实时荧光定量pcr常见数据分析方法

‘壹’ 实时荧光定量PCR的结果该怎样分析

1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算；

2、一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算；

3、引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；

4、模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；

5、看CT值是分析荧光定量PCR最直观的一个数据，CT值一般在35左右就失去参考价值了，平时我们实验室用BIODAI-PCR荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右。

(1)实时荧光定量pcr常见数据分析方法扩展阅读：

PVR的循环参数：

1、预变性；

模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，加热时间参考试剂说明书。

2、变性步骤；

循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

3、引物退火；

退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4、引物延伸；

引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

5、循环数；

大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。

6、最后延伸；

在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

‘贰’ 实时定量PCR的结果是怎样分析的

1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算。

2、一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算。

3、举例如下：对照组基因A的CT值为20， 内参（比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。

4、首先算加样量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。

5、几点注意：必须确定扩增的特异性，只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同），2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2，最好不用Syber Green。

(2)实时荧光定量pcr常见数据分析方法扩展阅读：

PCR原理：

1、PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

2、PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

参考资料来源：网络--PCR反应

‘叁’ 实时定量PCR的结果分析

如果有标准曲线，按照标准曲线计算。一般都是相对量。则用delta delta CT方法来计算。举例如下：对照组基因A的CT值为20， 内参（比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。首先算加样量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。几点注意： 1。必须确定扩增的特异性 2。 只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同） 3。 2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2。 4。 最好不用Syber Green

‘肆’ 实时定量PCR的结果是怎样分析的

的 探讨实时荧光定量PCR不同结果分析模式对检测结果的影响。方法 用Line—Gene FQD-33A型荧光定量PCR检测系统检测本院门诊和病房乙肝病人血清HBV DNA77份，分别用最大二阶导数法和样点拟合法进行结果分析。结果 发现两种分析方法的总体相关性较好(r=0．978)。但HBV DNA拷贝数含量<10^5时，两种模式的相关性差(r=0．706)，此时，最大二阶导数法得出的数值要比样点拟合法低(t=2．61，P<0．05)，且易出现假阴性结果。结论 虽然样点拟合法步骤较多，但其结果更可靠，因此进行结果分析时，建议使用样点拟合法。而且当样本中HBV DNA拷贝数<10^5时只能使用样点拟合法进行结果分析。

‘伍’ 荧光定量pcr常用的是什么方法

荧光定量pcr常用的是什么方法
用已知浓度的DNA样本（通常是质粒）梯度稀释成一系列的样本。做实验的时候，这些标准品和待测样本加在同样一块96孔盘的不同孔内。一起做PCR。

标准品的荧光强度和已知的浓度作图，可以得到一条标准曲线。而待测样本的荧光强度测出以后，就可以在标准曲线上算出样本浓度了。

‘陆’ 您好，我想问一下实时荧光定量pcr的数据分析！

用2-△△ ct法算的话，应如何算？

假设检测A基因，CT分别为（这里记住CT越大，表明相对含量越低）
普通组/Test1：28
实验组1/Test2：29
实验组2/Test3：30
这时候要设对照了，假设Test1为对照组（普通组），当然是以普通组为对照
那么，相对含量为：
普通组/Test1：1
实验组1/Test2：2^-(28-29)=1/2=0.5
实验组2/Test3：2^-(28-30)=1/4=0.25

A基因在实验组1和实验组2中的表达量，分别下降2倍和4倍！

所以，就出来啦，结果

对于每组不同部位的比较的话，将其中一个处理为1进行比较吗？
如
实验组1
Testis
Brain
Liver
Muscle
可以把任何一个作为1，作为对照，但是要在figure 的legend中注明出来，说清楚就好了！

那对于三个组中的同一部位的比较的话，难道也要将其中一组处理为1吗？

是的，可以，如
Brain
普通组/Test1
实验组1/Test2
实验组2/Test3

就以普通组/Test1，为对照组，设为1，其他为相对含量，也要在figure 的legend中注明出来说清楚！

‘柒’ 荧光定量pcr数据分析的方法有几种

公式如上所列，仅供参考

‘捌’ 绝对荧光定量PCR的数据分析

现在最常用的两种分析实时定量PCR
实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量PCR
实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量
PCR
数据分析中可能会被用到。
希望对您有所帮助