抗生素分析方法

Ⅰ 抗生素检测的主要方法

由于抗生素在废水中的浓度相对较低，所以抗生素的检测一般都是微量或是痕量分析，常采用具有高灵敏度的仪器进行检测。各研究机构对畜禽废水中抗生素的检测技术主要有色谱法和其联用技术、酶免疫分析法、毛细管电泳法等。 液相色谱法（LC）在废水抗生素的检测中是最常见的，LC具有分离效能好，检测速度快且重现性好的特点。LC法所用的检测器有紫外检测器(UV)，荧光检测器，以及二级管阵列检测器。
高效液相色谱-紫外检测器
高效液相色谱-紫外检测器联用检测技术是最早用于环境中抗生素的分离检测，由于其操作简便以及成本低，被用于畜禽废水中抗生素的检测。
液相色谱-荧光检测器
液相色谱-荧光检测器因为其检测限低所以也被用于畜禽废水中抗生素的检测，通常对本身具有荧光性的抗生素液相色谱-荧光检测器可以直接检测出，但是对于本身不具有荧光性或荧光性差的抗生素，需要对其衍生化来提高目标物的荧光特性以便检测。
液相色谱串联质谱技术
色谱可以用于多组分混合物的分离和分析，可以对有机化合物进行定量分析，但是定性较困难，质谱仪能够对单一组分提供高灵敏度和特征的质谱图，但对复杂化合物无分析能力。所以将色谱与质谱进行联用（或是串联质谱），对复杂化合物中微量和痕量组分的定性和定量分析具有重要的意义。
由于畜禽废水中有多种类的抗生素同时存在，利用色谱和质谱的联用技术可以提高抗生素的定性、定量分析的可靠性、准确性、灵敏度。 酶免疫分析方法具有操作简单，前处理简化，分析成本低、灵敏、特异性强、检测快速，不需要昂贵的仪器等，而且可以同时测定几个样品，但是酶免疫分析方法对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分，对结构类似的化合物有一定程度的交叉，分析分子量很小的化合物和不稳定的化合物有一定的困难。
用酶免疫分析方法试剂盒检测地表水、地下水中的四环素和泰勒菌素，检测分别为0.05μg/L,0.1μg/L。其结果表明，该方法成本低、检测快，可用于水中的四环素、氯四环素、泰勒菌素的初筛检测。 经典的放射免疫测定基本原理和酶免疫分析是相同的，但所不同的是反应的放大指示系统不是酶和底物，而是放射性同位素。用于抗原或抗体标记的同位素通常是放射性较小的β放射原，最常用的是同位素是3H和14C，放射性不强、用量也极微小，比较安全。

Ⅱ 求用高效液相色谱法测河流中抗生素的步骤

就是首先用现成药品确定一个合适的分离条件，如溶剂，进样量等等，测好保留值用于定性。测好工作曲线用于定量。
然后取水样，用上面的条件测定，如果感觉浓度不够可以用固相萃取法富集一下。
测出大致浓度后，用标准样配制与自然水样浓度相近的溶液，进行测回收率的实验。
测出回收率之后才能计算真正的天然水样抗生素浓度。
至于具体步骤很复杂，没有3个月做不完，没有10页纸恐怕也没办法写详细。楼主自己找一本色谱方面的教材来看吧，或者上网找安捷伦的培训ppt也可以。

Ⅲ 生物学法和物理化学法测定抗生素药物的含量有哪些优缺点

药物的含量测定药物的含量测定化学、物理学、生物学、微生物学方法基础基础在规定条件下选用适当微生物测定某物质含量的方法。被测定的物质可以是某些生物生长所必需的维生素、氨基酸等,也可以是抑制某些微生物生长的抗生素、农药等。常使用的有液体稀释法和固体平板扩散法。在规定条件下选用适当微生物测定某物质含量的方法。被测定的物质可以是某些生物生长所必需的维生素、氨基酸等,也可以是抑制某些微生物生长的抗生素、农药等。常使用的有液体稀释法和固体平板扩散法。利用某些生物对某些物质如维生素、氨基酸)的特殊需要,或对某些物质如激素、抗生素、药物等)的特殊反应来定性、定量测定这些物质的方法。化学反应如UV光吸收特性、panyLogo.前言药物的含量测定药物的含量测定基于化学或物理学原理的含量测定。分两类分两类基于生物学原理的效价测定。基础基础生物检定法,微生物检定法,酶法。目标目标本章的目标:含量测定。P40:效价测定方法:凡以生物学方法或者酶学方法对药品中的特定成分以标准品为对照,作量反应平行线测定方法进行的生物活性(活力)测定量反应平行线测定方法:同时测定供试品和标准品的剂量反应曲线,且两条反应线必须具有平行性,即供试品和标准品的活性只有量的区别,panyLogo.前言药物的含量测定药物的含量测定容量分析法三种分析方法三种分析方法光谱分析法色谱分析法特点特点操作简单、结果准确,耐用性高,但专属性差特点特点特点特点简便快速、灵敏度高,有一定的准确度,但专属性稍差灵敏度与专属性都高,有一定的准确度,但结果需要对照品适用于准确度与精确度要求较高的样品测定适用于灵敏度要求较高,panyLogo.第一节定量分析方法的分类与特点容量分析法容量分析法定义定义将已知浓度的滴定液(标准物质溶液),由滴定管滴加到被测药物的溶液中,直至滴定液与被测药物反应完全(通过适当的方法指示),然后根据滴定液消耗的浓度和被消耗的体积,按化学计量关系式计算出被测药物的含量。亦称亦称滴定法滴定法通过指示剂颜色变化,或者电子设备的电位或电流突变来指示滴定终点滴定终点和计量点不一致,就会引入滴定误差,应该尽量避免。特点特点适用范围适用范围1、方法简便易行:所用仪器价廉易得,操作简便快速广泛应用于化学原料的测定,较少应用于药物制剂的测定2、方法耐用性高:影响测定的试验条件与环境因素少3、测定结果准确:误差低于0.2%,满足准确度高样品4、方法专属性差:对相近杂质干扰缺少选择,panyLogo.第一节定量分析方法的分类与特点容量分析法有关计算容量分析法有关计算滴定度滴定度每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物质量。

Ⅳ 什么方法能检测出牛奶中抗生素的具体含量

牛奶中抗生素残留的几种常用检测方法
随着奶牛饲养业的发展，抗生素在预防和治疗奶牛疾病方面得到广泛的应用。生鲜牛奶中抗生素的来源主要是：第一，治疗泌乳期病牛时使用的抗生素会从奶牛体内移行到乳腺残留进入牛奶中，资料表明治疗后的奶牛，其挤出的牛奶5天内都有抗生素残留；其二，为了预防奶牛疾病并提高产量，在奶牛饲料中添加抗生素也会造成牛奶中抗生素的残留；第三，由于牧场管理不善，挤奶、储奶没有严格的卫生制度和配套的设施，人为添加或造成牛奶抗生素的污染。
牛奶中含有抗生素，不仅对人的健康造成很大的危害，而且对乳品加工企业带来经济损失（因无法生成酸奶和奶酪）。因此必须严格控制牛奶中抗生素残留，除了要做好科学饲养、精心管理；正确挤奶和预防疾病外，还要规范抗生素的使用，按国标中有关规定，用药后的奶牛5天后所产的牛奶才可作为原料乳，并且要检测其残留。世界粮农组织（FAO）、世界卫生组织（WHO）、欧盟（EC）及美国的食品和药品管理局（FDA）等对食品中抗生素最大残留量都有明确的规定，我国也有鲜奶中抗生素残留量检验标准（GB4689.27—94）。
目前，鲜奶中抗生素残留的检测方法大致分为三类：生物测定法（微生物测定法、放射受体测定法）、免疫法（放射免疫法、荧光免疫法、酶联免疫法）、理化分析法（波谱法、色谱及联用技术）。下面介绍几种常用的牛奶中抗生素残留检测方法。
TTC法
TTC法是我国鲜奶中抗生素残留量检验标准（GB4689.27—94）的检测法，属生物检测法。其测定原理基于抗生素对微生物的抑制作用。如果牛奶中含有抗生素，则加入菌种（嗜热链球菌）经培育2.5~3小时后,加入TTC指示剂(三苯基四氮唑)不发生还原反应,所以样品呈无色状态;如果牛奶中不含抗生素,则样品呈红色.这样实验后样品颜色不变的为阳性,样品染成红色的为阴性。
TTC法的具体操作步骤:
1.菌液制备:将单菌种(嗜热链球菌)以脱脂乳为培养基,在36±1℃培养箱中培养15小时后,再以脱脂乳以至于1:1稀释待用;
2.取待检样液9mL,在80℃水浴加热5分钟后冷却到37℃以下,加活菌液1mL,在36℃±1℃水浴2小时,加入4%的TTC指示剂0.3mL, 36℃±1℃水浴培养30分钟;
3.若样液颜色不变为阳性,呈红色为阴性;若阳性的样液,再置于水浴中培养30分钟,不显色的为阳性,呈红色为阴性.
TTC法测定各种抗生素的灵敏度为:青霉素:4ppb,链霉素:500ppb,庆大霉素:400ppb,卡那霉素:5000ppb.它具有费用低,易开展的优点;缺点是耗时长，要求操作人员需有一定专业知识且实验过程中菌液的制备、水浴过程控制都要求严格遵守操作规程，否则易出现假阳性，以致出现检验结果的不稳定性。
Delvotest? sp法（戴尔沃检测法）
该法最早在香港传到广东的，其使用是基于20世纪80年代初香港要求广东出口的生奶必须“无抗”且要求采用Delvotest法检测。该方法也是生物测定法，其试剂是由荷兰DSM公司生产并由AOAC认证。原理是利用微生物—嗜热芽胞菌在64℃条件下培养2.5～3小时后会产酸,酸引起指示剂BCP(溴甲酚紫)变为黄色;若牛奶样品中不含抗生素,培养后样品呈黄色,如样品中含有抗生素, 嗜热芽胞菌生长受到抑制而无法产酸,指示剂将不变色.
Delvotest? sp 法的操作步骤:
1.以无菌操作将一片营养药片夹放入小试管内;
2.用微量移液管将0.1mL牛奶样品注入小试管内;
3.把小试管放入已预热至64℃的水浴箱或恒温器中培养;
4).定时3小时取出观察颜色变化.如果底部2/3的固体介质是黄色,则为阴性, 如果底部2/3的固体介质是紫色,则为阳性.
Delvotest? sp 法具有广谱性,可检测到?-内酰胺类抗生素在内的更多抗生素,如磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类、氯霉素等，其中对青霉素和磺胺类抗生素特别灵敏. 其灵敏度为：青霉素:3ppb,链霉素:300ppb,庆大霉素:400ppb,卡那霉素:2500ppb。Delvotest? sp 法集操作方便，严格实用，容易判断，结果可靠，费用适中等优点；但也易出现假阳性，实验证明：当牛奶样品中添加微生物防腐剂（如乳酸链球菌素—Nisn）或样品中有足够的洗涤剂残留时，便可影响嗜热芽胞菌生长而使实验为阳性。
Snap?法
该方法是酶联免疫法，由美国IDEXX公司生产其检测分析仪及其试剂盒，均获得AOAC认证，它利用了竟争酶联免疫技术。其基本原理是用特异性抗体将固相载体激活，加入含待测抗原的溶液和一定量的酶标记抗原在45℃±5℃共同保温，使样品内的抗生素与内置抗生素标志物竟争与固定的抗体结合，然后进行洗涤和显色，内置抗生素标志物与固定的抗体结合形成的复合体，通过酶的作用分解可形成有色物质，通过测定色度并与参照物对照，就可以确定结果是阳性或阴性。
Snap?法操作步骤：
1.加入乳样于样品管中,摇匀,加热样品和检测板5分钟;
2.加入乳样于样品孔中,当激活圆环开始退却时,按Snap键;
3.反应4分钟,由Snap?读数仪读取并打印结果.检测读数小于1.05时判为阴性,大于1.05时判为阳性.
Snap?法是一种将酶化学反应的敏感性和抗原抗体免疫反应的特异性相结合的方法,其敏感性和特异性好,检测的灵敏度以普遍使用的?-内酰胺类计：青霉素:5ppb,阿莫西林:10ppb,氨苄西林:10ppb,头孢西林:8ppb.其他抗生素如四环素等的检测,则需购买相应的试剂来检测. Snap?法检测结果快速准确, 9分钟内即可检测出牛奶中?-内酰胺类、四环素类、磺胺类等抗生素的残留含量，且有半定量的读数，可监控牧场用药的情况；检测仪器稳定性良好，结果重现性高，整个检测过程简单方便；但需购置专用仪器和试剂，成本较高。
高效液相色谱检测法
它是一种理化检测方法,是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应来测定其含量.检测的过程采用了气相色谱理论,通过高压液相和高灵敏度的检测器,分离速度快、效率高和操作自动化。一般要经过样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤，能检测抗生素的具体含量，敏感性较高，但检测程序复杂，费用较高，需购买色谱仪等检测设备，不适合小型检验室。
传统的抗生素检测方法不少,有的操作烦琐,有的实验条件要求高,有的检验时间太长;这些不仅会给乳制品生产企业造成经济上和时间上的损失,而且检测结果常常会被原辅材料和人为操作等因素所影响.鉴于牛奶中抗生素残留是涉及人类健康的公共卫生问题,乳品企业及牧场应重视和加强检测工作,应用一些简单、快速和准确性高的方法来监控产品的质量，保证消费者的健康。
http://szddi.com/foodonline/newsdetail.asp?id=15933

反应原理
本产品主要是利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的基本原理来进行的。在整个反应当中,样品中氯霉素含量越多，反应呈色就越淡。反之，样品中氯霉素含量越少，则呈色越深。
试剂盒组成
1、微量测试孔：每条8孔，每板12条
2、氯霉素标准溶液：
0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35 ppb、4.05 ppb，1.5ml/瓶
3、10倍浓缩萃取稀释液：一瓶，30ml/瓶
4、10倍浓缩洗涤液：一瓶，30 ml /瓶
5、氯霉素酶标记物： 一瓶，8 ml/瓶
6、底物溶液：一瓶，12 ml/瓶
7、反应终止液：一瓶，13 ml/瓶
使用说明
A、注意事项
1、使用前先将氯霉素标准溶液6瓶，浓缩萃取稀释液，浓缩洗涤液，酶标记物，底物溶液及微量测试孔条置于室温下，回温30分钟。
2、原倍萃取稀释液及洗涤液配制
用蒸馏水将10倍浓缩萃取稀释液及浓缩洗涤液分别以1： 9的比例稀释(即1mL浓缩液+9mL蒸馏水)，即可作为样品萃取稀释液与微孔板清洗液。
3、回温后，取出所需微量测试孔条，将剩余板条立即放回铝箔袋中用胶带封好，置于4oC保存。
B、样品制备
1.待测物为生乳，则依以下方法进行处理 (5倍稀释)
取100ul待测生乳加入400ul萃取稀释液，振荡混合后备用。
2.待测物为蜂蜜，则依以下方法进行处理
a.取2g蜂蜜、4ml蒸馏水与2ml 乙酸乙酯置入离心管中，震荡约5分钟，使其充分混合均匀。
b.离心10分钟(3000rpm)，取0.5ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中，于50℃下氮气吹干(温度请勿超过50oC)。
c.加入0.5ml萃取稀释液，震荡约10秒钟后备用。
3. 待测物为血清、则依以下方法进行处理
a.抽取待检动物血液，离心或静置取其较透明之上层液(血清层)使用，注意不要有溶血。
b.将3ml血清加入离心管中，再加入6ml乙酸乙酯，震荡混合约30秒。
c.离心10分钟(3000rpm)，取2ml上层液(乙酸乙酯)至玻璃管中，于50oC下氮气吹干。
d.于此玻璃管中加入正己烷2ml，先将残余物完全溶解后，再加入1 ml萃取稀释液，震荡约30秒钟。
e. 离心10分钟(3000 rpm)，用吸管吸去上层液(正己烷) 及中间乳化层部分，弃掉。再吸取下层液(水层)备用。
f.若有乳化现象，请先将大部分上层液(正己烷)取出后，再将玻璃管置入80oC水中，隔水加热约5~10分钟，可改善乳化情形。
4. 待测物为鸡肉或鱼、虾，则依以下方法进行处理
a.将3克样品剪碎后放入50 ml离心管中，再加入6ml乙酸乙酯，并以均质机均质约1分钟，再震荡约30秒。
b.离心10分钟(3000rpm)，取2ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中，于50oC下氮气吹干。
c.于此玻璃管中加入正己烷2 ml，先将残余物完全溶解后(若未能完全溶解，可能会导致回收率降低)，再加入1 ml萃取稀释液，震荡约30秒钟。
d.离心10分钟(3000 rpm)，用吸管吸去上层液(正己烷) 及中间乳化层部分，弃掉。再吸取下层液(水层)备用。
e.若有乳化现象，请先将大部分上层液(正己烷)取出后，再将玻璃管置入80oC水中，隔水加热约5~10分钟，可改善乳化情形。待测物为血清、则依以下方法进行处理
5.待测物为内脏(肝、心等)，则依以下方法进行处理(5倍稀释)
同上述步骤a~d，但下层液吸出后，再以萃取稀释液稀释5倍(即下层液50ul加萃取稀释液200ml)。
6.待测物为饲料，则依以下方法进行处理(10倍稀释)
同上述步骤a~d，但下层液吸出后，再以萃取稀释液稀释10倍(即下层液30ul加萃取稀释液270ml)。
C、操作步骤
本产品的酶标记物与氯霉素标准溶液均直接使用，无需再稀释。
1、于适当微孔中分别加入100mL标准溶液(0,0.05,0.15,0.45,1.35和4.05ppb)。
2、在另外的微孔中加入100mL 已完成前处理的样品溶液。
3、再于每一微孔中另再加入50mL酶标记物。
4、轻敲盘子四周，使其充分混合后于室温下避光静置温育1小时。
5、将微孔中的反应液甩掉，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复洗3次。
6、最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。
7、于每一微孔中加入底物溶液100mL后，轻敲盘子四周，使其充分混合。
8、于室温下避光静置温育20分钟。
9、于每一微孔中加入100mL反应终止液。
10、用酶标仪于波长450nm下判读。
D、判定
1. 计算B/B0值。用样品或标准液吸光度值(B)除以零标准吸光度值(B0)再乘以100%。
2. 以B/B0值为纵坐标，以标样浓度的对数值为横坐标，做标准半对数曲线。
3. 根据每个样品的B/B0值就可从曲线上读出相对应样品的浓度。
4. 由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。
E、标准曲线

F、灵敏度
氯霉素试剂检测盒的平均检测下限为 0.05ppb，此浓度之吸光值与阴性标准溶液(0ppb)之吸光值有明显的差异。
G、 特异性
针对以下抗生素进行交叉反应之测试，结果如下：
Chloramphenicol =100%
Chloramphenicol(free base) <0.1%
Gentamycin <0.1%
Tetracycline <0.1%
Penicillin G <0.1%
Sulfamethazine <0.1%
H、再现性
针对氯霉素检测试剂盒精密度测试，重复6次，所得不同浓度标准溶液的吸光值变异系数(%CV)如图2所示，显示氯霉素试剂盒有很高的再现性:

I、回收率
生乳(添加1.0ppb)104~117%
蜂蜜(添加0.3ppb)90~110%
虾及鱼肉(添加0.5ppb)95~110%
鸡肉(添加0.5ppb) 90~120%
血清(添加0.5ppb)100~120%
内脏(添加1.0ppb) 100~120%
饲料(添加2.0ppb)80~110%

氯霉素检测试剂盒
简介
氯霉素(Chloramphenicol)是一种广谱抗生素。由于其具有效果好以及价格低廉等优点，目前已被普遍应用于各类家禽、家畜、水产品及蜂制品的各种传染性疾病的治疗。然而氯霉素有其严重的副作用,它会抑制人体骨髓的造血功能，从而引起再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症。目前，我国已禁止其使用。
我公司采用国内外先进的工艺与技术，研发出氯霉素ELISA检测试剂盒，简化了样品处理方式，使用简便，省时省力省钱，整个操作过程不到90分钟。本产品检测范围广(鸡肉、鱼、虾、蟹、牛奶、血清、肌肉、组织、饲料与蜂蜜等)，回收率为80%－120%，灵敏度可达到0.05ppb，是各类企业及各级政府检测机构的理想产品。
简单
1． 样品提取方便快捷。
2． 90分钟得到结果。
3． 只需基本的实验室设备。
4． 操作人员只需最基本的实验知识。
准确
1． 结果重现性高。
2． 精确至0.05ppb。
3． 与其它抗体的交叉反应率极低。
技术支持
我们为用户提供最方便、快捷、周到的服务。
产品规格
包装：每包96孔
灵敏度: 0.05ppb
测试区间：0.05ppb－4.05ppb
检测时间：80分钟(提取后)
储存条件：2-8℃

Ⅳ 抗生素微生物检定法二剂量法结果如何分析，如图

二剂量管碟法是目前抗生素微生物检定最常用的检验方法。其抗生素效价结果判定最主要的数据是抑菌圈的大小和清晰程度。实验中发现菌液的浓度、菌种的形态和活性、菌龄等对抑菌圈状态的影响很大,本文对常用实验菌种的培养进行了研究。

Ⅵ MIC的几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）方法

1.1.常量肉汤稀释法
1.1.1.抗菌药物贮存液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/mg）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
1.1.3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
1.1.4.接种物的制备 有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。
1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。
1.1.6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20~24h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h。
1.1.7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。
根据NCCLS推荐的分界点值标准，判断耐药（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被测菌株所引起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有效，禁忌症除外。R指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所达到的浓度所抑制，或属于具有特定耐药机理（如β-内酰胺酶），所以临床治疗效果不佳。I是指MIC接近药物的血液或组织液浓度，疗效低于敏感菌。还表示被测菌株可以通过提高剂量（如β-内酰胺类药物）被抑制，或在药物生理性浓集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介还作为“缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控，所导致较大的错误解释。
1.2.微量肉汤稀释法
1.2.1.抗菌药物和培养基制备 同常量肉汤稀释法。
1.2.2.MIC板制备 无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，第12孔不加药作为生长对照，冰冻干燥后密封，-20℃以下保存备用。
1.2.3.接种物制备 将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经MH肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空气孵箱中，孵育16~20h判断结果。当试验嗜血杆菌属，链球菌属时，孵育时间为20~24h，试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验时孵育时间必须满24h。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。
1.2.4.结果判断 以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔（即不含抗生素）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。通常对革兰阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的MIC与常量肉汤稀释法测得的结果相同或低一个稀释度（1孔或2倍）。
2.琼脂稀释法 琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。
2.1.培养基制备 使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。
2.2.含药琼脂平板制备 根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。
2.3.接种物制备与接种 制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm的菌斑。接种好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。
2.4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。
3.E试验（E-test） E试验是指浓度梯度琼脂扩散试验，其原理基本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料试条中向琼脂中扩散，在试条周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。E试验综合了稀释法和扩散法的原理和特点，同时还弥补了二者的一些不足，可以像稀释法一样直接定量测出抗菌药物对受试菌的MIC。
3.1.培养基、菌液制备和接种 同纸片扩散法。
3.2.贴E试验条 同纸片扩散法，E试验条的刻度面朝上，不得贴反，一旦接触琼脂后不得再移动。直径150mm的平皿内可放置6根E试验试条，90mm者一般只能放置1根。
3.3.孵育时间和温度 同纸片扩散法。
3.4.结果阅读 孵育后围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈，在抑菌圈和试条的横切相交处试条上的读数刻度即是测定抗菌药物对受试菌的MIC。阅读时应注意的问题见供应商的产品说明书。

Ⅶ 根据检测原理不同,食品中抗生素残留的检测方法可分为哪几种

分为四种：酶抑制率法 分光光度法 胶体金法 滴定分析法

酶抑制率法

在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

分光光度法

不同的物质由于其分子结构不同，对不同波长光的吸收能力也不同，因此具有其特有的吸收光谱。即使是相同的物质由于其含量不同，对光的吸收程度也不同。标准曲线法就是利用这一特性来测定物质含量，先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测定出它们的A值，以A值为横坐标，浓度为纵坐标，作标准曲线。在测定待测溶液时，操作条件应与制作标准曲线时相同，以待测液的A值从标准曲线上查出该样品的相应浓度。

胶体金法

将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，产生显色反应。当光源照射到检测带，反射光被收集并转化为电信号，根据信号的强弱即可判断被测物质的阴阳性。

滴定分析法

滴定分析法是将一种已知准确浓度的试剂溶液，滴加到被测物质的溶液中，直到所加的试剂与被测物质按化学计量定量反应为止，根据试剂溶液的浓度和消耗的体积，计算被测物质的含量。