相同量样品中的表达量我们认为是一致的。然后根据这个量来计算你的基因在不同样品中的表达量。所以每一个都需要单独的样品。基因组干扰需要你在提取RNA以后用DNase处理样品。如果不放心，可以拿处理过的RNA做膜版，跑一次，如果有带就是有污染，如果没有可以合成cDNA库了。
⑼ 基因分析的方法
高等真核生物的基因组一般具有80 000～100 000个基因，而每一个细胞大约只表达其中的15%〔1〕。基因在不同细胞间及不同生长阶段的选择性表达决定了生命活动的多样性，如发育与分化、衰老与死亡、内环境稳定、细胞周期调控等。比较细胞间基因表达的差异为我们揭示生命活动的规律提供了依据。
由于真核细胞 mRNA 3′端一般含有 poly（ a）尾，因此现有的方法基本上都是利用共同引物将不同的 mRNA反转录成 cDNA，以 cDNA为对象研究基因表达的差异。1992年 Liang等〔2〕建立了一种差异显示反转录 pCR法（ differential display reverse transcription PCR， dDRT-PCR），为检测成批基因表达的差异开辟了新天地。迄今为止已出现了大量应用该技术的研究报道〔3，4〕。然而，尽管应用 dDRT-PCR方法已经取得了不少成果，而且该方法还在不断改进之中，但它仍然存在几个难以解决的问题：(1)重复率低，至少有20%的差异条带不能被准确重复〔5〕；(2)假阳性率可以高达90%〔6〕；(3)获得的差异表达序列极少包含编码信息。近年来，针对 dDRT-PCR方法的不足，又有几种新的检测差异表达基因的方法出现，现仅就这方面的进展做一简要介绍。
1.基因表达指纹（ gene expression fingerprinting， gEF）： gEF技术使用生物素标记的引物 bio-T13合成 cDNA第一链，用 dGTP对其进行末端加尾，再以富含 c的引物引发合成 cDNA第二链。用限制性内切酶消化双链 cDNA，以交联有抗生物素蛋白的微球捕获 cDNA3′端，以 t4DNA连接酶连接同前述内切酶相对应的适配子，并以 bio-T13及适配子中的序列作为新的引物进行特异的 pCR扩增，得到大量的特异 cDNA片段。适配子末端被32P-dATP标记后，固定于微球上的 cDNA片段经过一系列酶切，产生的酶切片段从微球表面释放出来，其中那些含有标记末端的片段经凝胶电泳后构成 mRNA指纹图谱。通过分析不同细胞间的指纹图谱就能得到差异表达的序列〔7〕。 gEF技术所需的工作量较 dDRT-PCR明显减少，由于用酶切反应替代了条件不严格的 pCR反应，其重复性也较好，假阳性率低，并且所获得的片段中包含有一定的编码信息。 gEF技术最大的缺点在于电泳技术的局限。由于它的指纹图谱要显示在同一块电泳胶上，经过几轮酶切之后常会得到1 000～2 000条电泳带，而现有的 pAGE电泳很少能分辨超过400条带，故只有15%～30%的 mRNA能够被辨认出来，因此得到的只能是高表达基因。如果希望寻找部分新基因，这是一种比较简单有效的方法；如果希望得到有关某种细胞的基因表达谱，可能比较困难；采用双向电泳技术可能会有所帮助〔8〕。
2．基因表达系统分析（ serial analysis of gene expression， sAGE）： sAGE法的建立基于两条理论。首先，一段来自某个转录子确定位置的核苷酸，其长度只要有9～10个 bp，就能够特异地确认该转录子。第二，对短片段标签的链接有利于在同一克隆中对多个标签测序。 sAGE也是用生物素标记的 bio-Oligo(dT)为引物合成双链 cDNA，然后以限制酶（锚定酶）进行酶切，捕获 cDNA3′端。在此处产物被分为两部分，分别与包含有 iIS型内切酶（标签酶）位点的 a、 b连接子相接。 iIS型内切酶的特点是作用位点处于识别位点之外。这样经过酶切，就有可能得到只有9～10bp的标签序列。每两个标签的钝端结合后成为 pCR的模板，以基于 a、 b连接子的引物进行 pCR反应的结果是得到了大量每条包含两个不同来源标签的序列，接下来再用锚定酶酶切、连接，就能将多个不同的标签链接在一起（大约为每条包含数十个不同来源的标签），克隆至质粒载体中后集中测序〔9，10〕。 sAGE的最终结果是通过计算机统计得到的，根据某个标签出现频率的高低来判断并计算其所属基因表达的丰度。对于在数据库中找不到对应序列的标签，还可以利用13bp的寡核苷酸探针（9bp加上锚定酶识别位点的4bp）对 cDNA文库进行筛选，以寻找新基因。 sAGE可以检测不同细胞间已知基因表达的具体差异，精确到每个细胞中大约有多少拷贝，可以建立较全面的基因表达谱，系统地分析基因表达的差异。它的缺点在于工作量非常大，有大量的测序及计算机分析任务；而且，对于寻找新基因而言，仅用长度为13bp的寡核苷酸探针筛选 cDNA文库是很不严格的，根据我们的经验，往往是假阳性结果居多。
3 . cDNA3′端限制酶切片段显示（ display of 3′ end restriction fragments of cDNAs）:cDNA3′端 rFD利用带有“踵”结构的锚定 oligo(dT)引物合成 cDNA第一链，以 okayama和 berg的置换法合成 cDNA第二链，然后将双链 cDNA以限制酶消化。本方法的适配子由 a1和 a2两条寡核苷酸构成，其序列与所用限制酶识别位点相符合，先将 a2的5′端磷酸化，再加入 a1退火，就会形成一个 y型结构；把 y型适配子与酶切后的 cDNA片段相连接，以适配子及锚定引物中所含序列为特异引物进行 pCR反应，则只有 cDNA3′末端的一段被扩增出来，这时的产物可用凝胶电泳表示出来构成差异表达图谱。对于每次切割6bp的限制酶来说，每种大概只能切割8%的 cDNA，因此至少需要12种以上的限制酶才能使所有 cDNA都显示出来〔11〕。 cDNA3′端 rFD与 gEF的思路比较相似，由于它利用多种限制酶进行酶切，因此不会象 gEF因凝胶电泳分辨率不够而漏掉信息。它的重复性较好，假阳性率低，尤其是对于已知基因，可以根据选择内切酶的作用位点确定该基因在凝胶电泳中的位置并判断其含量，从而避免了进一步的分析。对于精力有限的研究人员，这可能是个值得一试的方法。 cDNA3′端 rFD方法也存在一些和 dDRT-PCR相类似的缺点，它得到的片段中包含的编码信息比较少，需要多花一些时间对所得到的差异条带进一步分析。
4.分子指数的 rNA指纹（ rNA fingerprinting by molecular indexing， mI）:MI是一种能够较好地显示 mRNA中编码序列的方法。它利用Ⅱ s型内切酶的作用位点在识别位点之外可以形成一个4bp的突出端的特点，设计43共64种（最外侧一个核苷酸随机）适配子，使得获取编码序列片段成为可能。首先是以常规方法合成双链 cDNA，用Ⅱ类限制酶进行酶切后连接5′端磷酸化的相应适配子，再以Ⅱ s类
⑽ 什么是realtime PCR，什么是q-pcr，所用反应物质与普通PCR有何不同
实时定量pcr
(real-time
quantitative
pcr),简称real-time
pcr，q-pcr，q-rt-pcr等等，都是一个意思。普通pcr结果反映的其实是pcr的结果，而当pcr经过多伦循环到平台期后，很难反映原来模板的浓度；而实时定量pcr
反映的是pcr的过程，它起飞时间的ct值可以精确反映模板的浓度。定义，操作，原理什么的我就不说了，自己查网络和文库，我就从实战给你点注意事项吧。
1
选好内参基因，特别是同一物种不同组织中某基因的表达情况，一定要别人报道过在你检测的组织中变化不大，如果你只是拿一个别的物种中的同源基因，别人肯定会argue你的，如果有可能可以双内参。
2
最好有标准曲线，标曲反应扩增效率，这样比较准确点，不然只能用2
delta
delta
t法了，有些杂志扣的话，不太好解释。标曲可以用cdna来制备，还可以直接有已知模板来制（可以搜一下网上的标曲制备方法）
3
结果先看融解曲线，如果只有特异的单一融解峰，再去分析数据，不然没有意义。